Hoog-fosfordieet induceert opregulatie van Bmp2- en Spp1-MRNA-expressie in rattennier

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Om het mechanisme van de ontwikkeling van nefrocalcinose geïnduceerd door een hoog-fosfor (P)-dieet te verduidelijken, hebben we ons gericht op botgerelateerde eiwitten zoals botmorfogenetisch eiwit 2 en osteopontine. Deze studie onderzocht de effecten van een P-rijk dieet op de mRNA-expressie van Bmp2 en Spp1 bij de ratnier. Wistar-ratten werden in twee groepen verdeeld en kregen een controledieet (controlegroep) of een high-P-dieet (high-P-groep).Niercalcium- en P-concentraties waren significant verhoogd in de hoge P-groep in vergelijking met de controlegroep. De mRNA-expressie van zowel Bmp2 als Spp1 was significant verhoogd in de hoge-P-groep in vergelijking met de controlegroep. Deze resultaten geven aan dat een hoog P-dieet de opregulatie van Bmp2- en Sppl-mRNA in de induceertnier.

Trefwoorden: fosforrijk dieet, nefrocalcinose, Bmp2, Spp1,nier, Rat

Voor meer informatie kunt u contact opnemen met:emily.li@wecistanche.com

cistanche om nierziekte te behandelen

Invoering

Nefrocalcinose is een aandoening die wordt gekenmerkt door calcium (Ca)-afzettingen in het nierparenchym. Vooral fosfor in de voeding (P) is een cruciale factor in de ontwikkeling van deze aandoening. Het is aangetoond dat toediening van een P-rijk dieet resulteert in een verhoogde Ca-concentratie in denieren Ca-afzettingen in het nierparenchym1-6）. Hoewel het effect van een P-rijk dieet op de ontwikkeling van nefrocalcinose de focus is geweest van lopend onderzoek, is er weinig bekend over het mechanisme dat verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van deze aandoening. Een tijdige oplossing van dit probleem is dus nodig.

We meldden dat bij histologisch onderzoek met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie hydroxyapatiet-achtige naaldvormige kristallen werden waargenomen in de niertubuli van ratten die een hoog P-dieet kregen . Röntgenmicroanalyse gaf aan dat Ca-afzettingen veroorzaakt door een P-rijk dieet voornamelijk bestaan ​​uit Ca en P7）. Deze resultaten onthulden dat Ca-afzettingen veroorzaakt door een P-rijk dieet een vorm van hydroxyapatiet zijn. Op basis van deze bevinding postuleren we dat de ontwikkeling van nefrocalcinose wordt gecontroleerd door een mechanisme dat vergelijkbaar is met dat bij botvorming. Daarom concentreerde de huidige studie zich op bot-geassocieerde eiwitten zoals botmorfogenetisch eiwit 2 (BMP2). BMP2 is een osteogene factor die osteogenese-inducerende activiteit vertoont8, 9）. Het is opmerkelijk dat BMP2 werd geïdentificeerd als een factor die ectopisch induceertbotvorming10, 11）. We veronderstelden dus dat als BMP2 een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van nefrocalcinose, de expressie van dit eiwit in denierzou worden opgereguleerd door een P-rijk dieet. De huidige studie was bedoeld om te bepalen of een hoog-P-dieet de mRNA-expressie van Bmp2 in denier.

Ondertussen meldde onze vorige studie dat een hoog P-dieet de expressie van osteopontine (OPN) in niertubuli verhoogt met behulp van immunohistochemische analyse, wat suggereert dat OPN mogelijk betrokken is bij de ontwikkeling van Ca-afzettingen veroorzaakt door een hoog P-dieet. Daarom onderzochten we de veranderingen in Sppl-mRNA-expressie in denierook.

De resultaten van de huidige studie kunnen waardevolle inzichten verschaffen in het mechanisme dat verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van nefrocalcinose veroorzaakt door een P-rijk dieet.

materialen en methodes

Dieren en diëten.

De huidige studie werd goedgekeurd door de Animal Use Committee van de Tokyo University of Agriculture, en alle dieren werden onderhouden in overeenstemming met de richtlijnen van de universiteit voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (goedkeuring nr. 300049).

Het is belangrijk op te merken dat vrouwelijke ratten nefrocalcinose gemakkelijker ontwikkelen dan mannelijke ratten13, 14）. Bovendien rapporteerden we dat een hoog P-dieet de OPN-expressie in niertubuli van vrouwelijke ratten verhoogt. De huidige studie gebruikte vervolgens vrouwelijke ratten als proefdieren. Vier weken oude vrouwelijke Wistar-ratten (Clea Japan, Tokyo, Japan) werden gehuisvest in individuele roestvrijstalen gaaskooien. Tijdens de experimentele periode werden de kooien geplaatst in een kamer met gecontroleerde verlichting onder een 12- uur licht: donkercyclus (licht, 0800-2000 uur), de temperatuur van 22 ± 1 graad en relatieve vochtigheid van 60 procent tot 65 procent.

De samenstelling van de experimentele diëten is weergegeven in:Table 1. Experimentele diëten werden bereid met verwijzing naar het AIN{{0}}G-dieet15). De experimentele diëten bevatten twee verschillende P-concentraties (controledieet, 0,3 procent; hoog-P-dieet, 1,5 procent). De P-concentratie in het P-rijk dieet was ingesteld op 1,5 procent, aangezien in onze eerdere onderzoeken werd vastgesteld dat een P-concentratie in de voeding van 1,5 procent leidt tot

ernstige nefrocalcinose6, 7, 12, 14）en hoge OPN-expressie12）. Alle experimentele diëten hadden dezelfde concentratie Ca (0,5 procent). P- en Ca-concentraties, zoals bepaald door analyse van de experimentele diëten, worden weergegeven inTable 1. Voorafgaand aan de start van het onderzoek werden alle ratten 7 dagen geacclimatiseerd, gedurende welke tijd ze vrije toegang kregen tot het controledieet en gedeïoniseerd water. Na de acclimatisatieperiode werden de ratten willekeurig verdeeld in twee groepen met vergelijkbare gemiddelde lichaamsgewichten en kregen ze ofwel het controledieet (controlegroep) of het hoge P-dieet (hoge P-groep) gedurende 14 dagen. Ratten kregen gedurende de hele experimentele periode vrije toegang tot de toegewezen experimentele diëten en gedeïoniseerd water. Aan het einde van de experimentele periode werden ratten geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie van het verdovingsmengsel (medetomidine, midazolam en butorfanol), en bloed enniermonsters werden verzameld voor analyse. Bloedmonsters werden gecentrifugeerd en supernatanten werden gebruikt als serummonsters. Nieren werden verwijderd en het nierkapsel werd weggegooid. Het serum enniermonsters werden bewaard bij -80 graden totdat ze nodig waren voor analyse. De rechter nier werd gebruikt voor kwantitatieve analyse van Bmp2- en Sppl-mRNA, en de linkernierwerd gebruikt voor de analyse van Ca- en P-concentraties.

Minerale analyse.

Voorbeelden van de experimentele diëten ennierenwerden 48 uur bij 550 graden in een moffeloven verast en mineralen werden voor analyse geëxtraheerd in 1 mol/L HCl. Ca concentraties in de experimentele diëten ennierenwerden bepaald door atomaire absorptiespectrofotometrie16）. P-concentraties in de experimentele diëten ennierenwerden geanalyseerd met behulp van de methode van Gomori17）.

Kwantitatieve analyse van Bmp2- en Sppl-mRNA.

Totaal RNA werd geïsoleerd uit de gehomogeniseerde nier met behulp van TRIzol-reagens (Life Technologies, CA, VS) volgens de specificaties van de fabrikant. De hoeveelheid en zuiverheid van het RNA werden beoordeeld met behulp van een NanoDrop 2 00 0c (Thermo Fisher Scientific, MA, VS). cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van de SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix voor qRT-PCR (Life Technologies) en vervolgens onderworpen aan kwantitatieve realtime RT-PCR met behulp van SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Specifieke primers18-20）werden gebruikt voor de analyse van Bmp2 (forward, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; reverse, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (forward, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; omgekeerd, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3'), en Gapdh (vooruit, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; omgekeerd, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). De realtime PCR-reactie werd uitgevoerd met behulp van een StepOne Real-Time PCR-systeem (Applied Biosystems, CA, VS) en mRNA-expressieniveaus werden genormaliseerd naar Gapdh-mRNA-niveaus. De waarde van de controlegroep werd geacht 1,00 te zijn.

Statistische analyse.

Resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM voor elke groep van 6 ratten. Na het uitvoeren van een F-test om de homogeniteit van varianties te bepalen, werd een Student's t-test gebruikt om significante verschillen tussen de twee groepen te bepalen. Als de homogeniteit van varianties niet gelijk was, werd Welch's t-test gebruikt in plaats van de Student's t-test. Verschillen werden als significant beschouwd bij p ＜ 0.05

Resultaten

Lichaamsgewicht, voedselinname en serumanalyse.

Het uiteindelijke lichaamsgewicht en de voedselinname waren significant verlaagd in de groep met een hoge P in vergelijking met de controlegroep (Tafel 2). Niergewicht en mineraalconcentraties.Niernat en droog gewicht waren significant verhoogd in de groep met een hoge P in vergelijking met de controlegroep (Tafel 3). NierCa en P-concentraties waren ook significant verhoogd in de hoge-P-groep in vergelijking met de controlegroep.

Renale Bmp2- en Sppl-mRNA-expressie.

Bmp2-mRNA-niveaus in de hoge-P-groep waren significant verhoogd in vergelijking met de controlegroep (Afb.1A). mRNA-expressie van Spp1 was ook significant verhoogd in de groep met een hoge P in vergelijking met de controlegroep (Afb. 1B).

Discussie

Een van de bekende fysiologische effecten van een P-rijk dieet is het ontstaan ​​van nefrocalcinose. In de huidige studie waren de Ca- en P-concentraties in de nieren verhoogd in de hoge-P-groep in vergelijking met de controlegroep, wat consistent is met de resultaten van de eerdere onderzoeken1-6）. Eerdere studies meldden dat histologische scores van nefrocalcinose positief gecorreleerd waren met nier Ca- en P-concentraties4, 21）. Dus, hoewel er geen histologische observatie van de nier werd uitgevoerd in de huidige studie, geven verhoogde Ca- en P-concentraties in de nieren aan dat nefrocalcinose werd geïnduceerd door het hoge-P-dieet.

Omdat over het algemeen wordt aangenomen dat Ca-afzettingen geïnduceerd door een P-rijk dieet een vorm van hydroxyapatiet zijn, veronderstelden we dat de ontwikkeling van nefrocalcinose wordt gecontroleerd door een mechanisme dat vergelijkbaar is met dat van osteogenese. Zo onderzochten we de effecten van een hoog-P-dieet op Bmp2-mRNA-expressie in de nier. De resultaten

toonde aan dat renale Bmp2-mRNA-expressie was verhoogd in de hoge-P-groep en dat een hoog-P-dieet opregulatie van Bmp2-mRNA-expressie in de nier induceert. Deze bevinding kan helpen bij het verklaren van het mechanisme van de ontwikkeling van nefrocalcinose veroorzaakt door een P-rijk dieet. Hoewel definitief bewijs dat onze hypothese ondersteunt ontbreekt, is een mogelijkheid dat de expressie van osteogene transcriptiefactoren verhoogd is in verkalkte gebieden in de nier. BMP2 induceert osteoblastdifferentiatie en botvorming door osteogene transcriptiefactoren zoals Osterix, Runx2 en Msx28, 9） te reguleren; dus kan BMP2 nefrocalcinose bevorderen via de regulatie van dergelijke osteogene transcriptiefactoren. Op dit moment blijft de gedetailleerde rol van BMP2 bij de ontwikkeling van nefrocalcinose onduidelijk. Omdat in dit onderzoek alleen de Bmp2-mRNA-expressie werd gemeten, is het bovendien niet bekend of er een verschil is in de BMP2-eiwitexpressie. Onze resultaten suggereren echter een mogelijk mechanisme waardoor veranderingen in BMP2-expressie een krachtige rol spelen in de pathogenese van hoge P-dieet-geïnduceerde nefrocalcinose.

De huidige studie richtte zich op Sppl-mRNA-expressie naast Bmp2-mRNA-expressie. Onze eerdere studie met behulp van immunohistochemische analyse duidde op hoge niveaus van OPN-expressie in de niertubuli van ratten die een hoog P-dieet kregen. De huidige studie vond dat Sppl-mRNA-expressie ongeveer 10-voudig was verhoogd in de hoge-P-groep. Resultaten van de huidige en eerdere studies laten zien dat een hoog-P-dieet OPN-expressie in de nier induceert. Aan de andere kant hebben andere onderzoekers aangetoond dat OPN als steenmatrix een belangrijke factor is bij de vorming van urinestenen22, 23）; dus ons vorige rapport suggereerde dat OPN mogelijk een rol speelt als matrixcomponent bij de vorming van Ca-afzettingen geïnduceerd door een hoog P-dieet. Echter, Paloian et al. onlangs gemeld dat OPN een rol speelt bij de preventie van door hoge P-dieet geïnduceerde nefrocalcinose bij OPN KO-muizen. De fysiologische rol van OPN op door een hoog P-dieet geïnduceerde nefrocalcinose lijkt namelijk eerder onderdrukking te zijn dan een bevordering van verkalking in denier. Bovendien zijn eerdere rapporten beschreven dat OPN-niveaus toenemen om verdere pathologische ectopische calcificatie in te compenserennieren vasculatuur als OPN wordt opgereguleerd op de plaats van pathologische calcificatie.

Zoals hierboven vermeld, suggereerde de huidige studie het belang van BMP2 en OPN bij hoge P-dieet-geïnduceerde nefrocalcinose. Het is opmerkelijk dat de effecten van BMP2 en OPN op de ontwikkeling van nefrocalcinose worden gereguleerd door verschillende mechanismen. Deze mechanistische verschillen kunnen erop wijzen dat het onderliggende mechanisme van nefrocalcinose gecompliceerd is. Het volgende punt om te overwegen is dat groeiremming de Bmp2- en Sppl-mRNA-expressie in denieromdat in de huidige studie een afname van het uiteindelijke lichaamsgewicht werd waargenomen in een groep met een hoge P. Waarnemingen in onze vorige en huidige onderzoeken kunnen dit punt helpen verklaren. We rapporteerden eerder verhoogde OPN-eiwitexpressie in niertubuli van ratten waarvan de groei

werd niet geremd door een P-rijk dieet. Bovendien toonde de huidige studie groeiremming in de hoge-P-groep, maar hoge niveaus van Sppl-mRNA-expressie in de nier. Op basis van deze waarnemingen lijkt de huidige studie weinig effect te hebben op groeiremming van Bmp2- en Sppl-mRNA-expressie. De details van de relatie tussen groeiremming en Bmp2- en Sppl-genexpressie blijven echter onduidelijk. Daarom is verder onderzoek nodig om dit punt op te helderen.

Concluderend, om het mechanisme van de ontwikkeling van nefrocalcinose geïnduceerd door een P-rijk dieet te verduidelijken, heeft de huidige studie de effecten bepaald van een P-rijk dieet op Bmp2- en Spp1-mRNA-expressie in denier. Nier Ca- en P-concentraties waren significant verhoogd in de hoge-P-groep in vergelijking met de controlegroep. Verder was de mRNA-expressie van Bmp2 en Sppl significant verhoogd in de hoge-P-groep in vergelijking met de controlegroep. Deze resultaten geven aan dat een hoog P-dieet de opregulatie van Bmp2- en Sppl-mRNA-expressie in de bevordertnier.

Referenties

Hitchman AJ, Has any SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Fosfaat-geïnduceerde niercalcificatie bij de rat. Kan J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

Parker HE: onderlinge relaties tussen magnesium en fosfor bij een voldoende hoog fosforgehalte in de voeding. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosfor-geïnduceerde nefrocalcinose en nierfunctie bij vrouwelijke ratten. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: de concentraties en verhouding van calcium en fosfor in de voeding beïnvloeden de ontwikkeling van nefrocalcinose bij vrouwelijke ratten. J Nutr 132: 252-256, 2002

Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: effecten van calciumsuppletie via de voeding op het botmetabolisme, de niermineraalconcentraties en de nierfunctie bij ratten die een fosforrijk dieet kregen. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Een hoog fosfordieet induceert snel nefrocalcinose en proximale tubulaire schade bij ratten. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Effectiviteit van de traditionele Chinese geneeskunde, Wulingsan, bij het onderdrukken van de ontwikkeling van nefrocalcinose veroorzaakt door een hoog fosfordieet bij jonge ratten. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Gerichte verstoring in muizencellen onthult een variabele vereiste voor Smad4 bij het transformeren van groeifactorgerelateerde signalering. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 reguleert Osterix via Msx2 en Runx2 tijdens osteoblastdifferentiatie. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR: Bot: vorming door auto-inductie. Wetenschap 150: 893-899, 1965

11 ） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: nieuwe regulatoren van botvorming: moleculaire klonen en activiteiten. Wetenschap 242: 1528-1534, 1988

Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: een hoog fosfordieet induceert osteopontine-expressie van niertubuli bij ratten. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

Cousins ​​FB, Geary CPM: een geslachtsafhankelijke nierverkalking bij ratten. Natuur 211 : 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Geslachtsverschillen in niermineraalconcentraties en urinaire albumine-uitscheiding bij ratten die hoog fosforvoer kregen. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 gezuiverde diëten voor laboratoriumknaagdieren: eindrapport van het ad hoc schrijfcomité van het American Institute of Nutrition over de herformulering van het AIN-76Een knaagdierdieet . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16-Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Bepaling van calcium en magnesium in serum, urine, voeding en ontlasting door atoomabsorptiespectrofotometrie. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17-Gomori G: Een wijziging van de colorimetrische fosforbepaling voor gebruik met de foto-elektrische colorimeter. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: de prenylgroep draagt ​​bij aan de activiteiten van fyto-oestrogeen 8-prenynaringenine bij het verbeteren van botvorming en het remmen van botresorptie in vitro. Endocrinologie 154: 1202-1214, 2013

19）Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Vloeistofstroom stimuleert de expressie van osteopontine en bot-sialoproteïne door beenmerg-stromacellen op een temporeel afhankelijke manier. Bot 36: 1047-1055, 2005

20-Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Karakterisering van het rat-oncostatine M-receptorcomplex dat lijkt op de mens, maar verschilt van de muizencytokinereceptor. PLoS One 7: e43155, 2012

21-Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Invloed van calcium: fosfor in de voeding op minerale uitscheiding en nefrocalcinose bij vrouwelijke ratten. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Moleculaire klonering en sequentiebepaling van cDNA dat codeert voor een urinesteeneiwit, dat identiek is aan osteopontine. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Structuur en expressie van het mRNA dat codeert voor urinesteeneiwit (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontine protesteert tegen hoge fosfaat-geïnduceerde nefrocalcinose en vasculaire calcificatie. Nier Int 89: 1027-1036, 2016

Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontine is verhoogd tijdens neointima-vorming in rattenslagaders en is een nieuw onderdeel van menselijke atherosclerotische plaques. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993