Genetica van osteopontine bij patiënten met chronische nierziekte: de Duitse studie naar chronische nierziekten Ⅳ

Basisvariabelen en metingen

Een gestandaardiseerde set biomarkers werd gemeten in een centraal gecertificeerd laboratorium met behulp van gestandaardiseerde protocollen [81]. Creatinine en albumine uit serum en urine werden onder meer gekwantificeerd met behulp van respectievelijk een IDMS-traceerbare methodologie (Creatinine plus, Roche, Duitsland) en een turbidimetrische methode (Tina-quant, Roche, Duitsland) Roche/Hitachi MODULAR P. De glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) werd geschat met behulp van de op creatinine gebaseerde CKD-EPI voor mula (eenheid: ml/min/1,73 m2, [82]). UACR werd berekend als gemeten urinealbumine/urinecreatinine (mg/g, [83]). Leeftijd en geslacht werden zelf gerapporteerd tijdens het basisbezoek. In 2015 werd OPN gemeten aan de hand van basisserummonsters van het volledige GCKD-studiecohort met behulp van een kwantitatieve sandwich-enzym-immunoassay-techniek (solid-phase ELISA; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 van R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, VK )). Kwantificering werd uitgevoerd aan het Instituut voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde, Greifswald, Duitsland. Variatiecoëfficiënten (intra-assay) waren respectievelijk 4,5%, 5,3% en 3,5% voor lage, mediane en hoge niveaus. De variatiecoëfficiënt tussen de tests was 6,4%. Reagentia en secundaire standaarden werden gebruikt zoals aanbevolen door de fabrikant.

BIOLOGISCH TRADITIONEEL KRUID VOOR DE GEZONDHEID VAN DE NIEREN

Genotypering, kwaliteitscontrole en imputatie

Gedetailleerde informatie over genotypering en het opschonen van gegevens in het GCKD-onderzoek is eerder beschreven [18]. In het kort werd DNA geïsoleerd uit volbloed en gegenotypeerd in 2.612.357 varianten voor 5.123 GCKD-deelnemers met behulp van de Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip-array (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module versie 1.9.4) in het Helmholtz Center München. Het opschonen van gegevens werd afzonderlijk uitgevoerd voor de Omni2.5-inhoud en de exome-chipinhoud van de array. Gebaseerd op gestandaardiseerde protocollen [84], werd op maat geschreven scripts (R, Perl) en Plink1.9 [85] software gebruikt voor kwaliteitscontrole (QC) van de Omni2.5-inhoud. Op steekproeven gebaseerde QC-stappen omvatten controles van het aantal oproepen, geslacht, heterozygotie, genetische afkomst en verwantschap, wat leidde tot de uitsluiting van 89 monsters. Op variantniveau werden single-nucleotide polymorphisms (SNP's) uitgesloten als de call rate dat was<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Genoombrede associatiestudie van veel voorkomende varianten

Zoals eerder gerapporteerd [17,18], werd GWAS uitgevoerd voor GCKD-deelnemers met volledige genotypering (Omni2.5), eGFR-, UACR- en log2(OPN)-metingsgegevens (N=4,897) met behulp van lineaire regressie van log2 (OPN) op SNP's (additief genetisch model) met een MAF <1%, aangepast voor leeftijd, geslacht, log(eGFR) en log(UACR) (S1 Fig). Associatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van SNPTEST v2.5 [89]. Samenvattende statistieken werden gecontroleerd op kwaliteit met behulp van GWAtoolbox [90] en op inflatie met behulp van genomische controle [91]. Er werd echter geen genomische controlecorrectie aangevraagd (λ=1.01). Associaties met een p-waarde<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Functionele annotatie van varianten werd uitgevoerd met behulp van ANNOVAR [92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] en RegulomeDB [96]. Regionale associatieplots werden uitgezet met behulp van LocusZoom v1.3 [97].

Fijn in kaart brengen

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Colokalisatieanalyses

Om de moleculaire mechanismen en geassocieerde fenotypes die ten grondslag liggen aan de associaties verder te begrijpen, hebben we colocalisatieanalyses uitgevoerd van de samenvattende OPN GWAS-statistieken gerelateerd aan de twee gerepliceerde OPN-loci met samenvattende GWAS-statistieken uit drie andere bronnen, zoals hieronder beschreven. Voor alle colocalisatieanalyses gebruikten we de 'coloc.fast'-functie uit het R-pakket gtx met standaardparameters en eerdere definities (https://github.com/tobyjohnson/gtx), een implementatie van een aangepaste versie van de colocalisatiemethode geïntroduceerd door Giambartolomei et al. [98]. We beschouwen een positieve colocalisatie wanneer de posterieure waarschijnlijkheid van een gedeelde causale variant op de associatielocus voor beide kenmerken (H4, p12) > 0.8 was.

Genexpressie.

Eerst hebben we samenvattende GWAS-statistieken van genexpressiegegevens van het GTEx-project [99] en de NEPTUNE-studie [100] gebruikt. De eQTL-gegevens van de GTEx V8 (49 weefsels) en de NEPTUNE-studie (NephQTL van glomerulus en tubulo-interstitiële niergedeelten) werden gedownload van de GTEx Portal (https://www.gtexportal.org/home/) en de NephQTL-website (http://www.gtexportal.org/home/). //nephqtl.org/), respectievelijk. De analysestappen van colokalisatie zijn elders in detail beschreven [17]. Ten eerste werden GWAS-samenvattingen van GTEx en NephQTL in genomische regio's ± 100 kb van de twee OPN-SNP's geëxtraheerd. De genen in de geëxtraheerde GWAS worden geïdentificeerd en voor elk gen wordt een cis-venster van 500 kb gedefinieerd dat het begin en het einde van het gen flankeert. Vervolgens werden voor elk dergelijk cis-genvenster, waarbij ten minste één SNP een associatie-p-waarde < 0,001 heeft, de GWAS-samenvattingen van GTEx- en NephQTL-weefsel evenals de OPN GWAS geëxtraheerd en gebruikt als invoer voor colocalisatieanalyse.