Evaluatie van de oraal toegediende calciumalginaat-aerogel op de veranderingen van darmmicrobiota en lever- en nierfunctie van Wistar-ratten

Contactpersoon:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar et al

Abstract

De huidige studie evalueert het effect van calciumalginaat-aerogel als een potentiële geneesmiddeldrager, op de lever ennierfuncties, en op de darmflora van Wistar-ratten. De studies alginaataerogel werden bereid in de vorm van nanodeeltjes met behulp van de jetcutting-techniek, en ze werden gekarakteriseerd in termen van specifieke oppervlakten, buitenste morfologie en deeltjesgrootteverdeling. Voor het in vivo onderzoek werd calciumalginaat-aerogel oraal toegediend en lever- ennierfunctieswerden gedurende één week en gedurende vier weken getest in twee verschillende onderzoeken. Tijdens het korte in vivo onderzoek werden fecesmonsters verzameld voor bacteriële DNA-extractie, gevolgd door 16S rRNA-gensequentieanalyses om veranderingen in de darmmicrobiota te detecteren. De resultaten toonden aan dat de bereide alginaataerogel een gemiddeld BET-specifiek oppervlak heeft van ongeveer 540 m2/g, met een porievolume van 7,4 cc/g en een poriebreedte van 30-50 nm. Uit de in vivo studie bleek dat de niveaus van de bestudeerdenieren leverenzymen overschreden het hoogste niveau van het normale bereik niet. De studie van de darmflora toonde verschillende patronen; bepaalde groepen bacteriën, zoals Clostridia en Bacteriodia, namen toe tijdens deaerogelsregime en bleef toenemen nadat de aerogel was gestopt. Terwijl andere groepen, zoals Erysipelotrichia en Candidatus Sacha-bacteriën, toenamen tijdensaerogelsbehandeling en nam na een maand weer af. Leden van de Bacilli-klasse vertoonden een unieke trend, dat wil zeggen dat, nadat ze de meest voorkomende groep waren (63 procent) op het moment 0, hun relatieve overvloed dramatisch afnam totdat het < 5="" procent="" bereikte;="" wat="" ook="" het="" geval="" was="" na="" het="" stoppen="" van="" de="">

Cistanchetubulosa voorkomtnierziekte, cistanche bijwerkingen, klik op.

Invoering

Aerogelsterminologie werd voor het eerst in 1931 naar voren gebracht door Samuel Kistler, die ze definieerde als de materialen die hun porie- en netwerkstructuur intact hielden bij het uitwisselen van hun porievloeistof met gas [1]. Na 60 jaar van hun ontdekking, biologischaerogelswerden voorgesteld voor biomedische en medicijnafgiftetoepassingen vanwege hun grote binnenoppervlak en open poriënstructuur [2]. De uitstekende eigenschappen van deze materiaalklasse maken het niet alleen mogelijk om de laadefficiëntie te verhogen, maar ook om de biologische beschikbaarheid, stabiliteit en afgiftekinetiek van de geladen moleculen te verbeteren

Onderzoek naaraerogelsvoor orale toediening van geneesmiddelen aanvankelijk gericht op het gebruik van silicaaerogelsvanwege hun flexibele en bekende sol-gel-chemie, evenals de mogelijkheden van derivatisering [3]. Desalniettemin geeft het gebruik van silica-aerogels in farmaceutische formuleringen die zijn ontworpen voor orale toediening nog steeds bepaalde zorgen vanwege hun beperkte biologische afbreekbaarheid. Daarom ontstaat er een verdere behoefte om een ​​aerogeldrager te ontwikkelen die zowel biologisch verenigbaar als biologisch afbreekbaar is. Dit kan mogelijk zijn door gebruik te maken van natuurlijke organische materialen of biologisch afbreekbare polymeren, zoals alginaat [4] hyaluronzuur [5], chitosan, cellulose [6] en eiwitten [7].

Alginaat (Alg), gewonnen uit bruine algen, is een lineair copolymeer dat is samengesteld uit ß-1,4-D-mannuronzuur en -L-guluronzuurmonomeren, die homogene of heterogene blokachtige patronen zijn afgewisseld . Alginaten zijn gebruikt in de voedings- en farmaceutische industrie omdat het niet-toxisch, goedkoop, biologisch afbreekbaar en biocompatibel is [8, 9]. Polyvalente kationen, zoals Ca2 plus, Ba2 plus of Sr2 plus, kunnen ionische verknoping van Alg induceren, waardoor het wordt getransformeerd van een oplosbare naar een onoplosbare (gel) vorm.

Alg wordt veel gebruikt in voedingsproducten en als farmaceutisch additief, zoals een geleermiddel en een tabletdesintegratiemiddel [10, 11]. Het is ook gebruikt in biomedische toepassingen, waaronder medicijnafgifte en weefselmanipulatie [12]. Net als andere eetbare voedingsvezels zijn Alg en zijn oligomeerderivaten resistent tegen vertering door menselijke endogene enzymen. Het kan echter aanzienlijk worden verteerd door de menselijke darmflora [13]. Ondanks het belang ervan is er weinig bekend over de darmmicrobiota die verantwoordelijk is voor de afbraak van Alg.

De Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) heeft de veiligheid van alginezuur en zijn zouten, evenals hun fermentatieproducten verklaard. In-vivotests voor de absorptie en uitscheiding van waterige oplossingen en suspensies van alginezuur en zijn zouten bij dieren toonden aan dat ze niet kunnen worden geabsorbeerd of gemetaboliseerd door enzymen die aanwezig zijn in het maagdarmkanaal, ongeacht de vorm die tijdens de toediening wordt gebruikt. Ze zouden echter gedeeltelijk worden afgebroken door fermentatie tijdens hun passage door de dikke darm door de werking van de anaërobe darmmicrobiota, waardoor de blindedarmvergroting wordt veroorzaakt die door de EFSA werd beschouwd als een adaptief proces dat verband houdt met de hoge doses die als voedseladditieven zijn getest [14] . Desalniettemin heeft geen eerdere in vivo studie het effect van calciumalginaat (Ca-Alg) in de vorm van aerogel op delever nier,of de bacteriële gemeenschap in de darmen.

Darmmicrobiota is een essentieel onderdeel van het menselijke spijsverteringsstelsel, omdat ze helpen bij de afbraak van het ingenomen voedsel, vooral die waarvoor het menselijk lichaam niet over de vereiste enzymen beschikt [15, 16]. Darmmicrobiota kan ook de bloei van pathogene micro-organismen remmen door met hen te concurreren op de hulpbronnen van de voedingsstoffen, of door chemische stoffen te produceren om hun groei te remmen. Het is echter aangetoond dat de afbraak van de ingenomen verteerbare vezels, zoals Alg, voornamelijk plaatsvindt door gefermenteerde bacteriën in de dikke darm [17]. De producten van dit proces zijn vetzuren met een korte keten (SCFA), die gunstig zijn voor darmontsteking en als kankerbestrijder. Brownlee et al. rapporteerde dat de incubatie van Alg en menselijke fecale microflora aantoonde dat de meeste Alg-afbraak gepaard gaat met een verandering in de darmmicrobiota. Ook leidt een dergelijke incubatie na 24 uur tot de productie van SCFA en gas [17].

materialen en methodes

Materialen

Alginezuur-natriumzout werd geleverd door BASF, Duitsland. Calciumchloride (CaCl2) werd gekocht bij Th. Geyer GmbH & Co. KG, Duitsland. Kooldioxide (zuiverheid 99,5%) werd geleverd door Praxair (Duitsland), ethanol 99,8% werd verkregen van Carl Roth (Duitsland). Alle chemicaliën werden gebruikt zoals ontvangen. Commerciële diagnostische kits werden gebruikt om ALP te meten en creatininekits werden gekocht bij Biostsystems SA, Spanje. De PowerMax SoilDNA-isolatiekit van MO BIO is gekocht bij MO BIO Laboratories, VS. Gedeïoniseerd water werd gedurende het hele onderzoek gebruikt.

Methoden:

Bereiding van aerogeldeeltjes.

De eerste stap bij de bereiding van de aerogeldeeltjes was het bereiden van de voorraadoplossing; daarvoor werd natriumalginaatpoeder (Alg) toegevoegd aan gedestilleerd water in een concentratie van 1 gew.% en werd het een nacht bij kamertemperatuur onder magnetisch roeren gehouden. Om de hydrogeldeeltjes voor te bereiden, is de benadering beschreven door Preibisch et al. [18] werd gevolgd met behulp van Jet Cutter Type S van genia Lab, Braunschweig (Duitsland). Bij het jetcutting-proces werd de alginaatoplossing door samengeperste lucht (1-3 bar) door een mondstuk (350 m diameter) uitgestoten om een ​​straal te vormen (massastroomsnelheid van 1 g/s). De straal werd in afzonderlijke deeltjes gesneden met een roterende schijf (40 draden met een draaddiameter van 100 m van snijschijven, cilinderverhouding van 5). Na door de schijf te zijn gegaan, viel de polymeeroplossing naar beneden in het geleerbad met een CaCl2-oplossing van 5 g/L. Om agglomeratie van de geldeeltjes te voorkomen, was het volume van het geleringsbad ten minste vier keer het totale volume van de verwerkte biopolymeeroplossing en werd de inhoud van de baden geroerd met een magnetische staaf (60 rpm). De scheidingsafstand tussen het mondstuk en het geleringsbad werd op 50-70 cm gehouden. Na het verzamelen van de geldeeltjes werd het roeren gedurende 60 minuten voortgezet om volledige gelering te verzekeren en agglomeratie te vermijden. Gegeleerde deeltjes werden vervolgens door middel van filtratie van het geleerbad afgescheiden en werden voortgezet voor de oplosmiddeluitwisseling.

Oplosmiddeluitwisseling (water naar ethanol) werd stapsgewijs uitgevoerd op de verzamelde deeltjes (30,60, 90, 100 procent v/v ethanol). Om volledige uitwisseling te garanderen, werd de dichtheid van de inweekvloeistof na de laatste stap van de oplosmiddeluitwisseling gemeten met behulp van een dichtheidsmeter (DMA4500, Anton PaarCompany, Oostenrijk). De dichtheid werd vervolgens herberekend in ethanolgehalte. De resulterende alcogeldeeltjes werden uiteindelijk verpakt in een filterpapier en gedroogd met superkritisch CO2 in een autoclaaf bij een constante temperatuur van 50˚C en een druk van 120 bar. De continue stroom CO2 (20-80 g/min) werd ingesteld totdat volledige extractie van ethanol was voltooid (2-4 uur). Daarna werd een langzame drukverlaging van de autoclaaf (1-3 bar/min) uitgevoerd. Zodra de omgevingsdruk was bereikt, werd de autoclaaf geopend en werden aerogelmicrosferen van calciumalginaat (hierna aangeduid als Ca-Alg) verzameld en bewaard in goed afgesloten containers onder droge omstandigheden.

Karakterisering van aerogeldeeltjes

specifieke oppervlakten van aerogeldeeltjes werden gemeten via stikstofadsorptie/desorptie bij lage temperatuur (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Duitsland en Micromeritics TriStar II 3020, Duitsland). Voorafgaand aan de metingen werden de monsters 20 onder vacuüm gedroogd (< 1="" mpa)="" at="">

Onderzoek van de buitenste morfologie van de geprepareerde aerogeldeeltjes werd gedaan via een scanning elektronenmicroscoop (SEM) analyse (Zeiss Supra VP55, Jena, Duitsland) bij een versnellingsspanning van 3 kV en een werkafstand van 9.0– 9,4 mm. Monsters werden voorafgaand aan de beeldvorming met goud gesputterd (dikte 10 nm) om het opladen te minimaliseren en het beeldcontrast te verbeteren.

Er werden driemaal metingen van de deeltjesgrootteverdeling uitgevoerd voor elk monster bestaande uit ongeveer 10 000 deeltjes. Dynamische beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van aCamsizer XT met X-Jet-module (Retsch GmbH, Duitsland) met lucht onder druk van 50 kPa.

Onderzoek naar lever- en nierfunctie en darmmicrobiota

Er is een pilotstudie uitgevoerd bij een klein aantal dieren, verdeeld in verschillende groepen om vier dosisniveaus van behandelingsstoffen te dekken. Het werd gedurende een korte periode (1 week) uitgevoerd om de maximaal mogelijke dosis Ca-Alg-aerogels te zien die geen grote effecten heeft op de nier- of leverfuncties en die geen tekenen van morbiditeit of mortaliteit vertoont. Doses werden zorgvuldig gekozen rekening houdend met de gerapporteerde orale LD50 van alginaat (meer dan 5,000 mg/kg lichaamsgewicht) [19]. Toch was de maximaal haalbare dosis die werd bereikt met minimale agitatie van het dier 2,000mg/kg lichaamsgewicht.

In het tweede deel van het onderzoek werden de dieren gedurende twee weken blootgesteld aan een vaste dosis. Met betrekking tot leeftijds- en gewichtsvariaties en houderijomstandigheden tijdens deze studie werden de richtlijnen van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) gevolgd (code nr. 206). Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de ethische commissie (IRB, goedkeuringsnummer: 2019-PHA-12, bijgevoegd in S1-bestand) van Applied Science Private University (ASU), Jordanië. Alle medewerkers in de stal van de ASU zijn goed opgeleid om eventuele veranderingen die bij het dier kunnen optreden als gevolg van de ingreep te monitoren. Ze bewaken met name parameters zoals gewichtsveranderingen, abnormaal gedrag, gegolfde vacht, verminderde mobiliteit, lichaamshouding of expressie van specifieke lichaamsvloeistofmarkeringen. In het geval van ernstige abnormale veranderingen in de dierstatus, mogen ze het humane eindpuntprotocol gebruiken dat is goedgekeurd door de ethische commissie van ASU. Aan het einde van de experimenten werden ratten geëuthanaseerd door middel van bloeding onder algemene anesthesie met behulp van 2,5 procent thiopental-natrium (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) bij 20 mg/kg intraveneus.

Dier

In zowel korte- als langetermijn in vivo-onderzoeken werden tien weken oude, gezonde Wistar-ratten met een gemiddeld gewicht van 240 ± 37 g gehuisvest bij een temperatuur van 21-23 ˚C en een luchtvochtigheid van 35 procent -70 procent in gecontroleerde ruimtes, met cycli van 12 uur licht–12 uur donker. Ratten werden geïdentificeerd en afzonderlijk in kooien met heldere zijkanten geplaatst om ze gemakkelijk te kunnen observeren zonder hun gedrag te verstoren. Houtkrullen werden gebruikt als beddengoed. Ratten kregen een in de handel verkrijgbaar dieet (Local Sup plier, Jordanië) en vers water werd gratis aangeboden.

Het aantal ratten per groep in de verschillende experimenten werd geselecteerd op basis van het eerder gepubliceerde werk (voorbeelden; [20–22]), en afhankelijk van de strikte regelgeving over "dierverzorging en gebruik" nationaal en internationaal, die de nadruk legt op het minimaliseren van de aantal dieren dat in onderzoeksstudies wordt gebruikt. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, "Animal Care and Use Program" aan de University of California, Berkeley (https://acuc.berkeley.edu/about.html), en de Noorse richtlijn voor gebruik bij dieren (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

Pilot in vivo-onderzoek (7 dagen herhaalde doses)

Een herhaalde orale dosis gedurende een week werd uitgevoerd om de maximaal mogelijke dosis aerogels te bepalen die de veiligheid bij Wistar-ratten aantonen. Ca-Alg-aerogel werd oraal toegediend in vier dosisniveaus van 50, 100, 250 en 500 mg, wat overeenkomt met een gemiddelde dosis van respectievelijk 200, 400, 1000 en 2000 mg/kg (lichaamsgewicht). De resultaten werden vergeleken met twee positieve controlegroepen die 50 en 500 mg zuiver natriumalginaat (Na-Alg) kregen, wat overeenkomt met de gemiddelde dosisniveaus van respectievelijk 200 en 2000 mg/kg lichaamsgewicht. Uiteindelijk werden alle eerdere groepen Ca-Alg-aerogel- en Na-Alg-behandelingen verwezen naar een controlegroep (placebo). De laatste groep kreeg fosfaatbuffer in een dosis die gelijk is aan de maximale dosis wanneer het wordt toegediend als een dragersysteem voor de teststoffen. De controle- en behandelingsgroepen voor de pilotstudie bestonden uit 4 ratten/groep (twee vrouwtjes en twee mannetjes/groep). De vaste poeders van Ca-Alg-aerogel en Na-Alg werden respectievelijk gesuspendeerd in fosfaatbuffer (pH 7,4) en goed gemengd direct voor de orale toediening omdat de ratten weigerden ze in droge toestand te eten. Voor alle groepen werd de toediening aan ratten elke dag op hetzelfde tijdstip gestart met behulp van orale sondevoeding.

Onderzoek naar langdurige in vivo blootstelling (15 dagen onderzoek met herhaalde dosis)

Op basis van de resultaten uit de vorige rubriek werd de dosis van 250 mg Ca-Alg-aerogel geselecteerd om verder te worden geëvalueerd voor het langdurige (15 dagen) blootstellingsonderzoek. Wistar-ratten werden geobserveerd op onmiddellijke of vertraagde nier- en/of leverbijwerkingen. effecten die kunnen optreden bij respectievelijk blootstelling aan Ca-Alg-aerogel of bij blootstelling aan Na-Alg. van. Voor elke geteste stof werden drie diergroepen gebruikt, waaronder een controle-, behandelings- en een satellietgroep. De controlegroep bestond uit 6 Wistar-ratten/groep (3 mannetjes en 3 vrouwtjes), terwijl de behandelings- en satellietgroepen uit 10 Wistar-ratten/groep (5 mannetjes en 5 vrouwtjes) bestonden. De Wistar-ratten in de behandelingsgroepen kregen gedurende 15 dagen de dagelijkse dosering van 250 mg van de teststoffen (Ca-Alg-aerogel of Na-Alg) en werden op dag 16 opgeofferd. Terwijl de satellietgroepen voor dezelfde duur werden behandeld als die voor de behandelingsgroepen, maar werden in plaats daarvan nog 15 dagen na de behandeling onder observatie gehouden en werden op dag 30 opgeofferd.

Het is vermeldenswaard dat het niet mogelijk was om de twee studies van Ca-Alg-aerogel en Na-Alg parallel uit te voeren. Om deze reden was het niet handig om voor beide één controlegroep te gebruiken. Deze controlegroepen kregen slechts 15 dagen orale fosfaatbuffer en werden vervolgens nog 14 dagen gevolgd. Omdat het een kortdurend experiment was, werden de vaste poeders van Ca-Alg-aerogel en Na-Alg ook gesuspendeerd in een fosfaatbuffer (pH 7,4) en direct voor de orale toediening goed gemengd. Voor alle groepen werd de toediening aan ratten elke dag op hetzelfde tijdstip gestart met behulp van orale sondevoeding.

Klinische en gedragsobservatie

In overeenstemming met de OESO-richtlijnen 407 werden de dieren gedurende de onderzoeksperiode dagelijks gecontroleerd op abnormale klinische symptomen of gedragsveranderingen, met speciale aandacht tijdens de eerste vier uur na toediening van de teststof. Dieren in de satelliet- en controlegroepen werden verder geobserveerd gedurende nog eens 15 dagen zonder toediening van de behandeling. De satellietgroep maakt de detectie mogelijk van laat optredende klinische symptomen die wijzen op lever- en/of niereffecten door het meten van alkalische fosfatase (ALP) en creatininespiegels.

Serumbiochemie en fecesanalyses

Spanje. De bloedmonsters werden verzameld uit orbitale sinusaderen van de Wistar-ratten, die vervolgens werden gebruikt om het serum op te splitsen. Dit verzamelde serum van de monsters werd vervolgens overgebracht naar steriele Eppendorf-buisjes en in de vriezer bewaard voor verder testen van biochemische parameters. Er werden ook om de dag fecesmonsters verzameld om de verandering in de structuur van de microbiële gemeenschap te onderzoeken. De feces werden verzameld in schone steriele 15 ml-buisjes met schroefdop en werden direct bij -20˚C bewaard totdat alle monsters waren verzameld. Voor het 15-dagen-onderzoek met herhaalde dosering werden wekelijks alleen bloedmonsters verzameld om de niveaus van alkalische fosfatase (ALP) en creatinine te meten, dat wil zeggen op dag 0, dag 7, dag 14, dag 21 en dag 30 (dag 21 en dag 30 alleen van toepassing op de controle- en satellietgroepen).

Intestinale microbiële gemeenschapsanalyse

DNA-extractie van de verzamelde fecesmonsters werd uitgevoerd met behulp van MO BIO'S PowerMaxSoil DNA-isolatiekit (MO BIO Laboratories, VS), volgens de instructies van de fabrikant. Polymerase Chain Reaction (PCR)-zuivering en sequentiebepaling van genomisch DNA (gDNA) werden vervolgens uitgevoerd met behulp van Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, VS). De PCR-amplificatie van het 16S-rRNA-gen en de daaropvolgende sequentiebepaling werd gedaan met behulp van Illumina. De 16SrRNA-gen V4 variabele regio PCR-primers ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R en mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) met een streepjescode op de voorwaartse primer werden in 30 cycli gebruikt met behulp van de HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, VS). Na amplificatie werden PCR-producten gecontroleerd in 2 procent agarosegel om het succes van amplificatie en de relatieve intensiteit van banden te bepalen.

Vervolgens werd het samengevoegde en gezuiverde PCR-product gebruikt om de Illumina-DNA-bibliotheek te bereiden. Sequentiebepaling werd uitgevoerd met MR-DNA op een microbioomsequencing (MiSeq) volgens de richtlijnen van de fabrikant. Sequentiegegevens werden verwerkt met behulp van de MR-DNA-analysepijplijn. In het kort, sequenties werden samengevoegd, vervolgens werden de streepjescodes ontdaan, daarna werden sequenties < 150="" bpas="" evenals="" sequenties="" met="" ambigue="" basisaanroepen="" verwijderd.="" sequenties="" werden="" van="" ruis="" ontdaan="" en="" operationele="" taxonomische="" eenheden="" (out's)="" werden="" gegenereerd="" en="" chimeren="" verwijderd.="" otu's="" werden="" gedefinieerd="" door="" clustering="" met="" 3="" procent="" divergentie="" (97="" procent="" gelijkenis).="" de="" uiteindelijke="" otu's="" werden="" taxonomisch="" geclassificeerd="" met="" behulp="" van="" blastn="" tegen="" een="" samengestelde="" database="" afgeleid="" van="" rdp-ii="" en="" ncbi.="" een="" pakket="" van="" verschillende="" statistische="" analyses="" opgenomen="" in="" "r"-software="" werd="" gebruikt="" voor="" hiërarchische="" clustering="" (versie="" 3.5.1,="" veganistisch="">