Hepatoprotectieve effecten van chitosan op door thioacetamide geïnduceerde levertoxiciteit bij mannelijke albinoratten

Voor meer informatie. contacttina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Chitosan, een natuurlijk product afgeleid van chitine, heeft veel aandacht getrokken als een veelbelovende polysacharideverbinding, vanwege zijn unieke biologische activiteiten. Deze studie was bedoeld om het mogelijke verbeteringspotentieel van chitosan, als natuurlijk zeeproduct, te onderzoekenlever regeneratiein hepatotoxiciteit veroorzaakt door thioacetamide bij mannelijke albinoratten. Vijftig dieren werden verdeeld in 5 groepen, waaronder de controlegroep; een groep die intraperitoneaal werd geïnjecteerd met een enkele dosis thioacetamide (300 mg/kg lichaamsgewicht) voor inductie van levertoxiciteit; een groep die 14 dagen een dieet met 5 procent chitosan kreeg; een groep kreeg 14 dagen lang een dieet met 5 procent chitosan, daarna kregen ze eenmaal thioacetamide (300 mg/kg lichaamsgewicht) en de laatste groep die werd geïnjecteerd met thioacetamide (300 mg/kg lichaamsgewicht) eenmaal een dieet met 5 procent chitosan gedurende 14 dagen. De biochemische resultaten lieten zien dat de inname van chitosan voor of na thioacetamide-intoxicatie de levermarkers (ALAT, ASAT, GGT, ALP, albumine) en nierfuncties verbeterde, en ook plasma-TNF-. QRT-PCR-analyse onthulde dat chitosan de kwantitatieve genexpressie van TNF-, survivine en c-Myc in de lever neerwaarts reguleerde. Bovendien verbeterde chitosan het histologische beeld van de lever. Deze studie wees op de veelbelovende werking van chitosan bij leverregeneratie.

Trefwoorden: thioaceetamide; chitosan; leverregeneratie; overleven; c-myc; tumornecrosefactor- .

1. Inleiding

Leverziektenzijn wereldwijd de meest levensbedreigende aandoeningen, vooral in Egypte [1]. In Egypte zijn leverziekten de belangrijkste oorzaak van jaarlijkse sterfgevallen [2, 3]. De lever is in hoge mate vatbaar voor toxiciteit vanwege zijn rol in het metabolisme van de meeste xenobiotica, zoals medicijnen en vreemde verbindingen. Gelukkig kan celproliferatie de lever helpen regenereren na groot celverlies [4,5]. Bijgevolg zijn alternatieve behandelingen essentiële vereisten om te vervangen of parallel aan de huidige regimes te worden gebruikt. Chitosan is een veelbelovende natuurlijke polysacharideverbinding. Het kan worden verkregen uit het schaalafval van krab, garnalen en langoesten en de celwand van schimmels.

Chitosan is een goede bron van voedingsvezels [6,7]. Het heeft tal van gezondheidsvoordelen, zoals immuniteitsregulatie, antitumoractiviteit, leverbescherming, antidiabetica en antioxidant [8]. antibacteriële, hypolipidemische, ontstekingsremmende [9], wondgenezingsactiviteiten [10,11] en hepatoprotectief effect [12I. Omdat het niet-toxisch is en een grote biologische afbreekbaarheid heeft, biedt chitosan grote voordelen bij het gebruik van oxidatieve stress [13].

Verontreinigd voedsel en blootstelling aan milieu- of chemische stoffen op het werk zijn mogelijke bronnen van giftige stoffen. Van die giftige verbindingen is thioacetamide (TAA), een veelgebruikte zwavelhoudende verbinding die in het milieu wordt aangetroffen als organische zwavelverbindingen en in veel technische toepassingen wordt gebruikt [14]. Het wordt ook gebruikt om leverfibrose bij ratten te induceren om het therapeutische effect van antifibrotische geneesmiddelen te bestuderen [15]. Normaal gesproken richt TAA zich op de lever en veroorzaakt daardoor leverbeschadiging door het produceren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) [16,17]. De thiosulfaatgroep van TAA wordt via het oxidasesysteem verder gemetaboliseerd om acetamide en TAA-S-oxide te vormen [18]. Daarna. TAA-S-dioxide wordt gevormd, dat covalent bindt aan de levermacromoleculen en leverbeschadiging initieert. Dit letsel heeft de vorm van centrilobulaire necrose [19] en van ROS-vorming, die samen celdood veroorzaken door oxidatieve stress [10,20]. Een enkele dosis TAA veroorzaakt hepatocytdegeneratie, infiltratie van ontstekingscellen en verhoogde het niveau van ALP, ALT en AST [21].

Apoptose is een normaal voorkomend celdoodmechanisme dat wordt gebruikt om gezonde weefsels te ontwikkelen en te behouden [22]. Veel ziekten kunnen worden ontwikkeld als gevolg van ontregelde apoptose, zoals kanker, neurodegeneratieve aandoeningen en immunodeficiëntieziekten. Interessant is dat apoptose zelf celproliferatie en weefselregeneratie zou kunnen stimuleren in een mechanisme dat bekend staat als door apoptose geïnduceerde proliferatie. Bovendien zou het apoptotische proces kunnen worden geblokkeerd door een groep familie-eiwitten die bekend staat als een remmer van apoptose-eiwitten (IAP's) door de caspase-activiteit te remmen. Er zijn acht geïdentificeerde leden van de IAP-familie in het zoogdiergenoom [23]. Het belangrijkste eiwit in deze familie is survivine, het kleinste lid van deze familie. Het wordt gecodeerd door het BIRC5-gen op chromosoom 17 in-band 17q25.3.c-myc-eiwit bleek sterk verhoogd te zijn in het regeneratieproces van de lever [24-26]. TNF- zou door twee tegengestelde mechanismen kunnen werken. Het zou kunnen fungeren als initiator van celdood; als alternatief zou het de celproliferatie kunnen verbeteren. Bijgevolg speelt het een belangrijke rol in de pathofysiologie van virale hepatitis en alcoholische en niet-alcoholische leverziekten [27,28].

De huidige studie onderzocht de potentie van chitosan bij het versterken van weefselregeneratie tegen levertoxiciteit geïnduceerd door TAA bij ratten. Het effect van chitosan op leverfuncties en nierfuncties werd bestudeerd. Daarnaast werden de metingen van het pro-inflammatoire cytokine TNF- in plasma en kwantitatieve analyse voor leverweefselgenexpressieniveaus van survivine, c-Myc-genen en TNF- gedaan. Daarnaast werd het histologische kenmerk van de lever onderzocht.

Cistanchekan de ultrastructuur van levercellen aanpassen, eiwitsynthese bevorderen en de lever beschermen.Fenylethanol totaal glycosidenkan de hoeveelheid leverglycogeen verhogen,echinacosidekan de activiteit van graszoden verbeteren en verbascoside kan vrije radicalen wegvangen en stamcelapoptose verminderen. Cistanche kan ook de bloedsomloop reguleren en heeft de volgende effecten: beschermen ischemisch myocardium; lagere bloedlipiden, weerstand tegen atherosclerose en weerstand tegen trombose; perifere vasculaire weerstand verminderen, perifere bloedvaten verwijden en de bloeddruk verlagen; beschermen de lever en weerstaan ​​leververvetting.

2. materialen en methoden

2.1.Chemische stoffen.

TAA werd gekocht bij Aldrich Chem Co., Engeland, als zuivere kristallen; het werd vóór elke injectie opgelost in zoutoplossing en vers bereid.

Chitosan (CS) werd verkregen van Sigma-Aldrich (molecuulgewicht=100 KDa). Chitosan, een belangrijk polysacharide van mariene oorsprong, wordt bereid uit de schaal van schaaldieren en wordt gebruikt als een nieuwe bron van voedingsvezels bij de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege zijn intrinsieke veiligheid bij orale inname [29].

2.2.Experimenteel ontwerp.

Vijftig volwassen mannelijke Wistar albinoratten met een gewicht van ongeveer 120-150 g werden verkregen van de Animal House Colony van het National Research Centre, Caïro, Egypte. De dieren werden in roestvrijstalen kooien gehouden onder standaard laboratoriumomstandigheden met goede ventilatie en een 12-uur licht-donkercyclus, met een relatieve vochtigheid van 60 ± 5 procent, met vrije toegang tot standaard commercieel laboratoriumvoedsel en kraanwater.

Vóór het begin van het experimentele protocol werden ratten gedurende 2 weken aangepast aan experimentele omstandigheden. Menselijke zorg werd toegepast volgens de criteria van de standaardinstelling voor de verzorging en het gebruik van proefdieren volgens de methode die is bevestigd door de ethische commissie van het National Research Center (FWA 00014747), die de aanbevelingen van de National Institutes of Health Guide bijhoudt voor de verzorging en het gebruik van dieren in laboratoria (publicatie nr. 85-23, herzien in 1985).

De dieren werden na de acclimatisatieperiode (elk 10 ratten) als volgt in vijf groepen verdeeld:

Groep (1): normale gezonde dieren dienden als controlegroep.

Groep (2):(TAA)groep waarin de ratten intraperitoneaal werden geïnjecteerd met TAA (opgelost in 0,9 procent normale zoutoplossing) in een enkele dosis (300 mg/kg lg) volgens Mustafa et al. [30] voor inductie van levertoxiciteit.

Groep (3): chitosangroep waarin dieren chitosan gemengd basaal dieet kregen in een verhouding van 5 procent (50 g plus 950 g basaal dieet) volgens AboZaid et al. [9] voor 14 dagen.

Groep (4): chitosan en vervolgens TAA-groep waarin de dieren gedurende 14 dagen een dieet kregen dat 5 procent chitosan 9] bevatte en vervolgens intraperitoneaal geïnjecteerd met een enkele dosis TAA (300 mg/kg lg) zoals hierboven vermeld.

Groep (5): TAA en vervolgens de chitosangroep waarin de dieren intraperitoneaal werden geïnjecteerd met een enkele dosis TAA (300 mg/kgb.w) zoals hierboven vermeld, en vervolgens gedurende 14 dagen een dieet kregen dat 5 procent chitosan bevatte.

Het lichaamsgewicht van elk dier werd elke week en aan het einde van het experiment geregistreerd om de verandering van het lichaamsgewicht te volgen. Aan het einde van de experimentele periode vastten de dieren gedurende 12 uur. Daarna werden ze verdoofd via inhalatie van diethylether; bloedmonsters werden genomen uit retro-orbitale veneuze plexus in centrifugebuizen met behulp van gehepariniseerde steriele glazen capillairen.

Voor de scheiding van plasma werd een deel van alle bloedmonsters geassembleerd op EDTA, het andere deel werd geassembleerd in een buis die vrij is van anticoagulantia om het serum te scheiden. Zowel serum- als plasmamonsters werden gescheiden door middel van koelcentrifugeren bij 3000 rpm gedurende 15 minuten bij 4 graden. Porties van plasma en serum werden bewaard op -20 graad voor biochemische analyse.

Zodra het bloed is verzameld, werden de dieren opgeofferd door middel van cervicale onthoofding

De lever van elke rat werd verwijderd en grondig gewassen met behulp van isotone zoutoplossing, gedroogd en in twee secties verdeeld; de eerste sectie werd direct ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard op -80 graad voorafgaand aan RNA-isolatie voor analyse van genexpressie. Daarentegen werd het tweede deel gefixeerd in formele zoutoplossing (10 procent) om te worden gebruikt bij histopathologisch onderzoek.

2.3.Biochemische analyse.

Serum aspartaat aminotransferase (ASAT), alanine aminotransferase (ALAT), alkalische fosfatase (ALP), en gamma-glutamyl transferase (GGT) activiteiten, evenals albumine

ureum- en creatinineniveaus werden spectrofotometrisch geschat met behulp van reagenskits die waren gekocht bij bio-diagnostic Co., Egypte. De concentratie van plasmatumornecrosefactor-alfa (TNF-a) werd geschat via ELISA-techniek met behulp van een rat-TNF-ELISA-kit gekocht bij Glory Science Co., Ltd., VS.

2.4. Genexpressie analyse.

Met behulp van een kwantitatieve analyse (Real-Time PCR) werd de expressie van survivine-, c-Myc- en TNF-genen bepaald in leverweefselmonsters.

2.4.1. RNA-isolatie, opruimen en kwantitatieve realtime RT-PCR.

RNA werd geïsoleerd uit een leverweefselmonster van 100 mg door Qiazol-buffer (Qiagen, VS); RNA werd vervolgens opgeschoond met behulp van RNAeasy Mini-kit (Qiagen, VS); RNA werd omgekeerd getranscribeerd en het resulterende cDNA werd vervolgens geamplificeerd. -actine-, survivine-, c-myc- en TNF-alfa-genkopie-aantallen werden gekwantificeerd met behulp van de QuantiFast Sybergreen RT-PCR-kit (Qiagen, VS). Alle monsters werden in drievoud uitgevoerd en de kopieaantallen werden genormaliseerd tot 100,{6}} kopieën van het huishoud-bèta-actine-gen. De primersequenties staan ​​vermeld in Tabel 1. De RT- en daaropvolgende PCR-cyclusomstandigheden waren als volgt: 50 graden gedurende 10 min, 95 graden gedurende 5 minuten, 95 graden gedurende 15 seconden, vervolgens 60 graden gedurende 30 seconden, het aantal cycli was 40 cycli . MiniOpticonTM Bio-Rad Real-Time Thermal Cycler werd gebruikt voor het kwantificeren van genexpressie.

2.5. Histopathologisch onderzoek.

Na de fixatie van leverweefsels in 10 procent formele zoutoplossing gedurende vierentwintig uur, werden weefselmonsters gewassen in huidig ​​kraanwater; vervolgens onderworpen aan dehydratatie met behulp van ethyl (seriële verdunningen naar boven tot absolute ethyl). Monsters werden geklaard in xyleen en gedurende 24 uur bij 56 graden in paraffine ingebed in een heteluchtoven. De was-weefselblokken werden bereid voor coupes met een dikte van 4 micron door middel van een slibmicrotoom. De coupes werden van paraffine ontdaan, gekleurd met hematoxyline en eosine en uiteindelijk onderzocht via een elektrische lichtmicroscoop [31].

2.6. Statistische analyse.

Gegevens werden geanalyseerd met behulp van versie 13 van het computergebaseerde statistische pakket voor sociale wetenschappen. Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie van het verschil werd bepaald met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door een LSD-post-hocvergelijkingstest bij p Kleiner dan of gelijk aan 0.05, wat werd gedefinieerd als statistisch significant.

3. Resultaten en discussies

3.1.Resultaten.

De gegevens in figuur 1 toonden aan dat de toename van het lichaamsgewicht van de groep met TAA-dronken dieren significant was afgenomen (-308,5 procent), terwijl die van de groep met alleen chitosan significante verandering liet zien (50 procent) wanneer beide groepen werden behandeld. vergeleken met de controlegroep. Interessant is dat de chitosan- en vervolgens TAA-dierengroep een significante stijging (289,7 procent) in de lichaamsgewichtstoename liet zien; op dezelfde manier vertoonde de TAA- en vervolgens de chitosan-dierengroep een significante toename (239,56 procent) in de lichaamsgewichtstoename wanneer beide groepen werden vergeleken met de met TAA bedwelmde dierengroep.

Wat betreft leverfunctietesten, het voeden van normale ratten met een 5 procent chitosan-basaal dieet gedurende 14 dagen gaf geen aanleiding tot gestoorde lever- of nierfunctietests die hun veilige effect bij die concentratie in het dieet weerspiegelen; integendeel, door TAA geïnduceerde levertoxiciteit bij ratten verhoogde significant (94,47 procent) de activiteit van aspartaataminotransferase (ASAT) in serum in vergelijking met de controlegroep. Er werd echter een significante afname (-32 procent en -15,4 procent) in serum ASAT-activiteit geregistreerd in beide met chitosan gevoede regimes (respectievelijk chitosan-TAA- en TAA-chitosan-groepen) in vergelijking met de TAA-bedwelmde groep. Een significante toename (91,89 procent) in serum-alanine-aminotransferase (ALAT)-activiteit werd geregistreerd in de TAA-groep in vergelijking met de controlegroep. In een veelbelovend effect leidden chitosan, vervolgens TAA en TAA en vervolgens chitosan-groepen tot een significante afname (respectievelijk -40,8 procent en 32,3 procent) in serum (ALAT)-activiteit in vergelijking met de TAA-groep. Evenzo werd een significante toename (232,9 procent) in serum alkalische fosfatase (ALP)-activiteit gedetecteerd in de TAA-bedwelmde diergroep in vergelijking met de controlegroep. Het is gunstig dat het voeren van ratten met een gemengd chitosan-dieet gedurende 14 dagen vóór intoxicatie met TAA resulteerde in een significante afname (-54,06 procent) van de serum-ALP-activiteit; ook werd een significante vermindering (-50,6 procent) van de serum-ALP-activiteit geregistreerd in de groep van dieren die gemengd chitosan-dieet kregen na TAA-intoxicatie, wanneer beide diergroepen werden vergeleken met de groep die alleen met TAA was behandeld.

Met betrekking tot de activiteit van serum-gamma-glutamyltransferase (GGT), verhoogde TAA-geïnduceerde levertoxiciteit de activiteit van serum-GGT significant (223,5 procent), terwijl de met chitosan behandelde diergroep zijn activiteit niet verslechterde wanneer beide groepen werden vergeleken met die van de controlegroep. Interessant is dat dieren eerder een gemengd chitosan-dieet kregen

TAA-intoxicatie vertoonde een significante vermindering (-50,28 procent) van de serum-GGT-activiteit; op dezelfde manier werd een significante afname (-41.0 procent o) in GGT-activiteit opgemerkt in de groep dieren die dronken waren van TAA voordat ze een gemengd chitosan-dieet kregen, toen beide werden vergeleken met de TAA- dronken groep. Serumalbuminespiegel was significant verlaagd (-36,58 procent) na TAA-injectie (TAA-groep), terwijl de chitosangroep een onbeduidende verandering (2,4 procent o) in serumalbuminespiegel liet zien wanneer beide groepen werden vergeleken met de controlegroep . Het voeren van de dieren met chitosan met verschillende regimes, zowel voor als na TAA-intoxicatie, onthulde echter een significante verhoging (respectievelijk 50 procent en 38,4 procent) in serumalbuminespiegels wanneer beide werden vergeleken met de TAA-groep (tabel 2).

Met betrekking tot nierfunctietestes (Tabel 2) werd een significante stijging (82,67% en 232,77%) waargenomen in respectievelijk zowel ureum- als creatinineserumspiegels in de TAA-bedwelmde groep; ondertussen vertoonde de met chitosan behandelde groep een onbeduidende verandering (respectievelijk 19,3 procent en -15 procent) wanneer beide groepen werden vergeleken met de controlegroep. Op een veelbelovende manier vertoonde chitosan en vervolgens de TAA-dierengroep een significante afname (-36,04 procent en -45,2 procent) in serumspiegels van respectievelijk ureum en creatinine in vergelijking met de TAA-groep . Bovendien illustreerde het voeren van de ratten met een chitosan gemengd dieet gedurende 14 dagen na TAA-intoxicatie een significante afname (-30,6 procent en -35,10 procent) in serumspiegels van zowel ureum als creatinine, respectievelijk wanneer beide groepen werden vergeleken met de met TAA behandelde dierengroep.

Zoals geïllustreerd in figuur (2), werd een significante verhoging (98,26 procent) geregistreerd in de tumornecrosefactor alfa(TNF-)-spiegel van de groep met TAA-bedwelmde dieren; terwijl de chitosangroep een onbeduidende verandering (-2,6 procent) in plasma TNF-niveau vertoonde wanneer de groepen van beide dieren werden vergeleken met de controlegroep. Op een favoriete manier liet het voeren van de dieren met een gemengd chitosan-dieet met verschillende regimes, zowel voor als na TAA-intoxicatie, een significante afname zien (respectievelijk -36,6 procent en -31,57 procent ) in plasmaniveau van TNF- wanneer beide werden vergeleken met de TAA-groep.

3.1.1. Genexpressie.

Zoals geïllustreerd in figuur 3, vertoonde de groep met TAA-bedwelmde dieren een significante vermindering (-81 procent) van de genexpressie van de survivinelever, terwijl de groep met alleen chitosan onbeduidende veranderingen in de genexpressie van de survivinelever uitvoerde wanneer beide groepen werden vergeleken met de controlegroep. Helaas vertoonden zowel chitosan, daarna TAA en TAA, daarna met chitosan behandelde dierengroepen geen merkbare veranderingen (respectievelijk 1,27 procent en -3,2 procent) in die genexpressie in vergelijking met de met TAA bedwelmde dieren groep.

Met betrekking tot c-myc-genexpressie vertoonde de groep met alleen chitosan een significante verhoging (400 procent). De groep met TAA-dronken dieren had echter geen invloed (0,0 procent o) op de expressie van dat gen wanneer beide groepen werden vergeleken met de controlegroep. Bovendien vertoonden zowel de chitosan-, vervolgens de TAA- als de TAA- en vervolgens de chitosangroepen een significante toename (respectievelijk 300 en 700 procent) in c-myc-genexpressieniveaus vergeleken met de TAA-groep (Figuur 4).

Uit de gegevens bleek dat de met chitosan behandelde groep dieren slechts een duidelijke verhoging (73,33 procent) van het TNF-genexpressieniveau in de lever registreerde; bovendien vertoonde de groep met TAA-dronken dieren een significante verhoging (368,3 procent) bij vergelijking van beide groepen met de controlegroep. Deze verhoging was significant verminderd (respectievelijk -66,5 procent & -57,3 procent) met chitosanbehandeling, hetzij voor of na TAA-intoxicatie, vergeleken met de TAA-dierengroep (Figuur 5).

3.1.2.Histologische bevinding.

De normale controlegroep vertoonde een normale leverweefselarchitectuur met de normale centrale ader, geconserveerd portaalkanaal met minimaleopruiendcellen, en meestal normale hepatocyten (Figuur 6). Ondertussen onthulden de onderzoeken van de TAA-groep leververslechteringen vertegenwoordigd door gevacuoleerde hepatocytencellen, verwijde verstopte centrale ader verwijde verstopte portaalkanaal en gemodereerde verspreide ontstekingscellen (Figuur 7). De chitosan-geneesmiddelgroepen vertoonden een normale leverweefselarchitectuur met een licht verwijd, centraal, normaal portaalkanaal met minimale ontstekingscellen en normale hepatocyten (Figuur 8). Chitosan en vervolgens de TAA-groep onthulden vervormde verwijde centrale ader, verspreide ontstekingscellen en verwijde verstopte sinusoïdale ruimten, duidelijke degeneratie van hepatocyten met vetachtige veranderingen en toegenomen dikte van de hepatocyten (meer dan 2 cellen dik) (Figuur 9). Bovendien vertoonde de TAA- en vervolgens de chitosangroep verstopte verwijde centrale ader verspreide ontstekingscellen, duidelijke verwijde verstopte portaalkanaal en verspreide gedegenereerde hepatocyten (Figuur 10).

3.2.Discussie.

De lever vertegenwoordigt de grootste klier in het lichaam, waar het veel biologische processen regelt die energie vereisen, zoals metabolisme, biosynthese, uitscheiding, secretie en ontgifting. Deze grote energiebehoefte maakt de lever tot een sterk zuurstofafhankelijk weefsel. Na een enorm cellulair verlies helpt celproliferatie bij leverregeneratie. Regeneratie kan echter mislukken als het verlies bepaalde limieten overschrijdt, met leverfalen en uiteindelijk de dood tot gevolg 32].

Er zijn veel onderzoeken uitgevoerd om de effecten van antioxidanten op het verbeteren van leverziekten en het ondersteunen van de normale lever te testen. Antioxidanten zijn naar voren gekomen als een therapeutische optie voor het behandelen en voorkomen van levensstijlgerelateerde ziekten. Het heeft echter verdere studies nodig om zijn werkingsmechanisme op te helderen 33,34]. Chitosan (CS) is een waardevol zeepolysacharide dat wordt gewonnen uit de schelpen van sommige schaaldieren. Het heeft veel gevestigde biologische voordelen, zoals immuniteitsregulatie, antitumor-, leverbescherming, antidiabetische, antibacteriële, antioxiderende, anti-obesitas, wondgenezende werking en hypolipidemisch effect [5].

De huidige studie onderzocht de beschermende en therapeutische werkzaamheid van chitosan bij het versterken van weefselregeneratie in TAA-geïnduceerde levertoxiciteit bij ratten. TAA wordt traditioneel gebruikt om leverbeschadiging te induceren in experimentele diermodellen [15,35]. Het toxische effect van TAA is te wijten aan zijn metabolieten zoals acetamide, sulfaat en van sulfoxide afgeleide componenten. Deze metaboliet veroorzaakt structurele vervormingen van de structurele eiwitten en enzymen, wat resulteert in hun inactivatie. Door zijn rol verandert de TAA-metaboliet de celpermeabiliteit, vergroot het nucleair volume, concentreert het intracellulair calcium en remt de mitochondriale activiteit, wat resulteert in celdood. Door deze metaboliet worden de leukotriënen, als een krachtige ontstekingsmediator die wordt uitgescheiden door de levercellen, aangetast [36].

In deze studie had behandeling met chitosan een positieve invloed op de leverenzymen. In tegenstelling tot en zoals verwacht effecten van TAA-intoxicatie, vertoonden de activiteiten van serum ASAT, ALAT, ALP en GGT een significante toename in de met TAA behandelde groep vergeleken met normale controle. Deze resultaten zijn in overeenstemming met Baskaran et al. [37], Jain en Singhai [38,39]Osama et al. [40], die de verhoging van de activiteit van serumtransaminasen in verband bracht met de oxidatieve stress en lipideperoxidatie die het gevolg is van het toxische effect van TAA, waarbij lipiden, eiwitten en DNA worden beschadigd door de werking van vrije radicalen, wat resulteert in hepatocellulaire beschadiging en necrose. Normaal gesproken lozen necrotische cellen hun inhoud in de bloedbaan, wat resulteert in een toename van de activiteit van transaminasen. Aan de andere kant vertoonden beschermende en curatieve groepen behandeld met chitosan een duidelijke neerwaartse regulatie in ALAT-, ASAT-, ALP- en GGT-activiteiten die kunnen worden toegeschreven aan antioxidanten, immunomodulatie en/of wondgenezing en leverbescherming van chitosan [9]. Evenzo was de serumalbuminespiegel verlaagd bij met TAA bedwelmde ratten als gevolg van leverdisfunctie van eiwitsynthese als gevolg van het verstoorde endoplasmatisch reticulum en mitochondriën van hepatocyten. Dit niveau werd echter opgereguleerd en genormaliseerd met behandeling met chitosan, hetzij in beschermende of curatieve groepen.

TAA-intoxicatie leidde tot nierfunctie-insufficiëntie aangezien de serumureum- en creatininespiegels verhoogd waren; deze verslechtering is gekweld door Begum et al. 41], die tubulair letsel bij acute tubulaire necrose rapporteerde, is voornamelijk verantwoordelijk voor de verminderde glomerulaire filtratie. Er werd ook gesuggereerd dat de betrokken tubulaire afwijkingen verstopping van tubuli zijn, waardoor het glomerulaire filtraat terugstroomt. Dus nierverandering bij met TAA behandelde ratten kan te wijten zijn aan de schadelijke effecten van ROS. Deze toename werd echter ongedaan gemaakt na behandeling met chitosan als een beschermende of curatieve behandeling. Deze observatie is in overeenstemming met die van Mohamed [42], die rapporteerde dat de inname van chitosan de ureum- en creatininespiegels bij patiënten met nierfalen significant verlaagde en dit effect toeschreef aan een of twee mogelijke mechanismen: de eerste is de activering van de nierfunctie voor klaring van stikstofmetaboliet resulterend in verlaging van ureum en creatinine, terwijl de tweede mogelijkheid is dat chitosan combineert met stikstofmetaboliet in het spijsverteringskanaal en vervolgens wordt uitgescheiden, wat resulteert in verlaging van ureum en creatinine.

In de huidige studie verminderde de acute toxiciteit van TAA de survivine-genexpressie in leverweefsel aanzienlijk in vergelijking met de controlegroep. Het voeren van dieren met een chitosan-gemengd basaal dieet, als medicijncontrole en als een beschermende behandeling vóór TAA-toxiciteit, resulteerde echter in een niet-significante toename van de survivine-genexpressieniveaus. Survivin heeft een gevestigde functie in de celcyclus G2/M-fase; tijdens celdeling compromitteert survivine een subeenheid van het chromosomale passagierscomplex [43,44]. Survivine wordt tot expressie gebracht in normaal prolifererende en regenererende weefsels en er is gemeld dat het apoptose onderdrukt en helpt bij de voortgang van de celcyclus [45]. Survivine-expressie bleek een positieve associatie te hebben met het aantal hepatocyten in de regenererende lever. Dit kan worden verklaard door de bevinding dat survivine betrokken is bij de scheiding van zusterchromatiden tijdens mitose 46]; deze feiten kunnen de reductie in survivine-genexpressie hier in post-TAA-intoxicatie interpreteren. Hageman et al. [46] rapporteerde dat wanneer de survivine-expressie wordt verminderd, de lokalisatie van chromosomale passagierscomplexleden wordt onderbroken, en daarom, met verminderde Aurur B-activiteit, de fosforylering van centromere doeleiwitten en cytokineseprocessen worden aangetast.

In eerdere onderzoeken bij knaagdieren was de survivine-expressie significant verhoogd na gedeeltelijke hepatectomie en postoperatief. Bovendien bleek de survivine-expressie verhoogd te zijn in het transplantaat bij menselijke levertransplantatie. Zowel bij knaagdieren als mensen wordt overexpressie van survivine geassocieerd met proliferatie en niet met apoptose; bijgevolg is survivine belangrijk bij de proliferatie en mitose van hepatocyten, niet alleen bij regeneratie maar ook tijdens normale ontwikkeling [46].

Door TAA geïnduceerde acute toxiciteit had geen duidelijke invloed op het c-myc-genexpressieniveau in leverweefsel. Inderdaad, behandeling met chitosan als geneesmiddelcontrole, beschermende of curatieve behandeling verhoogde het c-myc-genexpressieniveau aanzienlijk en dramatisch. Er werd gemeld dat ontwikkelings- en mitogene signalen in normale, niet-getransformeerde cellen c-myc-expressie reguleren [47]. De belangrijkste rollen van c-myc zijn het versterken van celproliferatie en het belemmeren van celdifferentiatie. Celcyclusprogressie bleek te worden verbeterd door c-myc via het reguleren van veel celcyclusregulerende eiwitten zoals cyclines (D, E, A en B1) en cycline-afhankelijke kinasen (CDK1.2. 4,6), naast E2F-transcriptiefactoren. Aan de andere kant bleek c-myc op veel manieren de activiteit van celcyclusblokkers, zoals p15, p21 en p27, te onderdrukken [48].

De afname in gewicht en prolifererend celkernantigeen is geassocieerd met de afname in c-myc-eiwitexpressie tijdens leverregeneratie. Bovendien was het celcyclus-regulerende eiwit p53 en het aantal cellen in de G2-fase van de celcyclus sterk verminderd. Bijgevolg wordt c-myc beschouwd als een sterke positieve regulator van celproliferatie. Bovendien bleek c-myc-antisense de leverregeneratie bij ratten te beperken [24,26].

Evenzo bleek in nierweefsel het c-mycgen te worden geactiveerd in niertubuluscellen tijdens regeneratie en na foliumzuur-geïnduceerde nierbeschadiging in Vivo [49]. C-myc bleek ook de eiwitbiosynthese te bevorderen, waarbij de eiwitsynthese driemaal hoger was in fibroblasten die c-myc tot overexpressie brengen dan die in hun natuurlijke cellijnen. C-myc oefent deze actie uit door ribosoomtranscriptie en biogenese te reguleren; ook werkt c-myc in coördinatie met nucleaire RNA-polymerasen (RNA pol I en III) om ribosoombiogenese en translatie te reguleren.

Daarnaast werd de transcriptie van ribosomaal RNA gestimuleerd door c-myc, dat de eiwitsynthese activeert [50].

In de huidige onderzoeken resulteerde de acute toxiciteit van TAA in een significante toename van TNF-genexpressieniveaus in leverweefsel en verhoogde plasmaspiegels, terwijl deze toename significant werd gedownreguleerd na behandeling met chitosan, zowel als beschermende als curatieve behandelingen in vergelijking met de TAA- dronken groep. Deze bevinding is in overeenstemming met de eerdere observatie van Park et al. [51], die een verbeterend effect van chitosan op het TNF-niveau rapporteerde. Zhang et al. [52] meldde dat verknoopt carboxymethylchitosan de activiteit van ontstekingsfactorenzymen aan het begin van de behandeling verhoogde; het herstelt ze daarna echter naar hun normale niveau. Ze suggereerden wondhelende effecten van verknoopt carboxymethylchitosan door zijn neerwaartse regulerende effecten op de leverenzymactiviteit van ratten.

TNF- wordt geproduceerd uit neuronale cellen, fibroblasten, lymfoïde cellen, mestcellen, endotheelcellen en macrofagen. TNF- medieert zijn pro-inflammatoire en pro-apoptotische effecten door de interactie met hun membraanreceptoren (TNF-R1 en TNF-R2). Beide receptoren mediëren twee verschillende signaalroutes, en de activering van de ene gaat gepaard met de inactivering van de andere [51].

Onze resultaten suggereren een positieve rol van chitosan bij weefselregeneratie, wat in overeenstemming is met Shilpa et al. [53], die ontdekten dat de behandeling van gedeeltelijk gehepatectomiseerde ratten met chitosan-nanodeeltjes en gamma-aminoboterzuur de opname van getritieerd thymidine verhoogde in vergelijking met gedeeltelijk gehepatectomiseerde groepen zonder nanodeeltjes behandeling. Het algemene resultaat van behandeling met chitosan-nanodeeltjes in combinatie met gamma-aminoboterzuur is de verbetering van hepatocytregeneratie en verminderde celdood in vergelijking met ratten die gehepatectomiseerd waren. De huidige resultaten zijn ook in overeenstemming met Chen et al. [54], die rapporteerde dat chitosan-nanodeeltjes de leverregeneratie verbeterden bij ratten die leden aan acuut leverfalen. De matrixbindingscapaciteit van chitosan maakt de groei en activering van macrofagen mogelijk, wat nodig is voor weefselregeneratie. Een wond die werd uitgevoerd bij een met chitosan behandeld hondendier vertoonde na drie weken volledige genezing. In de met zoutoplossing behandelde controlegroep duurt echter alleen het uithardingsproces vier weken. In de met chitosan behandelde groep werd een keratinelaag gevormd als bewijs van bindweefselregeneratie. Bovendien werd een netwerk van collageenvezels gevormd om de neovasculatuur van de wond te bewaken [55].

In de huidige studie onthulde de histologische bevinding een verslechterd leverweefselpatroon in de TAA-groep; dit patroon werd echter sterk verbeterd in de chitosan-beschermende groep en op de een of andere manier in de curatieve chitosan-groep.

4. Conclusies

Er wordt geconcludeerd dat chitosan de leverregeneratie kan verbeteren bij door TAA geïnduceerde levertoxiciteit, hetzij als curatief of proliferatief. Bovendien vertoonde het een ontstekingsremmend effect omdat het de TNF-spiegel verlaagde, zowel op gen- als eiwitniveau. Daarentegen verhoogde chitosan de genexpressie van survivine en c-myc, die versterkers zijn van celproliferatie. Verdere studies zouden kunnen worden uitgevoerd om het exacte mechanisme op te helderen waarmee chitosan c-myc-, survivine- en TNFC-genexpressie beïnvloedt. Daarom wordt chitosan aanbevolen voor gebruik bij leveraandoeningen waarbij weefselregeneratie nodig is.