Expressiepatroon van -tubuline, inversine en het slordige doelwit-1 en morfologie van primaire trilharen bij normale ontwikkeling en ziekten van de menselijke nieren

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract:De spatiotemporele expressie van -tubuline, inversie en verwarde-1 (DVL-1) eiwitten geassocieerd met de Wnt-signaleringsroute, en primaire ciliamorfologie werden geanalyseerd bij de ontwikkeling vannieren(14e-38e ontwikkelingsweek), gezonde postnatale (1.5- en 7-jaar oud), en pathologisch veranderde mensnieren,inclusief multicystische dysplastischenieren(MCDK), focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) en nefrotisch syndroom van het Finse type (CNF). De analyse werd uitgevoerd met dubbele immunofluorescentie, elektronenmicroscopie, semi-kwantitatieve en statistische methoden. Cytoplasmatische co-expressie van -tubuline, inversie en DVL-1 werd waargenomen in de proximale gekronkelde tubuli (pct), distale gekronkelde tubuli (dct) en glomeruli (g) van geanalyseerde weefsels. Gedurendenierontwikkeling nam de algehele expressie van -tubuline, inversie en DVL-1 af, terwijl in de postnatale periode iets toenam. De hoogste expressies van -tubuline en inversie kenmerkten dct en g, terwijl hoge DVL-1 pct kenmerkten. -tubuline, inversie en DVL-1 expressiepatronen in MCDK, FSGS en CNFnierenverschilde aanzienlijk van de gezonde controle. Vergeleken met gezondnieren, pathologisch veranderdnierendysmorfe primaire cilia had. Verschillende expressiedynamieken van -tubuline, inversie en DVL-1 tijdensnierontwikkeling zou erop kunnen wijzen dat schakelen tussen de canonieke en niet-canonieke Wnt-signalering essentieel is voor normaalniermorfogenese. Daarentegen is hun verstoorde expressie in pathologischenierenkan in verband worden gebracht met abnormale primaire trilhaartjes, wat leidt tot chronischenier ziekten.

trefwoorden:ontwikkeling van de menselijke nieren; -tubuline; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; nier, nier

CISTANCHE ZAL NIER/NIIERZIEKTE VERBETEREN

Invoering 

De ontwikkeling van de definitieve of metanephricnierenbegint tijdens de vijfde zwangerschapsweek (GW), die vervolgens continu differentieert om de permanente nieren te vormen [1,2]. De signaalinteracties tussen het metanefrische mesenchym en de ureterknop zorgen voor een goedenierontwikkeling tijdens nefrogenese. In het kort, de ureterknop induceert mesenchymale-naar-epitheliale transitie (MET) in het metanefrische mesenchym, dat condenseert en vormtnierblaasjes, gevolgd door kommavormige en S-vormige lichamen, en uiteindelijk leidend tot glomeruli-vorming [3]. In ruil daarvoor induceert het mesenchym verdere vertakking van de ureterknop. De metanefrische nieren worden functionele uitscheidingseenheden in de 11e week van de menselijke ontwikkeling. Nefrogenese is echter voltooid binnen de 34e tot 36e week van de ontwikkeling van de foetus, wanneer meerdere vertakkingen zijn voltooid, maar het verdere differentiatieproces van de nieren gaat door tot in de postnatale periode [4,5]. Verstoringen van deze complexe interacties resulteren in verschillende aangeboren afwijkingen van de nieren en urinewegen (CAKUT), waaronder dysplasie, polycystische nierziekte, multicystische dysplastischenierziekte(MCDK), wat leidt tot chronischenierziekte(CKD) [6].

In deze studie waren we gericht op het uiterlijk van de primaire cilia en de Wnt-signaleringsroute, die een belangrijke rol speelt tijdens normale nefrogenese en in denierherstelproces, na acuut of chronischnierziekte[7]. Het bestaan ​​van primaire trilhaartjes tijdens nefrogenese en het grote aantal ontwikkelingsstoornissennierdefecten die optreden bij patiënten met ciliaire ziekte wijzen erop dat echte primaire ciliafunctie noodzakelijk is voor normalenierorganogenese [8,9]. De primaire cilium is een op microtubuli gebaseerde organel die belangrijk is voor weefselhomeostase, waarbij -tubuline de basiscomponent is [10]. Verlies van -tubuline-acetylering in geïmmortaliseerde cellen triggert de epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT), wat impliceert dat geacetyleerd -tubuline belangrijk is bij de stabilisatie van microtubuli [11]. Tijdens de menselijke ontwikkeling maakt de primaire cilia-gemedieerde Wnt-route celproliferatie, differentiatie en weefselmorfogenese mogelijk [12]. Een aanzienlijk aantal kinderen met een verminderde primaire ciliafunctie en een verstoorde Wnt-signaleringsroute ontwikkelt CKD, waarbij aangeborennieraandoeningen zijn verantwoordelijk voor bijna de helft van de gevallen [13]. De meest voorkomende aangeboren cystische ziekte bij kinderen is multicystische dysplastischenierziekte(MCDK) [14]. Meerdere cysten die niet communiceren [15] en niet normaal zijnnierparenchym zijn karakteristieke microscopische bevindingen voor MCDK. Focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) is een van de meest voorkomende glomerulaire ziekten die leiden tot eindstadiumnierziekte[16]. In het begin is FSGS kenmerkend voor het focaal zijn, waarbij slechts een minderheid van de glomeruli en segmentaal betrokken zijn, waarbij slechts een segment van de glomerulaire cirkel verandert [17]. Congenitaal nefrotisch syndroom van het Finse type (CNF) is een zeldzame autosomaal recessief overgeërfdenierziektevertegenwoordigd door een prenatale uitbraak van uitgebreid eiwitverlies [18], geassocieerd met cystogenese van proximale tubuli [19]. Veel vormen van primaire glomerulaire ziekten ontwikkelen proteïnurie als gevolg van de beschadigde glomerulaire filtratiebarrière [20]. Een aanzienlijk aantal studies suggereert dat letsel en disfunctie van de podocyten een intrinsieke rol spelen in de pathogenese van CKD-proteïnurie [21]. De studie van Vukojevic et al. toont een verhoogd aantal trilhaartjes en slecht gedifferentieerde podocyten in CNF [22]. Eerdere studies gaven aan dat de Wnt/-catenine-signaleringsroute een fundamentele rol speelt bij het modereren van podocytdisfunctie met proteïnurie [23]. Er zijn twee belangrijke Wnt-signaleringsroutes, één bekend als canoniek -catenine-afhankelijk en andere niet-canoniek, -catenine-onafhankelijk. Tijdens muisnierontwikkeling is canonieke Wnt-signalering actief op de ureterknoppen en in S-vormige lichamen [24]. Bovendien is Wnt via canonieke signalering relevant voor het handhaven van MET tijdens nefrogenese [25]. Binding van het eiwitcomplex dat Dvl bevat aan de membraanreceptor is namelijk verplicht voor activering van de Wnt-route, terwijl het uitschakelen van de belangrijkste componenten van deze route resulteert in vroege perinatale mortaliteit vanwege de afwezigheid van de nefrogene zone in denier[25]. 

Een eiwit dat cruciaal is als moleculaire omschakeling tussen canonieke en niet-canonieke Wnt-signaleringsroutes bleek inversie te zijn [26]. Hoewel interacties van verschillende eiwitten met inversie zijn gedetecteerd, is de exacte functie ervan nog niet volledig opgehelderd. In denierepitheelcellen, inversie is gelokaliseerd in de primaire trilhaartjes en werkt als een ciliair eiwit [27]. Bovendien vormt inversie een stabiel complex met tubuline in culturen vanniercellen, en ze colokaliseren in vivo [27,28]. Inversie lijkt een essentiële rol te spelen in de vroege morfogenese van het sensitivephric-systeem en de bepaling van de links-rechtssymmetrie tijdens de ontwikkeling [29,30]. Een belangrijke gebeurtenis voor zowel canonieke als niet-canonieke Wnt-signaleringsroutes bij de rekrutering van de cytoplasmatische Dvl naar het celmembraan. Omdat eerdere bevindingen aantoonden dat inversie en Dvl colokaliseren in de nierepitheelcellen, kan worden gespeculeerd dat inversie ook een rol kan spelen bij niet-canonieke signalering. Ontregeling van Wnt-signalering gemedieerd door inversie veroorzaakt afwijkende proliferatie in tubuli [31]. Genetische tests onthulden een DVL-1-mutatie bij patiënten met het autosomaal dominante Robinow-syndroom, met heterogene aandoeningen bij sommige patiënten geassocieerd met urogenitale ennieranomalieën [32].

CISTANCHE ZAL DE NIER/NIERDIALYSE VERBETEREN

Het ontwikkelingsexpressiepatroon van -tubuline, inversie en DVL-1 is onderzocht in verschillende diermodellen. Zo is hun expressie in Proximale tubulaire cellen van de muis bevestigd met behulp van intravitale microscopie [31], terwijl ze werden gevonden in cellijnen die zijn afgeleid van proximale tubulaire cellen van de muis met behulp van confocale microscopie en massaspectrometrie [33]. Bovendien onthulden lichtmicroscopie en dubbele immunofluorescentie hun aanwezigheid in secties van muizennieren[34]. Studies met inversie-knockout-muizen rapporteerden vergrote, diffuse cysten in deniermedulla en cortex geassocieerd met viscerale inversie van de situs [35]. Bij mensen werd inversiemutatie gepresenteerd met infantiele nefronoftise die leidde tot zwangerschapsafbreking [36]. Ondanks talrijke studies overnier-tubuline, inversie en DVL-1 expressiepatroon en functie, voor zover ons bekend, is een expressiepatroon van deze eiwitten in het menselijke foetale en postnatale menselijke weefsel nog niet onderzocht en tot een correlatie gebracht. Bovendien is er geen bewijs gerapporteerd met betrekking tot de expressie van inversie en DVL-1 in de vroege menselijke ontwikkeling. Daarom was deze studie gericht op het analyseren van het ruimtelijke en temporele expressiepatroon van -tubuline, inversie en DVL-1 tijdens foetale en postnatale stadia van gezonde menselijkenieren, evenals innierweefsels van MCDK, FSGS en CNFnierenom een ​​mogelijke ontbrekende schakel tussen deze entiteiten vast te stellen. We stellen namelijk voor dat verstoorde expressiepatronen van -tubuline-, inversie- en DVL-1-eiwitten het onderliggende cystogeneseproces en een abnormale functie van primaire cilia kunnen zijn die leiden tot chronischenier ziekten. 

Resultaten

De analyse van ontwikkelings- en postnataalnierweefsels werd uitgevoerd op duidelijk gedifferentieerde structuren van denier:proximale gekronkelde tubuli (pct), distale gekronkelde tubuli (dct) en glomeruli (g). Tijdens de geanalyseerde ontwikkelingsstadia en in postnataalnierweefsels, -tubuline, inversie en DVL-1 vertoonden positieve expressiepatronen, maar met verschillen in intensiteit, distributie en hoeveelheid. De analyse van de pathologischenierweefselvan MCDK, FSGS en CNF werd uitgevoerd op volledige beeldtelling van de positieve cellen in vergelijking met gezonde nierweefselcontrole.

2.1. Lichtmicroscopie, elektronenmicroscopie en immunohistochemie (-Tubuline) van gezond en pathologisch veranderd postnataal menselijk nierweefsel

2.1.1. Gezond postnataal nierlicht

microscopie van de postnatalenierweefsel toont goed gedefinieerdnierstructuren, met een duidelijk verschil tussen medulla en cortex en de vorming van de pct, dct en g in het corticale gebied. Immunohistochemische kleuring van -tubuline onthult de aanwezigheid van één primaire cilium in het midden van het apicale celoppervlak van elke buisvormige cel en in 0.018 procent ± 0,00014 procent SD op het oppervlak van glomerulaire cellen. Elektronenmicroscopie toont de aanwezigheid van slechts één primaire cilium die voortkomt uit het basale lichaam aan het apicale celoppervlak van de tubulus (Figuur 1a).

2.1.2. CNF

De meeste geanalyseerde g zijn kleiner en gelobd (80 procent), terwijl de minderheid van normale grootte of hypertrofisch is (20 procent, n=100). Segmentale of globale sclerose van g wordt gevonden, terwijl pct en dct gedeeltelijk verwijd zijn en bedekt zijn met atrofisch epitheel. Ultrastructureel wordt verlies van microvilli en afname van celhoogte met multifragmentatie van kernen waargenomen. In podocyten gaan voetprocessen diffuus verloren. Tubulaire primaire trilharen zijn ongeorganiseerd, met name in de cysten van de proximale tubuli, en vertonen veranderingen in lengte en cytoplasmatische positie (Figuur 1b).

2.1.3. MCDK

In nierweefsel kan sporadisch onrijpe en rijpe g worden gevonden.Nierweefsel is gevuld met talrijke ovale cysten. Zuilvormige epitheelcellen bedekken de cysten en zijn omgeven door los bindweefsel. Immunohistochemische kleuring tot -tubuline toont meerdere lange en ongeorganiseerde primaire trilhaartjes op het oppervlak van de epitheelcellen (Figuur 1c).

2.1.4. FSGS

Bij 90 procent van de g wordt uitgebreide segmentale sclerose gevonden (n=100), geassocieerd met interstitiële fibrose en tekenen van tubulaire beschadiging. De afname van de hoogte van epitheelcellen met verlies van microvilli wordt gevonden in de elektronenmicroscoop, terwijl endotheelcellen en mesangiale gebieden een regelmatige ultrastructuur hebben. In de elektronenmicroscoop wordt het extreem lange en ontwrichte (gedecentraliseerde) cilium waargenomen op het oppervlak van de distale buisvormige cel (Figuur 1e). Podocyten vertonen diffuus verlies van voetprocessen met uitgebreid microvillusweefsel. Immunohistochemische kleuring op a-tubuline toont meerdere lange en ongeorganiseerde primaire trilhaartjes op het oppervlak van de epitheelcellen (Figuur 1c).

2.2. Immunohistochemische kleuring op 心Tubuline, inversie en DVL-1- en statistische analyse van zich ontwikkelende en gezonde postnatale menselijke nieren

In de 14e, 15e en 16e zwangerschapsweeknierweefsel wordt gepresenteerd met verschillende ontwikkelingsstadia van nefronvorming: van metanefrische cups,nierblaasjesstadia om S-vormige nefronen te besturen, waardoor de nefrogene zone in de buitenste cortex wordt gevormd (Figuur 2). Het onderscheiden van pct, dct en g kan worden waargenomen in corticale regio's dichter bij deniermerg. Tijdens de 22e GW werden delen van de medulla en cortex duidelijk onderscheidend, terwijl in de 38e GW,nierstructuren verschijnen als sterk gedifferentieerde, met volwassen vormen van pct, dct en g

2.2.1. a-Tubulin

Tijdens de ontwikkeling komt a-tubuline sterk tot expressie in alle ontwikkelendenierstructuren, voornamelijk het visualiseren van de vorm van primaire trilhaartjes op de oppervlakken van pariëtale epitheelcellen van het kapsel van Bowman, g, pct en dct. Binneninnierweefsel, 82-97 procent van pct-cellen brengen a-tubuline tot expressie, terwijl in dct-expressie daalt van 99 procent naar 72 procent in de 38e GW (zie figuur 3, tabel 1). Van de verschillende ontwikkelingsstadia wordt de sterkste expressie van a-tubuline gevonden in de g van de 16e GWnieren, met 93 procent positieve cellen. lenige 14e, 15e en 22e GW (zie figuur 3a,b, tabel 1), ongeveer 70 procent van de g-cellen brengt a-tubuline tot expressie, terwijl de minste expressie wordt waargenomen in de 38e GW (p < 0,01)="" met="" 34="" procent="" van="" de="" positieve="" cellen="" (figuur="" 3c).="" in="" de="">nierweefsel (1.5-jaar en 7-jaar oudnieren), wordt de sterkste immunoreactiviteit voor a-tubuline waargenomen op het apicale celoppervlak van de pct en dct (Figuur 3d-f). De a-tubuline-expressie is ook aanwezig in het perinucleaire cytoplasma van het dct en de pariëtale epitheelcellen van het kapsel van Bowman. a-tubuline vlekken allemaalnierstructuren met een gemiddelde van 50 procent positieve cellen in pct, 94 procent in dct en 85 procent in g (Figuur 3f). Dct-vlekken verschillen significant van pct (p < 0,0001).="" alle="" onderzochte="" structuren="" kleuren="" positief="" voor="" a-tubuline,="" met="" 77="" procent="" positieve="" cellen="" in="" pct,="" 72="" procent="" in="" dct="" en="" 58="" procent="" in="" g="">

Figuur 3. Immunofluorescentiekleuring van -tubuline en DAPI in de zich ontwikkelende en postnatale menselijke nierweefsels (a-e). Nieren van 14e, 15e/16e, 38e GW (a–c);nierenvan 1.5- en 7-jarige kinderen (d,e). Positieve kleuring van -tubuline (pijlen) wordt getoond in elke structuur in de cortex via ontwikkelings- en postnatale fasen (a-e), proximale ingewikkelde tubuli (pct), distale ingewikkelde tubuli (dct) en glomeruli (g). Details van primaire trilharen in pct (d) en dct (a-c,e) worden weergegeven als inzetstukken met een hogere vergroting (witte doos). Vergroting ×40, schaalbalk 100 µm. De verdeling van -Tubuline-positieve cellen per structuur over verschillende ontwikkelingsstadia en in de postnatale periode wordt weergegeven in grafiek (f). Grafiek (g) (totaal aantal eiwitpositieve cellen in waargenomen structuren) toont eiwitexpressie gerelateerd aan ontwikkelingstijd (Lineaire regressie) en onderlinge relatie van -Tubuline tot DVL-1 door ontwikkeling en rijping (Two-Way ANOVA gevolgd door SIDAK's posthoc-test). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD.

De verdeling van -tubuline-positieve cellen per structuur over verschillende ontwikkelingsstadia en in de postnatale periode wordt weergegeven in grafiek (f). Grafiek (g) (totaal aantal eiwitpositieve cellen in waargenomen structuren) toont eiwitexpressie gerelateerd aan ontwikkelingstijd (lineaire regressie) en onderlinge relatie van -tubuline tot DVL-1 door ontwikkeling en rijping (tweerichtings-ANOVA gevolgd door Sidak's post hoc-test). Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SD.

2.2.2. Dubbele immunofluorescentiekleuring tegen inversie en DVL-1 en DAPI-nucleaire kleuring bij ontwikkeling en gezonde postnatale nieren Inversie-expressie bij ontwikkelend en postnataal nierweefsel

In de 14e, 15e en 16e GW vertoont inversie sterke granulaire expressie in g en milde granulaire expressie in het cytoplasma van pct en dct (Figuur 4a, b), terwijl in de 22e en 38e GW (zie Figuur 4c), de sterk positieve expressie wordt waargenomen in g (tabel 1). Tussen de 14e en 22e GW brengt ongeveer 50 procent van de cellen de versie tot expressie. In de 16e GW brengen pct-cellen inversie tot expressie in 73 procent van de cellen, terwijl ze afnemen tot 29 procent van de cellen (p <0,05) in="" de="" 38e="" gw="" (zie="" figuur="" 4f).="" positieve="" expressie="" van="" inversie="" wordt="" gevonden="" in="" ongeveer="" 80-90="" procent="" van="" de="" dct-="" en="" g-cellen="" in="" de="">nierweefsels van de 14e en 16e GW, met de laagste expressie in dct van 38e GW (respectievelijk p < 0.05,="" p="">< 0,0001),="" waarbij="" 66="" procent="" van="" de="" cellen="" positief="" was.="" in="">nieren, pct kleurt sterk op het apicale celmembraan, terwijl dct meestal op het basale celmembraan en in het perinucleaire cytoplasma kleurt (Figuur 4d, e). In dat stadium vonden we expressie van inversie in alle onderzochtenierstructuren, waaronder pct, dct en g, met een gemiddelde expressie van positieve cellen van 92 procent voor pct, 88 procent voor dct en 90 procent voor g (Figuur 4f). We hebben geen significant verschil waargenomen in signaalsterkte van inversie-expressie tussen structuren. De hoogste expressie van inversie wordt gevonden in g, met een gemiddelde van 94 procent positieve cellen (Figuur 4f). Er wordt een significant verschil gevonden door de kleuring van g (waar 94 procent van de cellen positief kleurt) te vergelijken met pct, waarbij 58 procent van de cellen positief kleurt (p < 0,01)="" en="" met="" dct,="" waar="" 49="" procent="" van="" de="" cellen="" positief="" (p="">< 0,0001,="" figuur="">

DVL-1-expressie in zich ontwikkelend en postnataal nierweefsel

Milde tot sterke expressie van DVL{{0}} wordt waargenomen in het cytoplasma van pct, dct en g in de foetale periode (zie figuur 4a-c, tabel 1). In pct brengt 76-86 procent van de cellen DVL-1 tot expressie in de 14e-22e GW, terwijl er in de 38e GW 57 procent positieve cellen zijn (Figuur 4g). In het dct van 14e en 15e GW, brengt 68-70 procent van de cellen DVL tot expressie-1, in de 16e en 22e GW daalt het aantal positieve cellen tot 42-5{{41} } procent, terwijl in de 38e GW-expressie (p < 0,001)="" wordt="" waargenomen="" in="" 19="" procent="" van="" de="" dct-cellen.="" expressie="" van="" dvl-1="" neemt="" toe="" in="" g="" gedurende="" de="" hele="" foetale="" stadia:="" in="" de="" 14e="" gw="" is="" dit="" 6="" procent,="" terwijl="" deze="" in="" de="" 15e,="" 16e="" en="" 22e="" gw="" toeneemt="" tot="" 10="" procent="" (p="">< 0,01).="" in="" de="" 38="" gw="" brengt="" 14="" procent="" van="" de="" g-cellen="" dvl-1="" tot="" expressie="" (figuur="" 4="" g).="" in="" de="" postnatale="" periode="" is="" de="" dvl-1="" immunoreactiviteit="" verspreid="" in="" het="" cytoplasma="" (tabel="" 1)="" van="" zowel="" pct="" als="" dct="" (figuur="" 4d,e).="" het="" signaal="" wordt="" gevonden="" in="" alle="" onderzochte="" structuren,="" maar="" meestal="" in="" het="" perinucleaire="" cytoplasma.="" de="" intensiteit="" van="" dvl-1-expressie="" is="" significant="" hoger="" in="" pct="" vergeleken="" met="" dct="" en="" g="" (p="">< 0,01).="" 39-45="" procent="" van="" de="" cellen="" in="" de="" pct="" en="" dct="" brengen="" dvl-1="" tot="" expressie,="" terwijl="" in="" g="" 21="" procent="" van="" de="" cellen="" positief="" is="" (figuur="" 4="" g).="" we="" vonden="" geen="" significant="" verschil="" tussen="" het="" percentage="" immuunreactieve="" cellen="" in="">nierstructuren. Het percentage DVL-1 immunoreactieve cellen is respectievelijk 34 procent in pct, 36 procent in dct en 27 procent in g (Figuur 4g).

Figuur 4. Dubbele immunofluorescentiekleuring van inversie (groen), DVL-1 (rood) en DAPI (blauw) in de zich ontwikkelende en postnatale nierweefsels (14e-38e GW, 1.5- en {{6 }}jarige nierweefsels). Positieve kleuring (pijlen) wordt in elke structuur getoond in alle ontwikkelingsfasen (a-c) en de postnatale periode (d,e). Samengevoegde microfoons samen met structuren van belang in de cortex: proximale ingewikkelde tubuli (pct), distale ingewikkelde tubuli (dct) en glomeruli (g). Colocalisatie van inversie/DVL-1 (pijlpunt) wordt getoond in samengevoegde microfoto's. Negatieve controlekleuringen worden weergegeven als inzetstukken bij inversie en DVL-1 (a). Erytrocyten kunnen worden gezien als sterk gekleurde cellen in de buurt van dct. Details worden weergegeven als inzetstukken met een hogere vergroting. Vergroting ×40, schaalbalk 100 µm. Dynamische positieve celverdeling van inversie en DVL-1 in nierstructuren (pct, dct, g) gedurende de ontwikkelings- en postnatale stadia worden weergegeven in grafieken (f,g). Grafiek (h) toont eiwitexpressie (totaal aantal positieve cellen in structuren) gerelateerd aan ontwikkelingstijd (lineaire regressie) en onderlinge relatie van inversie tot DVL-1 door ontwikkeling en rijping (tweerichtings-ANOVA gevolgd door Sidak's post-hoctest ). Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SD.

Co-expressie van inversie en DVL-1 wordt waargenomen in het cytoplasma van nier g, dct en pct tijdens de ontwikkeling (zie figuur 4a-c, samenvoegen). In de postnatale periode kenmerkt co-expressie van inversie en DVL-1 verschillende cellulaire compartimenten van tubulaire cellen in pct en dct, terwijl co-expressie in g wordt gekenmerkt door de sterke prevalentie van inversie-expressie (zie figuur 4d, merge ). In het 7-jaar postnatale nieren wordt co-expressie van inversie en DVL-1 gezien in tubulaire cellen van dct en pct, en in g waar inversie-expressie licht overheerst in vergelijking met DVL-1 (Figuur 4e, samenvoegen).

2.2.3. Verschillen in expressie van -tubuline, inversie en DVL-1 tussen verschillende ontwikkelingsnierstadia en postnatale nieren

Het aantal -tubuline-positieve cellen in pct van foetaal nierweefsel was statistisch significant hoger in vergelijking met het nierweefsel van 7-jarige kinderen (13e (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15e="" (p="">< 0.0001)="" en="" 16e="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" van="" vroege="" foetale="" stadia="" (13e,="" 15e,="" 16e="" en="" 22e="" gw)="" had="" meer="" positieve="" cellen="" in="" vergelijking="" met="" de="" 38e="" gw="" en="" nierweefsel="" van="" 1.5-jarige="" kinderen="" (respectievelijk="" p="">< 0,0001,="" figuur="" 3f).="" toen="" verschillende="" ontwikkelingsstadia="" werden="" vergeleken,="" vonden="" we="" lagere="" niveaus="" van="" inversie-expressie="" in="" de="" pct="" van="" de="" 13e="" (p="">< 0,0001),="" 15e="" (p="">< 0,00001),="" 22e="" (p="">< 0,001)="" en="" 38e="" (p="">< 0,0001)="" gw="" in="" vergelijking="" met="">nierweefsel van het 1.5-jarige kind. In dct werd een statistisch significant lagere expressie van inversie gevonden bij vergelijking van 16e GW tot 38e GW nierweefsel (p < 0.0001).="" verder="" werd="" een="" lagere="" expressie="" van="" inversie="" in="" dct="" waargenomen="" in="" 7-jarig="" nierweefsel="" van="" kinderen;="" het="" vergelijken="" van="" 13e,="" 15e="" (p="">< 0,001,="" beide),="" 16e="" en="" 1.5-="" jaar="" oud="" nierweefsel="" met="" dct="" van="" 7-="" jaar="" oud="" nierweefsel="" (respectievelijk="" p="">< 0,00001,="" figuur="" 4f).="" het="" waargenomen="" signaal="" van="" dvl-1-expressie="" door="" de="" verschillende="" stadia="" onthulde="" dat="" pct="" van="" de="" 13e="" (p="">< 0,01),="" 15e,="" 16e="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Verband tussen expressies van -tubuline en inversie naar DVL-1 in zich ontwikkelend en postnataal nierweefsel

-Tubuline- en inversie-expressies werden vergeleken met DVL-1-expressie gedurende ontwikkelingsstadia en in postnataal nierweefsel. -tubuline had een statistisch hogere expressie in alle waargenomen stadia, vergeleken met de expressie van DVL-1 (p <0.001, figuur="" 3g).="" in="" alle="" waargenomen="" stadia="" had="" inversie="" een="" hogere="" expressie="" in="" vergelijking="" met="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" figuur="" 4="">

2.2.5. Vergelijking van immunohistochemische kleuring met -tubuline, versie en DVL-1- en statistische analyse van pathologisch veranderd nierweefsel (MCDK, CNF, FSGS) -tubuline Het verschil van -tubulinekleuring in MCDK, FSGS en CNF was statistisch significant in vergelijking naar gezond postnataal nierweefsel als controlegroep (respectievelijk p < 0.0001).="" dysplastische="" nierweefsels="" hadden="" een="" significant="" hogere="" expressie="" in="" vergelijking="" met="" de="" controlegroep,="" terwijl="" fsgs="" en="" cnf="" significant="" lagere="" expressie="" van="" -tubuline="" vertoonden="" in="" vergelijking="" met="" gezonde="" controle="" (figuur="">

inversie

Inversie wordt uitgedrukt in het cytoplasma van ongeorganiseerde epitheelcellen en tubuli van MCDK (Figuur 5a). In CNF kenmerkt inversie-expressie g en dct, terwijl het minder intensief is in pct-cysten (Figuur 5b). In FSGS wordt inversie sterk uitgedrukt in g en dct, maar minder intensief in pct-cysten (Figuur 5c). Ruimtelijke expressie van inversie vertoonde een statistisch significant hogere kleuringssnelheid in gezonde nierweefsels (Figuur 5g) in vergelijking met MCDK, FSGS en CNF (respectievelijk p <>

Figuur 5. Dubbele immunofluorescentiekleuring van inversie (groen), DVL-1 (rood) en DAPI (blauw) in pathologische nierweefsels in MCDK (a), CNF (b) en FSGS (c): tubuli (t) , glomeruli (g), pct-cyste (c), de hoogte van pct-epitheelcellen (*). Structuur en cel co-lokalisatie van inversie en DVL-1 (pijlpunten) worden weergegeven in de samengevoegde secties met details in inzetstukken met een hogere vergroting. Negatieve controlekleuringen worden weergegeven als inzetstukken bij inversie en DVL-1 (a). Vergroting ×40, schaalbalk 10{{20}} µm. Relatie van -tubuline (d) en inversie (e) tot DVL-1-expressie in MCDK, FSGS en CNF (tweerichtings-ANOVA gevolgd door SIDAK's post-hoctest). Het verschil in epitheelcelhoogte (f) van FSGS, CNF en MCDK pct vergeleken met gezonde controle (one-way ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc test, n=50). Het verschil in het totale percentage positieve cellen van -tubuline, inversie en DVL-1 in MCDK, CNF en FSGS in vergelijking met gezonde controle (g–i), one-way ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc-test). Gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SD. Significante verschillen worden aangegeven door p-waarde (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl="" -1="" dvl="" -1="" wordt="" alleen="" zeer="" mild="" tot="" expressie="" gebracht="" in="" ongeorganiseerde="" tubuli="" van="" mcdk,="" terwijl="" in="" cnf="" de="" expressie="" ervan="" dct="" en="" g="" kenmerkt="" (figuur="" 5a,="" b).="" in="" fsgs="" wordt="" dvl-1="" waargenomen="" als="" milde="" reactiviteit="" in="" g,="" dct="" en="" pct="" (figuur="" 5c).="" gezonde="" nierweefsels="" gekleurd="" met="" dvl-1="" vertoonden="" een="" significant="" hogere="" kleuringssnelheid="" (figuur="" 5="" h)="" in="" tegenstelling="" tot="" mcdk="" en="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" beide),="" terwijl="" er="" geen="" significant="" verschil="" werd="" gevonden="" voor="">

2.2.6. Verband tussen expressies van -tubuline en inversie naar DVL-1 in pathologisch veranderd nierweefsel (MCDK, CNF, FSGS)In MCDK, FSGS en CNF wordt -tubuline significant hoger gekleurd dan DVL-1 (respectievelijk p < 0.0001,="" figuur="" 5d).="" inversie="" kleurde="" significant="" hoger="" in="" vergelijking="" met="" dvl="" -1="" in="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" en="" in="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" figuur="">

2.2.7. Verschillen in epitheelcelhoogte van proximale ingewikkelde tubuli tussen gezonde controle en pathologisch veranderd nierweefsel (MCDK, CNF, FSGS)De hoogte van pct-epitheelcellen (n {{0}} per groep) werd vergeleken tussen tubuluscellen in gezonde nierweefsels en pathologisch veranderde nierweefsels (Figuur 5b, c, f). De gemiddelde hoogte van epitheelcellen in HC was 12,91 µm ± 1,847 µm en was significant hoger in vergelijking met CNF en FSGS (respectievelijk p < 0.0001,).="" de="" gemiddelde="" celhoogte="" in="" cnf="" pct="" was="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" terwijl="" in="" fsgs="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm="" was.="" pct-epitheelcellen="" van="" mcdk="" vertoonden="" geen="" significante="" veranderingen="" in="" hoogte="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" in="" vergelijking="" met="">

2.2.8. Verschillen in primaire cilialengte tussen gezonde controle en pathologisch veranderd nierweefsel (MCDK, CNF, FSGS)

De primaire ciliumlengte (n= 50 per groep) werd vergeleken tussen HC en pathologisch veranderde nierweefsels (Figuur 6c). Gezonde nierweefsels en MCDK werden gekleurd met -tubuline om de specificiteit van -tubuline cilium-kleuring gerust te stellen (Figuur 6a, b). In gezonde nierweefsels was het primaire cilium 5,065 µm ± 1,229 µm lang, terwijl in MCDK CNF en FSGS significant langer waren (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Discussie

Het doel van onze studie was het onderzoeken van een immunohistochemische expressie van atubuline, inversie en DVL-1 in foetaleniertissue and postnatal kidney tissue. Furthermore, we wanted to explore whether the expression and staining pattern of a-tubulin, inversion and DVL-1 is disturbed in different kidney diseases when compared to healthy control. Namely, despite the extensive interest of the other researchers on the role of a-tubulin, inversion and DVL-1 during kidney development, most of the previous studies have used animals or in vitro experimental models. As far as we are aware, this is the first study that had shown expression and localization of a-tubulin along with inversion and DVL-1 in fetal and postnatal human kidneys, and that had explored the expression of mentioned proteins in kidney diseases, such as MCDK, FSGS and CNF. We also analyzed changes in cilia length and appearance by light and electron microscopy, as our previous study has already indicated that ciliary disturbances may be associated with cystogenesis in FSGF and CNF [19].

In de canonieke Wnt-signaleringsroute rekruteert de binding van Wnt-liganden aan receptoren Dvl [37]. Processen van de MET en de vlakke celpolariteitsroute tijdens de vroege stadia van niermorfogenese worden gecontroleerd door de Wnt-signalering. Door de Wnt-route te bemiddelen, regelen de primaire trilharen de celproliferatie, differentiatie en weefselmorfogenese [12] door het celcytoskelet en de celoriëntatie te organiseren, evenals de verlenging van de buisvormige structuur [2,38]. In onze studie waren -tubuline, inversie en DVL-1 allemaal aanwezig in nierstructuren, en ze waren allemaal niet alleen gecolokaliseerd tijdens de ontwikkeling van de foetale nier, maar ook in het nierweefsel van de 1.5- en {{9 }}jarige kinderen. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met de activering van de Wnt-signaleringsroute waarvan is bewezen dat deze al optreedt tijdens de tubulogenese [39]. Bovendien hebben onze resultaten onthuld dat de expressie van -tubuline en inversie wederkerig gerelateerd zijn aan DVL-1 en dat ze een statistisch significant verschil vertonen tussen hun expressiepatronen. Dat is in correlatie met experimentele modellen, aangezien de mutatie van de volledige Dvl-eiwitfamilie bij muizen resulteert in een gebrek aan gastrulatieproces, terwijl mutaties die niet de hele eiwitfamilie omvatten, defecten vertonen in de plaatsing van de nodale cilia samen met orgaandefecten [40] . Eerdere bevindingen suggereerden dat inversie een rol speelt bij celmigratie in Xenopus sensitivephros. Aangezien dat segment correleert met de zoogdierlus van Henle en de distale tubuli, zou dit ook bij mensen kunnen wijzen op het belang van inversie tijdens de ontwikkeling van de nieren [41]. In overeenstemming met die premisse onthulden eerdere studies dat mutatie van het inversie-gen zou kunnen resulteren in nefronoftise type 2, dat wordt gemedieerd door abnormale DVL-1-expressie [42]. Ondanks dat de rol van primaire cilium controversieel is in de regulatie van de Wnt-signaleringsroute, vonden we dat -tubuline colokaliseerde met inversie en DVL-1 in de geanalyseerde niermonsters. Bovendien wezen eerdere studies erop dat het primaire cilium samen met inversie de afbraak van Dvl reguleert door de Wnt-signaleringsroute [43] te beïnvloeden. Bij menselijke nierziekten die verband houden met de ontwikkeling van cysten, zijn abnormale lokalisatie en functie van primaire trilharen waargenomen [19]. Evenzo bevestigde de huidige studie ook morfologische veranderingen van de vorming van primaire trilharen in pathologische aandoeningen zoals CNF, FSGS en MCDK. Eerdere bevindingen erkenden dat overactivering van de canonieke Wnt-route na nierbeschadiging leidt tot onomkeerbare structurele veranderingen van nierweefsel [44]. Integendeel, primaire cilium kreeg de rol van het overschakelen van canonieke naar niet-canonieke Wnt-route bij het helpennierreparatie. Bovendien bleek overactivering van de canonieke Wnt-route in getransplanteerd nierweefsel een positief voorspellende waarde te hebben voor nierfibrose [45]. Als de canonieke Wnt-route de overhand heeft ten koste van de niet-canonieke, ondersteunt het de theorie van nierfibrose als uitkomst. Onze bevindingen van verlaagde -tubuline- en inversie-expressie in CNF en FSGS impliceren inactiviteit van de niet-canonieke Wnt-route, vooral omdat beide aandoeningen de neiging hebben om te leiden tot eindstadiumnierziekte.Er wordt namelijk aangenomen dat normale lokalisatie en functie van primaire cilium een ​​factor zou kunnen zijn bij het handhaven van een normale Wnt-route en daarom een ​​voorwaarde voor normale ontwikkeling. Als de Wnt-route daarentegen wordt versterkt, kan dit leiden tot ontregelde celproliferatie en differentiatie, wat leidt tot carcinogenese [46]. Zoals eerder beschreven, is de canonieke Wnt-route verplicht voor het starten van MET en vorming van het nefron, terwijl de verstoring ervan kan leiden totnierhypoplasie [47]. Onze resultaten ondersteunen dit idee door de laagste expressie van DVL-1 te onthullen met de hoogste expressie van -tubuline in MCDK in vergelijking met gezonde controle. Deze resultaten kunnen de laagste activering van de canonieke Wnt-route impliceren, wat een onderliggende oorzaak zou kunnen zijn voor de afwezigheid van nefronvorming. Daarentegen zou de hoogste -tubuline-expressie met de laagste DVL-1-expressie de bevindingen van meerdere cysten kunnen verklaren, omdat er geen georganiseerde verlenging en celpolarisatie is die wordt geleid door de niet-canonieke Wnt-route. Eerdere studies hadden ook aangetoond dat inversie de canonieke Wnt-signaleringsroute remt door Dvl te richten op degradatie [26]. Deze stap in hun interactie bleek nodig te zijn om canonieke Wnt-signalering te remmen bij het handhaven van normale buisvormige verlenging en positionering. Inversiemutatie resulteert in opregulatie van canonieke Wnt-signalering, die vervolgens abnormale proliferatie in tubulaire cellen veroorzaakte. Het is bewezen dat deze stap cruciaal is bij cystogenese [42], terwijl de knock-out van inversie bij muizen leidt tot polycystische nierziekte [48]. Volgens de theorie vanniercystogenese, inversie wordt beschouwd als een "mycoproteïne", vanwege de lokalisatie naar primaire cilia innierbuisvormige cellen. In onze studie waren primaire trilhaartjes aanwezig op het apicale celoppervlak van buisvormige cellen in alle geanalyseerde stadia, terwijl tijdens de foetale stadia de expressie van -tubuline sterker was dan in de postnatale periode.

CISTANCHE ZAL NIER/NIERENPIJN VERBETEREN

Eerdere studies hebben aangetoond dat de primaire ciliafunctie kan worden beïnvloed door ontregeling van -tubuline tijdens de ontwikkeling, wat kan leiden tot cystogenese, abnormale nierontwikkeling en mogelijk chronische nierziekte in de kindertijd [31,49]. Dit is in overeenstemming met onze bevindingen van verkorte en dysmorfe primaire trilharen waargenomen in MCDK of met meerdere en extreem langwerpige of ontwrichte trilharen gevonden in verwijde tubuli van CNF en FSGS in vergelijking met gezonde controle. Om het feit te ondersteunen dat de canonieke en niet-canonieke Wnt-signaleringsroutes, gereguleerd door primaire cilia, als verplicht worden beschouwd voor normale nierontwikkeling, vonden we significant lagere kleuring van inversie en DVL-1 in MCDK in vergelijking met gezonde controle [31,49]. Verschillende dynamiek van het expressiepatroon van -tubuline, inversie en DVL-1 in verschillende ontwikkelingsfasen van de nieren kan wijzen op een omschakeling tussen de canonieke en niet-canonieke Wnt-signaleringsroute tijdens normale niermorfogenese. We suggereren dat hun uitwisseling de transcriptie in de canonieke route of volgorde van celmigratie en polarisatie tijdens nierontwikkeling in een niet-canonieke signaalroute bepaalt. Hun evenwicht en expressie in alle onderzochte nierstructuren impliceren hun belangrijke rol in de normale ontwikkeling van de nieren. Tijdens normale nierontwikkeling (van 13e GW tot 38e GW) neemt de algehele expressie van -tubuline, inversie en DVL-1 af naarmate nierweefsel een volwassen morfologie krijgt. In 1.5- en 7- jaar oude nierweefsels vertoonden -tubuline en inversie een lichte toename in expressie, wat het feit ondersteunt dat de niet-canonieke Wnt-route actief blijft na de geboorte. Integendeel, DVL-1 blijft bestaan ​​met een verminderd expressiepatroon, wat zou kunnen bijdragen aan de conclusie dat de canonieke Wnt-route tot zwijgen wordt gebracht in gezond nierweefsel. Als gevolg van pathologische nieraandoeningen kunnen epitheelcellen van de nier reageren met het opnieuw verschijnen van EMT en fibrose [50] geassocieerd met reactivering van de canonieke Wnt-route [44]. Daarom kunnen verstoringen van -tubuline, inversie en DVL-1 gevonden in zieke nieren het onderliggende pathologische mechanisme zijn en een resultaat van de omschakeling van niet-canonieke naar canonieke Wnt-route in de zich ontwikkelende nier, verwijzend naar de omschakeling van omkeerbare naar onomkeerbare nier schade. Bovendien, veranderingen in hun prenatale en postnatalenierexpressiepatroon kan worden geassocieerd met een verminderde nierfunctie op volwassen leeftijd, wat leidt tot aangeboren ziekten en chronisch nierfalen.

4. Materialen en methoden

4.1. Menselijke monsters

Monsters van foetaal nierweefsel werden verzameld na zwangerschapsverlies op de 14e, 15e, 16e, 22e en 38e GW op de afdeling Gynaecologie en Verloskunde van het Universitair Ziekenhuiscentrum Split. Al het verkregen foetale materiaal werd onderzocht door een patholoog en alleen weefsels zonder tekenen van afwijkingen, maceraties of intra-uteriene dood en met een normaal karyogram werden voor het onderzoek gebruikt. Medische dossiers van moeders werden onderzocht voorafgaand aan het verzamelen van monsters en in het geval van gezondheidsproblemen die de zwangerschapsuitkomst zouden kunnen beïnvloeden, werden nierweefsels uitgesloten van het onderzoek. De volwassenheid werd bepaald door hoofdomtrek, buikomtrek en dijbeenlengte [51] in correlatie met de menstruatiekalenders van patiënten. Monsters van 1.5- en 7- jaar oud nierweefsel werden verzameld na overlijden door een ongeval. De monsters werden verkregen op de afdeling Pathologie van het Universitair Ziekenhuiscentrum Split. De monsters van de multicystische dysplastische nierweefsels (MCDK) werden verkregen na zwangerschapsverlies, focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) en nefrotisch syndroom van het Finse type (CNF) werden verkregen als gevolg van nefrectomie. Al het verkregen materiaal werd onderzocht en beoordeeld door een patholoog, die de diagnoses classificeerde. Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de ethische commissie van de University of Split School of Medicine (20 mei 2016) in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de updates ervan (classificatienr.: 003-08/16-03/0001, registratienummer: 2181-198-03-04-16-0024, 20 mei 2016) [52].

4.2. Immunohistochemie

De verzamelde weefselmonsterfixatie werd 24 uur bij 22 C verwerkt met 4 procent paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Na dehydratatie in 100 procent ethanol werden monsters ingebed in paraffine, zoals eerder beschreven [53]. De monsters werden met behulp van een microtoom in coupes van 5 µm dik gesneden en vervolgens op objectglaasjes gemonteerd. Om weefselconservering te verifiëren, werd elke 10e sectie gekleurd met hematoxyline en eosine [54]. Depart-feminisatie en immunohistochemie werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [2,55,56]. Na spoelen in PBS werden microscoopglaasjes een nacht geïncubeerd met primaire antilichamen in een vochtige kamer bij 22 ◦C (StainTray-glaasjeskleuringssysteem; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS). De primaire antilichamen die werden gebruikt waren monoklonaal konijnen-anti-alfa-tubuline-antilichaam (verdunning 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, VK), polyklonaal konijnen-anti-inversie-antilichaam (verdunning 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, VK), monoklonale muizen DVL -1 antilichaam (1:150 verdunning; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS) en polyklonaal konijnen-anti-gamma-tubuline-antilichaam (om primaire cilia-specifieke kleuring met alfa- tubuline, 1:500 verdunning; ab11321, Abcam, Cambridge, VK). Na spoelen in PBS werden gedurende een uur secundaire antilichamen toegediend zoals vermeld: ezel anti-konijn IgG H&L, Alexa Fluor 488 (verdunning 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, VK) en geit anti-muis IgG H&L, TRITC (verdunning 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, VK) 4',6-diamidino-2-fenylindoldihydrochloride (DAPI) werd gebruikt voor het kleuren van de kernen en na een incubatie van 2-min. werden gewassen in PBS en bedekt met montagemedium en dekglaasjes. Niet-specifieke kleuring werd voorkomen door het gebruik van eiwitblok (ab64226; Abcam, Cambridge, VK) vóór de toepassing van het primaire antilichaam. Als negatieve controle werd een pre-adsorptietest uitgevoerd, terwijl de specificiteit van de secundaire antilichamen werd gecontroleerd door de primaire antilichamen uit de kleurprocedures weg te laten.

4.3. Elektronenmicroscopie

fixatie vannierweefsels werd gedurende 24 uur uitgevoerd in 4 procent paraformaldehyde, gevolgd door post-fixatie in 1 procent osmiumtetroxide gedurende 1 uur. Het dehydratatieproces werd uitgevoerd met ethanolreeksen en afgewerkt met inbedding in LX 112-hars [22]. Dunne coupes van één micrometer werden gekleurd met toluidineblauw en bestudeerd om ultradunne coupes te selecteren. Ultradunne coupes met een dikte van 0.05 micrometer werden onderzocht na kleuring met uranylacetaat en loodcitraat. De JEOL 1200 EX-microscoop werd gebruikt om de microfoto's te verkrijgen.

4.4. Genetische analyse

Zoals eerder beschreven [19], werd met behulp van leukocyten uit het perifere bloed genomisch DNA geëxtraheerd. Er werd een homozygote missense-mutatie in het NPHS1-gen gevonden (c.1096A > C; p.Ser366Arg) wat de diagnose van congenitaal nefrotisch syndroom van het Finse type (CNF) bevestigde [57].

CISTANCHE ZAL DE NIER/RENALE INFECTIE VERBETEREN

4.5. Gegevensanalyse

De sectie-analyse werd uitgevoerd op een FL-fluorescentiemicroscoop met behulp van 3 FL-fluorescentiekanalen (Olympus BX51, Tokyo, Japan). Beelden werden vastgelegd door digitale camera DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) met een krachtige (×40) vergroting. Alleen deniercortex met proximale gekronkelde tubuli (pct), distale gekronkelde tubuli (dct) en glomeruli (g) waren van belang. Beelden werden vervolgens verwerkt door ImageJ-software (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, VS, https://imagej.nih.gov/ij/ (toegankelijk op 15 oktober 2018), 1997-2021. ) en Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Californië, VS) voor verdere evaluatie. Voorafgaand aan het tellen van cellen werd de ImageJ-tool voor gesplitste kanalen gebruikt. Daarna werd de originele microscopische foto van de immunofluorescentie afgetrokken door het rode of groene kanaal (afhankelijk van wat het oorspronkelijke kanaal was) met behulp van de ImageJ-tool van de afbeeldingscalculator om signaallekkage te voorkomen. Waarden onder het drempelniveau 50 werden als negatief beschouwd. We telden immunoreactieve signalen in cellen van ten minste 20 structuren (pct, dct of g) per stadium of algemeen positief aantal cellen per microfoto van multicystische dysplastischenierweefsel, FSGS en CNF. We classificeerden cellen als positief als het immunofluorescentiesignaal zich ophoopte op elk niveau van het membraan, cytoplasma of kern boven waarde 50 gemeten op ImageJ-software met behulp van drempelopdracht. Negatieve cellen werden gecategoriseerd als cellen zonder enige immunoreactiviteit. Twee onafhankelijke onderzoekers analyseerden de gegevens.

4.6. Semi-kwantitatieve analyse

De intensiteit van -tubuline, inversie en DVL-1-kleuringssignaal werd geëvalueerd door twee onafhankelijke onderzoekers met behulp van ImageJ-software. De algehele signaalintensiteit werd gemeten nadat de afbeelding was ingesteld op 8-bit-type; daarna werd de intensiteit van markerkleuring geëvalueerd in 20 pct, dct en g door het omlijnde gebied van de structuur te meten. Als de resultaten tussen beoordelaars verschillend waren, verduidelijkte een derde onafhankelijke onderzoeker de twijfel. Maximale signaalintensiteit voor -tubuline was 84,125 ± 3,214 SD, voor inversie was 71,50 ± 2,715 SD en voor DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. De hoogste verzadiging van signaalkleur op de microscoopfoto's werd gemarkeerd als 3 (66,66-99,99 procent van de algehele signaalbeeldintensiteit), gevolgd door 2 (33,33-66,66 procent) voor de gemiddelde intensiteit van het signaal en 1 (0,33 procent -33,33 procent) voor lage signaalintensiteit (tabel 1.).

4.7. Statistische analyse

Voor de bepaling van verschillen tussen fasen en structuren werd de Kruskal-Wallis-test gedaan, gevolgd door Dunn's post hoc met behulp van GraphPad Prism-software (Graphpad Software Inc., San Diego, Californië, VS, www.graphpad.com (geraadpleegd op 15 oktober) 2018.)). Het aantal positieve cellen werd uitgedrukt in percentage als gemiddelde waarde ± standaarddeviatie (SD), terwijl statistische significantie werd erkend bij p <0,05. het="" aantal="" geanalyseerde="" structuren="" was="" 4200="" in="" 35="" monsters,="" met="" een="" totaal="" aantal="" van="" 135.256="" getelde="" cellen.="" we="" gebruikten="" 2-way="" anova="" met="" sidak's="" post="" hoc="" test="" om="" verschillen="" in="" expressie="" van="" -tubuline,="" inversie="" en="" dvl-1="" in="" verschillende="" ontwikkelingsstadia="" te="" testen.="" om="" eiwitexpressie="" met="" betrekking="" tot="" ontwikkelingstijd="" te="" bestuderen,="" hebben="" we="" lineaire="" regressie="" gebruikt.="" eenrichtings-anova="" gevolgd="" door="" tukey's="" post-hoctest="" werd="" gebruikt="" om="" de="" verschillen="" in="" expressie="" van="" -tubuline,="" inversie="" en="" dvl-1="" bij="">nierweefsel vergeleken met weefsels van MCDK, FSGS en CNF. Verschillen in expressie van eiwitten tussen MCDK, FSGS en CNF werden onderzocht met 2-way ANOVA gevolgd door Sidak's post hoc test. Eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest werd gebruikt om de verschillen in cilialengte en epitheelcelhoogte van pct tussen gezonde controle en pathologische controle te evalueren.nierweefsels. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde waarde ± standaarddeviatie (SD) met statistisch verschil erkend bij p <>