We hebben eerder ontdekt dat nier-infiltrerende T-cellen (KIT's) bij murine lupus nefritis (LN) leken opdisfunctionele T-cellen die tumoren infiltreren. Deze onverwachte bevinding riep de vraag op hoeom het "uitgeputte" fenotype van KIT's te verzoenen met aanhoudende weefselvernietiging in LN. Adresserenhiervoor hebben we eencellige RNA-Seq en TCR-Seq van KIT's uitgevoerd in murine lupus-modellen. We hebben gevondendie CD8plusKIT's bestonden eerst in een overgangstoestand, voordat ze zich klonaal uitbreidden en evolueerden naaruitputting. Aan de andere kant, CD4plusKIT's pasten niet in de huidige differentiatieparadigma'smaar omvatte zowel hypoxische als cytotoxische subsets met een alomtegenwoordige uitputtingssignatuur. Dus,auto-immuun nefritis is anders dan acute immuniteit tegen pathogenen; eerder de micro-omgeving van de nierenonderdrukt T-cellen door geleidelijk uitgeputte toestanden te induceren. Onze bevindingen suggereren dat LN, achronische aandoening, het resultaat van de langzame evolutie van schade veroorzaakt door disfunctionele T-cellen en hunvoorlopers op weg naar uitputting. Deze bevindingen hebben implicaties voor zowel auto-immuniteit alstumor immunologie.

Volgens relevante studies is cistanche een traditioneel Chinees kruid dat al eeuwenlang wordt gebruikt om verschillende ziekten te behandelen. Het is wetenschappelijk bewezen dat het ontstekingsremmende, anti-aging en antioxiderende eigenschappen bezit. Studies hebben aangetoond dat cistanche gunstig is voor patiënten die lijden aan een nieraandoening. Van de actieve ingrediënten van cistanche is bekend dat ze ontstekingen verminderen, de nierfunctie verbeteren en aangetaste niercellen herstellen. Het integreren van cistanche in een behandelplan voor nierziekte kan patiënten dus grote voordelen bieden bij het beheersen van hun aandoening. Cistanche helpt proteïnurie te verminderen, verlaagt BUN- en creatininespiegels en vermindert het risico op verdere nierbeschadiging. Bovendien helpt cistanche ook het cholesterol- en triglyceridengehalte te verlagen, wat gevaarlijk kan zijn voor patiënten met een nieraandoening.

Klik hier om de producten van Cistanche voor nierziekte te bekijken

【Voor meer info: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Invoering

Infiltratie van solide organen door vermoedelijk pathogene T-cellen is een veelvoorkomend kenmerk bij veel auto-immuunziekten en afstoting van orgaantransplantaten. Deze pathogene gebeurtenissen lopen histologisch en conceptueel parallel met T-celinfiltratie van tumoren, wat kan leiden tot vernietiging van tumorcellen. In tegenstelling tot de goed bestudeerde tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's), hebben weefsel-infiltrerende T-cellen die ziekte bij auto-immuniteit mediëren echter veel minder aandacht gekregen. Het is nu algemeen aanvaard dat de micro-omgeving van de tumor functioneert om immuunresponsen te remmen en uitputting van T-cellen te induceren (1-3), terwijl bij auto-immuniteit algemeen wordt aangenomen dat pathogene T-cellen actief normaal weefsel ongehinderd vernietigen, aangezien niet-kwaadaardige weefsels geen weerstand kunnen ontwikkelen. Om de aard van auto-immuuninfiltraten te onderzoeken, hebben we ervoor gekozen om lupus nefritis (LN) te bestuderen, aangezien de nier een cruciaal doelwit is bij deze auto-immuunziekte. T-celafhankelijke interstitiële nefritis is de belangrijkste prognostische indicator van orgaanfalen bij lupus (4, 5).

Ons recente werk dat aantoont dat nier-infiltrerende T-cellen (KIT's) functioneel en transcriptioneel uitgeput zijn (6) - vergelijkbaar met TIL's of CD8 plus T-cellen na een chronische virale infectie - daagt 2 paradigma's uit. Ten eerste pleit het tegen het idee dat auto-immuunvernietiging van parenchymaal weefsel een direct effectorproces is, vergelijkbaar met een reactie op viraal geïnfecteerde cellen. In plaats daarvan kunnen sommige weefsels zijn voorzien van natuurlijke zelfbehoudmechanismen die infiltrerende T-cellen downreguleren of onderdrukken, wat auto-immuniteit kan voorkomen of verzwakken. Ten tweede suggereert het dat tumoren niet de novo een reeks routes ontwikkelen om T-cellen negatief te reguleren. In plaats daarvan kunnen dergelijke routes inheems zijn in bepaalde parenchymale weefsels, en tumoren kunnen ze versterken of ze gewoon van nature tot expressie brengen.

De ontdekking dat nieren en misschien ook andere weefsels infiltrerende T-cellen kunnen onderdrukken, deed een belangrijke vraag rijzen: als KIT's functioneel en transcriptioneel inert of uitgeput zijn, door welke mechanismen ontstaat weefselbeschadiging dan? Een hypothese om deze vraag te beantwoorden is dat uitgeputte cellen beter als disfunctioneel worden beschouwd - in plaats van niet-functioneel - en dat ze langzaam weefselbeschadiging kunnen veroorzaken door resterende effectorfunctie, net zoals uitgeputte T-cellen bij chronische infectie dienen om te beschermen tegen agressievere infectie (7, 8). Een tweede, niet-exclusieve verklaring is dat zelfreactieve T-cellen het effect behouden om te functioneren bij aankomst in de nier, maar ze worden steeds minder functioneel door de invloed van de micro-omgeving van het weefsel. In deze visie wordt schade door een bepaald T-cel-klonotype aanvankelijk in grotere mate toegebracht en vervolgens verzacht door een uitputtingsprogramma. Chronische ziekte kan in stand worden gehouden door de voortdurende rekrutering van nieuwe klonen die aanvankelijk meer functioneel zijn.

Om deze mechanismen te onderzoeken, is het noodzakelijk om de aard van intraparenchymale auto-immuunreacties beter te begrijpen. Het resultaat van dergelijk werk - een goed begrip van de aard van schadeveroorzakende T-cellen - zou manieren kunnen onthullen om ze specifiek te targeten, bijvoorbeeld op basis van hun metabole status of oppervlaktefenotype. Bovendien zou dergelijke informatie ziekteveroorzakers kunnen onthullen en hulpmiddelen kunnen bieden om patiënten te stratificeren - 2 belangrijke problemen bij lupus, die notoir heterogeen is in manifestatie (9, 10). Verder zullen dergelijke inzichten waarschijnlijk van toepassing zijn op andere doelorganen en ziektesettings.

Het is echter uitzonderlijk uitdagend om deze vragen in menselijk LN te beantwoorden, vanwege de schaarste aan beschikbaar weefsel, dat alleen kan worden verkregen na een extra "onderzoekspas" van een naaldbiopsie. Inderdaad, een recent consortiumonderzoek, hoewel heroïsch, slaagde erin om slechts ongeveer 1000 afzonderlijke cellen te beoordelen met RNA-Seq over alle patiënten (11). Bovendien ondergingen bijna al deze patiënten behandelingen die specifiek waren ontworpen om precies dezelfde cellen te beïnvloeden, wat de interpretatie enorm bemoeilijkt.

Om deze reden hebben we hier murine lupusmodellen gebruikt, die ons toegang geven tot weefsel zonder de complicatie van verschillende behandelingen. We hebben single-cell RNA-Seq (scRNA-Seq) gebruikt om een ​​verrassende mate van heterogeniteit tussen zowel CD4 plus als CD8 plus KIT's te identificeren, wat een dynamischer proces van schade aan doelorganen suggereert dan werd vermoed. Vooral binnen het CD8-compartiment werd een groot cluster van "overgangs" -cellen geïdentificeerd, die gedeeltelijke activering en effectorfunctie behielden en waarvan werd voorspeld dat ze evolueerden naar zowel uitgeputte cellen als residente geheugencellen, die allemaal ook werden geïdentificeerd onder KIT's. Terwijl CD4-plus-cellen, intrigerend genoeg, niet pasten in bestaande Th-paradigma's, maar eerder een cytotoxisch cluster bevatten en een alomtegenwoordig uitgeput fenotype vertoonden. Bovendien konden we door TCR-Seq te gebruiken verschillende clusters van KIT's met elkaar verbinden, wat een overtuigende progressieve evolutie van clonotypes in de nier schetst. Dit werk onthult het landschap van interacties tussen infiltrerende T-cellen en het parenchym in een lupus-doelorgaan en suggereert een dynamisch model voor hoe nefritis evolueert als een chronische aandoening. Deze inzichten kunnen nieuwe strategieën opleveren om het proces te onderbreken.

Resultaten

Experimenteel ontwerp. We hebben 3 experimentele cohorten gegenereerd om herprogrammering van T-cellen aan te pakken na weefselinfiltratie in muizen-LN met behulp van het 10x Genomics scRNA-Seq-platform en hashtag oligonucleotide (HTO) deconvolutietechnologie (Figuur 1A). In het eerste cohort (Main-Seq) vergeleken we milt-T-cellen en KIT's van verouderde lupus-gevoelige nefritische MRL/lpr-muizen, evenals "naïeve" T-cellen van niet-lupus-gevoelige B6-muizen. In het tweede cohort hebben we ons gericht op KIT's van MRL / lpr-muizen en daarnaast het KIT TCR-repertoire (MRL-TCR-Seq) beoordeeld. Ten slotte hebben we in het derde cohort een vergelijkbare KIT-analyse voltooid als in cohort 2 met behulp van het Fc R2B–/–.Yaa-model van LN (Yaa-TCR–Seq).

T-cellen clusteren op basis van oorsprong, autoreactieve status en CD4/8-fenotype. Op transcriptoom gebaseerde clustering met lage resolutie van alle T-cellen in het Main-Seq-cohort, met behulp van Seurat (12), identificeerde 14 clusters (Figuur 1B). HTO-deconvolutie afgebakende cellen op basis van T-celtype (dwz CD4 en CD8), orgaan van oorsprong (nier versus milt) en potentiële autoreactieve status (B6 versus lupus-gevoelige muizen, figuur 1C). Alle 3 de MRL/lpr-muizen droegen bij aan elke gedefinieerde populatie, waarbij geen enkele populatie werd aangestuurd door een specifieke donor (aanvullend figuur 1; aanvullend materiaal online beschikbaar bij dit artikel; https://doi.org/10.1172/jci.insight.156048DS1) . Terwijl CD4 plus en CD8 plus T-cellen van niet-auto-immuunmuizen relatief uniform waren, vertoonden CD4 plus en CD8 plus T-cellen van zieke muizen opmerkelijke heterogeniteit (figuren 1, B en C).

Heterogeniteit en potentiële functies van CD4 plus T-cellen bij murine lupus. Clustering met hoge resolutie leverde 13 CD4 plus T-celclusters op (Figuur 2A). HTO-gerichte deconvolutie benadrukte de scheiding tussen van de nier afgeleide en van de milt afgeleide T-cellen van MRL/lpr-muizen, terwijl CD4 plus T-cellen van B6-muizen voornamelijk in 2 clusters vielen (5 en 11) (Figuur 2A, rechterpaneel). Door de meest differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) in elk cluster te identificeren (aanvullende figuur 2), hebben we geprobeerd specifieke fenotypische subtypen toe te wijzen aan elk CD4 plus-cluster. Met behulp van deze benadering konden slechts 2 van de CD4 plus T-celclusters gemakkelijk worden vergeleken met conventionele T-celfenotypes: cluster 6 vertegenwoordigde Tregs, terwijl cluster 12 een type I IFN-handtekening (IFNhi) vertoonde.

Vervolgens onderzochten we TF-expressie en canonieke T-cel genexpressie signature-verrijkingsoverlays voor goed beschreven CD4 plus T-cel fenotypes, waaronder Treg, Th1, Th2, T folliculaire helper (Tfh) en Th17 (zie aanvullende tabel 1 voor genenlijsten) ( 13-23). Zoals verwacht vertoonde het veronderstelde Treg-cluster sterke Treg-geassocieerde gensignaturen en bracht het Foxp3 tot expressie (Figuur 2B). De Th1-handtekening was geassocieerd met clusters 1, 4 en 8, en Tbet werd uitgedrukt in een vergelijkbare verdeling (Figuur 2C). Een sterkere Th2-genhandtekening en Gata3-expressie werden ook waargenomen in de nier-overheersende clusters 1, 4, 8 en 10, wat duidt op enige co-expressie van het Th1- en Th2-fenotype zonder duidelijke afbakening tussen de 2 lijnen (Figuur 2, C en D ). Verschillende rapporten hebben een rol voor Th17 in LN gesuggereerd; echter, vergelijkbaar met de bevindingen in de humane nefritis-monsters die het Accelerating Medicines Partnership in SLE-netwerk (AMP-consortium) onderzocht (11), werd er geen significant Th17-profiel waargenomen door genesignatuur of Rorc-expressie in enig compartiment (aanvullende figuur 3, A en B ). Weinig cellen vertoonden ofwel de Tfh-geassocieerde genesignatuur of Bcl6-expressie, consistent met rapporten van enkele kiemcentra in MRL / lpr-milten (24) (aanvullende figuur 3C). Ten slotte vertegenwoordigde cluster 7 waarschijnlijk een centraal T-geheugencompartiment (TCM) en vertegenwoordigde cluster 5 naïeve T-cellen (aanvullende figuren 3, D en E).

We identificeerden verschillende TF's waarvan de motieven waren verrijkt met DEG's van bepaalde clusters met behulp van het SCENIC-algoritme. Hoewel het type I IFN-cluster (cluster 12) bewijs vertoont van IRF1-, IRF7-, IRF9- en STAT2-regulering (25) (Figuur 3A), vonden we in het algemeen geen unieke TF-associaties binnen specifieke clusters. Hiërarchische clusteranalyse van de TF suggereerde echter transcriptionele organisatie door het orgaan van oorsprong of de aanwezigheid van auto-immuniteit. Er was een nierspecifieke invloed, doordat tal van TF-bindingsmotieven (waaronder HIF1, TGIF2, CREM, JUN en FOS) waren verrijkt in de meeste KIT's, ongeacht het cluster; verschillende van deze TF's waren zelf ook transcriptioneel opgereguleerd, waaronder Crem en Hif1, die eerder in verband werden gebracht met respectievelijk weefselresidu en hypoxie (18, 26, 27) (Figuur 3B). Door de Hif1-expressie en transcriptionele activiteit beschreef recent werk een hypoxie-genexpressieprofiel in bulk-RNA-Seq van KIT's geïsoleerd uit MRL / lpr-muizen (18). Evenzo hebben we waargenomen dat een deel van de KIT's een hypoxieprofiel tot uitdrukking bracht, met name in clusters 1, 4, 8 en 10 en de KIT Treg-populatie (Figuur 4A).

Gezien de bevindingen uit ons eerdere werk die KIT-uitputting suggereren, hebben we de uitputtingshandtekening beoordeeld (6), die in totaal verrijkt leek bij CD4 plus KIT's (Figuur 4, A en B). Uitputtingshandtekeningen in meerdere clusters waren hoger dan de basislijn gedefinieerd door CD4 plus B6 milt-T-cellen, waarbij clusters 0, 4, 8, 10 en 9 de hoogste score vertoonden (Afbeelding 4B). Deze clusters waren voornamelijk samengesteld uit KIT's, behalve cluster 9, die bestond uit zowel KIT's als milt-T-cellen van MRL/lpr-muizen; zelfs in cluster 9 waren de meer uitgeputte cellen echter afkomstig van de nieren (Figuur 4B). Daarom verschijnt, ondanks de heterogeniteit van CD4 plus KIT's, uitputting-geassocieerde genexpressie in de transcriptomen van meerdere clusters van T-cellen.

Aangezien cytotoxische CD4 plus T-cellen zijn gemeld bij veroudering, (13) tumorinfiltraten (28) en systemische sclerose (29), hebben we beoordeeld of een cytotoxische gensignatuur werd waargenomen in KIT's. Een deel van zowel milt- als nier-afgeleide T-cellen van MRL/lpr-muizen, die clusters 0, 2 en 9 omvatten, bracht inderdaad een cytotoxische gensignatuur tot expressie (Figuur 4A). Interessant is dat KIT-clusters over het algemeen een hypoxisch profiel of een cytotoxische gensignatuur tot uitdrukking brachten, maar niet beide.

Trajectanalyse identificeert de ontwikkelingsprogressie van CD4 plus T-cellen. Op basis van de analyse van clustergensignaturen veronderstelden we dat er een progressie is van naïeve naar perifere effector/cytotoxische T-cellen, die vervolgens de nier binnendringen waar ze eerst een cytotoxisch programma tot expressie brengen, gevolgd door een hypoxie-respons vergezeld van uitputting/disfunctie. Om dit model te evalueren, hebben we een afstammingsprogressieanalyse gemaakt met behulp van Monocle3, die temporele genexpressie integreert (Figuur 4C). HTO-overlays op het pseudo-tijdtraject van Monocle3 (Figuur 4C) gaven aan dat afstammingsoorsprong optreedt met het B6-naïeve cluster; het programma veronderstelde vervolgens vroege vertakking van het Treg-cluster, samen met progressie door geactiveerde lupus-gevoelige miltcellen en uiteindelijk naar nier-infiltrerende cellen. In dit model lijkt het erop dat naïeve T-cellen de "auto-immuun/cytotoxische fase" ingaan vlak voor of parallel aan nierinfiltratie, zoals verondersteld, en uiteindelijk evolueren naar een hypoxische/disfunctionele toestand (Figuur 4D).

KIT Tregs brengen weefselresidente markers tot expressie. Om het onafhankelijke effect van weefselherprogrammering op het T-celfenotype te beoordelen, hebben we de Treg-populatie (cluster 6) nauwkeuriger geëvalueerd, aangezien dit cluster was samengesteld uit cellen van alle 3 de oorsprong. Bij herclustering werden KIT Tregs afzonderlijk in kaart gebracht van de milt Tregs van B6 of auto-immuunoorsprong (Figuur 5, A en B). Een vulkaanplot (Figuur 5C) onthulde verschillende DEG's tussen perifere en nier-Tregs, meestal opgereguleerd in de nier, wat suggereert dat weefselverblijf een extra transcriptioneel programma induceerde. Deze DEG's omvatten Crem en Klf6, TF's die eerder waren geassocieerd met CD4 plus KIT-fenotypes in onze TF-mapping (Figuur 3B). Interessant is dat genen die eerder werden geïdentificeerd in weefselresidente Tregs in vergelijking met lymfoïde Tregs op vergelijkbare wijze transcriptioneel werden opgereguleerd in KIT Tregs, waaronder Crem, Rgs1, Rgs2, Id2, Ctla4 en Areg (Figuur 5C, roze gemarkeerd) (30).

CD8 plus KIT's vertonen heterogeniteit na weefselinfiltratie. CD8 plus T-cellen (van Main-Seq) werden geanalyseerd zoals gedaan voor de CD4 plus-populatie, wat 9 clusters opleverde die opgelost waren op basis van HTO (Figuur 6, A en B). We konden de meeste van deze clusters identificeren aan de hand van de DEG's in elk (figuur 6C). De meeste milt-T-cellen waren geclusterd aan de rechterkant van de UMAP, waarbij cluster 4 voornamelijk bestond uit B6-milt-T-cellen en cluster 0 de meerderheid van MRL/lpr-milt-T-cellen vertegenwoordigde en een TCM-fenotype suggereert.

T-cellen van de auto-immuunmilt waren ook vertegenwoordigd in clusters 6 en 5, die respectievelijk T-effectorgeheugen (TEM) en perifere uitgeputte cellen omvatten. CD8 plus KIT's van MRL/lpr-muizen werden gevonden in verschillende unieke clusters. Cluster 2 bevatte een uitgeputte T-celpopulatie (TEX). Cluster 3 bestond uit een residente geheugen-T-celpopulatie (TRM). Cluster 6 was een TEM-cluster, bestaande uit ongeveer 50 procent KIT's en 50 procent milt-T-cellen. Cluster 1 was het grootste KIT-cluster. Het leek een overgangstoestand te vertegenwoordigen, aangezien cellen in dit cluster een mengsel van genen tot expressie brachten die indicatief zijn voor TEX, TRM en TEM. De 2 kleinste clusters waren delende cellen (cluster 7) en IFNhi T-cellen (cluster 8), met cellen uit meerdere bronnen.

Om de vermeende identiteiten van clusters te bevestigen, werden referentiegensignaturen (aanvullende tabel 1) over de UMAP-plots gelegd (Figuur 6, D-I). De handtekening van het residente geheugen is het sterkst toegewezen aan de TRM- en KIT TEX-clusters (Afbeelding 6D). Omgekeerd was de perifere genhandtekening geassocieerd met van de milt afgeleide T-cellen - met name het naïeve, het TCM- en miltgedeelte van de TEM-clusters (Figuur 6E); het perifere TEX-cluster vertoonde echter noch een TRM, noch een perifere handtekening. Zoals verwacht vertoonde de CD8 plus KIT-populatie als geheel een robuuste "uitgeputte" signatuur (6). Onder KIT's was de uitputtingssignatuur het meest geassocieerd met clusters 2 en 3 en in mindere mate 1, die respectievelijk de KIT TEX-, TRM- en overgangspopulaties vertegenwoordigen (Figuur 6F). Referentiegen UMAP-overlays voor TEM- en TCM-transcriptiehandtekeningen bevestigden onze initiële classificaties van deze clusters (Figuur 6, G en H).

Uniek TF-profiel geassocieerd met infiltratie en uitputting van T-cellen. We voerden verder TF-motiefverrijking uit voor de CD8 plus T-celclusters met behulp van SCENIC (Figuur 7A). Zoals verwacht werden IRF1, IRF7, IRF9 en STAT1 geïdentificeerd als transcriptionele drivers van het IFNhi-cluster. Vergelijkbaar met het CD4 plus-compartiment, werden verschillende motieven verrijkt in alle CD8 plus KIT's (UQCRB, CREM en KLF6), terwijl andere TF's clusterspecifiek waren; in de TEX-clusters (2 en 5) werden bijvoorbeeld motieven voor NR3C1, HTATIP2 en ELF1 verrijkt.

Niet alle TF's kunnen worden toegewezen door SCENIC. Om een ​​alternatieve benadering te bieden, hebben we de expressie van meerdere TF's op de UMAP-plots gelegd (Figuur 7B). Expressie van Crem en in mindere mate Klf6 was geassocieerd met KIT's, terwijl Uqcrb dat niet was, wat enige discrepantie blootlegde tussen TF-expressie en voorspelde TF-genregulatie. Expressie van zowel Tox als Eomes, die regulatoren zijn van T-celuitputting (31-33), is gecorreleerd met de TEX-clusters 2 en 5, wat hun identiteit verder bevestigt. Met name Tcf7, dat sterk tot expressie wordt gebracht in T-cellen van de milt, werd ook waargenomen in overgangscellen, waarbij de expressie in het algemeen werd gedoofd in TEX- en TRM-populaties. Een patroon vergelijkbaar met Tcf7 werd gezien met Klf2, terwijl Klf6 en Id2 wederzijdse patronen hadden.

【Voor meer info: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】