Hoge zoutinname en de effecten ervan op het natuurlijke darmmicrobioom bij wilde muizen

1. Inleiding

De darmen van zoogdieren worden gekoloniseerd door een complexe en diverse bacteriële gemeenschap, die samen met de gastheer een delicate symbiotische relatie creëert [1,2]. Deze bacteriële gemeenschap oefent vele functies uit die nuttig zijn voor de gastheer, waaronder metabolische, immuunmodulerende en trofische functies [3–7] en de samenstelling van de darmmicrobiota kan tijdens het leven veranderen, in overeenstemming met de specifieke behoeften en fysiologie van de gastheer [1,8, 9]. Veel gunstige functies van darmgezondheidsbevorderende bacteriën worden gemedieerd door van anaerobe fermentatie afkomstige metabolieten [10-13] en dysbiotische omstandigheden kunnen de gezondheid van de gastheer aanzienlijk beïnvloeden [2,11,14,15]. De groeiende bezorgdheid over de impact van levensstijl op de gezondheid heeft geleid tot een toegenomen wetenschappelijke belangstelling voor de betrokkenheid van darmmicrobiota en de translationele implicaties ervan [16,17]. De darmmicrobiota wordt gevormd door zowel extrinsieke (bijvoorbeeld levensstijl, voeding en medische behandelingen) als intrinsieke (bijvoorbeeld gastheergenetica, immuun- en metabolische regelgeving) factoren [8,18-20]. Het wordt algemeen erkend dat extrinsieke elementen impactvolle effecten kunnen veroorzaken, waarbij voeding een van de belangrijkste factoren is die bijdragen aan het beïnvloeden van de samenstelling en functie van de darmmicrobiota [1,2,21]. Het is bekend dat westerse voedingscomponenten, zoals een hoge zoutinname, de homeostase van de gastheer schaden door het immuunsysteem te beïnvloeden en de darmmicrobiota en ziekten te veranderen [18,22-37]. In de darmmicrobiota van muizen wordt een zoutrijk dieet (HSD) geassocieerd met de vermindering van gezondheidsbevorderende bacteriën die berucht zijn als producenten van korteketenvetzuren (SCFA), zoals Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia en Faecalibaculum [28, 29,38-41], naast een toename van de overvloed aan Akkermansia, een andere opportunistische SCFA-producent waarvan is aangetoond dat deze de immuniteit en ziekte van de gastheer beïnvloedt in verschillende modelsystemen [42,43]. Muizendiermodellen worden vaak gebruikt om te bestuderen hoe voedingsfactoren de darmmicrobiota, het immuunsysteem en ziekten kunnen beïnvloeden [29,44-46]. Hoewel het gebruik van conventionele laboratoriummuizen (CLM) nog steeds een geldige optie is voor veel onderzoeken, slaagt het er soms niet in om op de darmmicrobiota gerichte toepassingen goed te vertalen [47-49]. Immunologisch en metabolomisch onderzoek in muizenmodellen van inflammatoire darmziekten (IBD) en obesitas bleken bijvoorbeeld de translationele uitkomsten van onderzoeken naar de darmmicrobiota slecht te voorspellen [50]. Dit kan te wijten zijn aan veel inherente verschillen in deze modelsystemen, zoals verschillende darmanatomie, genetica en fysiologie [16,50]. Een ander probleem bij het gebruik van CLM voor het bestuderen van microbiota-immuuninteracties is echter de domesticatie van de darmbacteriële samenstelling in CLM, wat wordt weerspiegeld in de vermindering van de complexiteit en veerkracht van de CLM-darmmicrobiota in vergelijking met wilde muizen [51]. De behoefte aan gezuiverde en gecontroleerde omgevingen wordt geconfronteerd met een verminderde aanwezigheid van potentiële ziekteverwekkers en parasieten, wat vermoedelijk leidt tot een minder ‘onderwezen’ immuunsysteem bij CLM vergeleken met wilde muizen [51-53]. Om dit probleem aan te pakken werd het wildling-muizenmodel ontwikkeld door embryotransfer van C57BL/6-muizen in wilde muizen om een ​​van het wild afkomstige darmmicrobiota te verkrijgen, om het translationele probleem van onderzoeken naar immunologische darmmicrobiota te ondervangen [54]. Recente onderzoeken met dit muismodel lieten superieure resultaten zien bij het voorspellen van de translationele waarde van experimentele immuuntherapieën vergeleken met CLM [54,55]. Bovendien was de darmmicrobiota van wilde vogels resistenter en veerkrachtiger tegen antibioticabehandeling en een vetrijk dieet vergeleken met CLM, vergelijkbaar met de complexere situatie bij mensen [54,55]. Ondanks de vastgestelde effecten van HSD op de darmmicrobiota, het immuunsysteem en verschillende ziektemodellen bij CLM, zijn de effecten van een hoge zoutinname op de natuurlijke, uit het wild afkomstige darmmicrobiota echter onbekend. In deze studie evalueerden we het effect van HSD op verschillende darmbacteriële ecosysteemsamenstellingen en voorspellende functies van CLM in vergelijking met wildlingmuizen.

2. Materialen en methoden

2.1. Dieren en dieet

Wildtype C57BL/6-muizen (vrouwtjes van 7-8 weken oud, n=20) werden gekocht bij Charles River en onder gestandaardiseerde omstandigheden gehuisvest in de dierenfaciliteit van de Universiteit van Hasselt. Wildling-muizen (C57BL/6 genetische achtergrond, mannetjes n=12 en vrouwtjes n=11) [54] werden onder gestandaardiseerde omstandigheden gehuisvest in de dierenfaciliteit van UHasselt. Dierstudies zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven (ECAE) van de Universiteit Hasselt (ID201618A4V1, ID202235). Muizen werden gehuisvest (4 muizen/kooi) in een kamer met temperatuurregeling (21–23 ◦C) met een licht/donkerlichtcyclus van 12:12 uur. De volgende gezuiverde diëten werden gekocht bij Ssniff (Soest, Duitsland): 0,5% NaCl/controledieet (E15430-04) en 4% NaCl/HSD (E15431-34). Voor HSD kregen de dieren naast E15431-34 ook 1% NaCl in het drinkwater, zoals beschreven in [28]. CLM-muizen waren gelijk verdeeld tussen de controlegroep (n=10) en HSD (n=10). Voor de wilde muizen waren mannelijke en vrouwelijke individuen ook gelijk verdeeld in controle- en HSD-dieetgroepen (6 mannetjes voor controle, 6 mannetjes voor HSD, 5 vrouwtjes voor controle en 6 vrouwtjes voor HSD).

cistanche plantverhogend immuunsysteem

2.2. DNA-extractie

Microbiële DNA-extractie werd uitgevoerd zoals beschreven in [28], met behulp van een aangepast protocol van de QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland). In het kort werden fecale pellets toegevoegd aan een 2- ml Eppendorf die 0 glaskralen van 0,5 mm en 1,5 ml lysebuffer (ASL) bevatte (Qiagen, Hilden, Duitsland). Er werd gebruik gemaakt van kralenkloppen om mechanische homogenisatie van de pellets uit te voeren. Volledige extractie werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant met kleine aanpassingen (verlenging van de incubatietijd van proteïnase K tot 2 uur bij 70 ◦C). DNA-concentraties werden geëvalueerd met behulp van een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, VS) en opgeslagen bij -20 ◦C vóór 16S rRNA-genamplificatie.

2.3. 16S rRNA-genamplificatie en sequencing

De 16S-rRNA-gensequentie werd geamplificeerd door gebruik te maken van een primer die specifiek is voor het V4-gebied (F515/R806), zoals eerder beschreven [56]. In het kort werd 25 ng DNA gebruikt per PCR-reactie (30 µl) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, VS) van initiële denaturatie gedurende 30 seconden bij 98 ◦C, gevolgd door 25 cycli (10 s bij 98 ◦ C, 20 s bij 55 ◦C en 20 s bij 72 ◦C). Reacties werden in drievoud uitgevoerd, per monster samengevoegd en gezuiverd door een op magnetische kralen gebaseerd reinigingssysteem (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, VS). Bibliotheekvoorbereiding werd uitgevoerd door een PCR met beperkte cyclus om de geïndexeerde bibliotheek te verkrijgen met behulp van Nextera-technologie (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, VS), gevolgd door een tweede AMPure XP-schoonmaakstap voor magnetische kralen. Geïndexeerde monsters werden vervolgens genormaliseerd naar dezelfde concentratie van 4 nM, samengevoegd en gesequenced op een Illumina MiSeq-platform PE300 met een 2 x 300 bp paired-end-protocol volgens het bedrijfsprotocol (Illumina, Inc., San Diego, CA, VS).

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Verwerking en statistische analyse van 16S rRNA-gensequentiegegevens

Ruwe sequenties werden verwerkt met behulp van een QIIME 2 [57] pijplijn. Na lengte- en kwaliteitsfiltering (standaardparameters) werden de metingen gefilterd en toegewezen aan operationele taxonomische eenheden (OTU's) met behulp van DADA2 [58]. Taxonomische toewijzing werd uitgevoerd door het VSEARCH-algoritme (https://github.com/torognes/vsearch; geraadpleegd op 9 november 2022) en de Silva-database v128 (https://www.arb-silva.de /; geraadpleegd op 9 november 2{{40}}22). De ASV-tabel werd vervolgens genormaliseerd door verdunning op een diepte van 6.147, zodat elk monster het plateau aan het einde van de verdunningscurve bereikte. Alfadiversiteit werd beoordeeld met behulp van twee verschillende statistieken: OTU's rijkdom (geobserveerd), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson) ecologische indexen. Voor bètadiversiteit werden Bray-Curtis-ongelijkheid, Jaccard-gelijkenis en gewogen en ongewogen UniFrac-metrieken [59] berekend en uitgezet door Principle Coördinatenanalyse (PCoA) om de werkelijke afstand tussen monsters te visualiseren. Om de OTU-teltabel te normaliseren, werd verdunning uitgevoerd op een diepte van 6305 sequenties per monster, 100 keer. De uitvoer die werd verkregen uit de OTU-taxonomietoewijzing, als taxonomietabel, werd gebruikt om de genormaliseerde OTU-tabel samen te vouwen in tabellen voor de taxonomieniveaus L2 (Phylum), L5 (Familie) en L6 (Genus). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van R (https://www.R-project.org/; geraadpleegd op 25 november 2022; versie 4.2.0). Het R-pakket "veganistisch" (versie 2.6-4) [60] werd gebruikt om bètadiversiteitsstatistieken te genereren om samenstellingsverschillen van groepen te vergelijken via PCoA of via hoofdcomponentenanalyse (PCA). Pakketten en gegevensscheiding werden getest door middel van permutatietest met pseudo-F-verhoudingen (functie "Adonis" in "veganistisch"). De scheiding in termen van bètadiversiteit tussen groepen werd getest door Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrices (PERMANOVA, functie "Adonis" in "vegan"), terwijl verschillen voor spreiding binnen groepen werden getest door Multivariate homogenity of groups dispersions test (PERMDISP , functie "betadisper" in "veganistisch"). Taxa die niet in ten minste 4 monsters aanwezig waren, zijn van de analyse uitgesloten. Verschillen in termen van relatieve taxa-abundanties werden eerst geëvalueerd met de voorlopige Kruskal-Wallis-test tussen 4 groepen en vervolgens verder geëvalueerd met de Wilcoxon-test tussen de volgende vergelijkingsparen: CLM-controle versus CLM HSD, wildling-controle versus wildling-HSD, CLM-controle versus wildling Controle, CLM HSD versus wildling HSD. Voor evaluatie van taxonomische verschillen tussen wildling en CLM werd Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; geraadpleegd op 25 november 2022) gebruikt om de belangrijkste kenmerken op geslachtsniveau te onderscheiden. 61]. LEfSe-resultaten werden vervolgens weergegeven als een staafdiagram, met een scoredrempel voor Lineaire Discriminant Analyse (LDA) hoger dan 1,0. Waar nodig werden p-waarden van meerdere vergelijkingen aangepast door de Benjamini-Hochberg-methode. Een percentage valse ontdekkingen (FDR) kleiner dan of gelijk aan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd: * p kleiner dan of gelijk aan 0,05; ** p Kleiner dan of gelijk aan 0,01; *** p Kleiner dan of gelijk aan 0,001. Functionele verschillen tussen microbiomen met een verschillend NaCl-gehalte in het voedsel (0,5% en 4% NaCl-voedselgehalte) werden geanalyseerd door PICRUSt2, een bio-informaticasoftwarepakket om de functionele inhoud van metagenoom te voorspellen op basis van 16s rDNA-gensequentiegegevens (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/; geraadpleegd op 29 november 2022; PICRUSt2 2.4.1) [62]. De PICRUSt2-pijplijn werd toegepast op representatieve sequenties en hun overvloedstabel uit DADA2 met behulp van standaardparameters (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; geraadpleegd op 29 november 2022). Uit de volledige pijplijnoutput werden metagenomische voorspellingen voor KEGG-orthologie en MetaCyc-routes gebouwd als tabellen, met voorspellende functies als rijen en monsters als kolommen, en gebruikt om de darmmicrobiota-functies in wildling en CLM te vergelijken onder HSD-regime. Voorspellende functies van de microbiële gemeenschap die het meest hebben bijgedragen aan de variatie tussen wildling en CLM door de eerste (PC1), tweede (PC2) en derde hoofdcomponent (PC3) werden geselecteerd voor verdere analyse van HSD-consumptie in de twee modellen. De matrix met de voorspellende functie-abundanties werd vervolgens genormaliseerd, getransformeerd in Centered Log Ratio (CLR)-waarden, en de log2mean-ratio berekend (HSD/Control) voor zowel wildling als CLM. Ten slotte werden de log2mean-verhoudingen tussen de groepen vergeleken met behulp van de Wilcoxon-test en uitgezet als een spijkerschriftgrafiek. Verschillen tussen groepen werden statistisch vergeleken in R-software met behulp van de Wilcoxon-test en Kruskal-Wallis-testfuncties en p-waarden aangepast met de Holm- of Benjamini-Hochberg-methode.

3. Resultaten

3.1. HSD beïnvloedt de diversiteit en samenstelling van CLM en Wildling Gut Microbiota

Om de impact van HSD op een uit het wild afkomstig microbieel ecosysteem bij muizen te onderzoeken, hebben we HSD- of controlediëten aan wildlingmuizen en CLM gevoerd. Muizen werden gedurende twee weken op dieet gehouden en de samenstelling van de fecale darmmicrobiota werd vervolgens onderzocht door middel van 16S RNA-gensequencing uit fecale pellets verzameld op dag 14 (Figuur 1A). In overeenstemming met een eerder rapport werden er geen sterke verschillen gedetecteerd in termen van lichaamsgewicht tussen controle- en HSD-groepen van CLM- en wildling-muizen [29]. Om de verschillende darmmicrobiota tussen de twee modellen CLM en wildling-muizen bij aanvang te beoordelen, schatten we de alfa-diversiteit (Observed of Richness, Chao1, Shannon, Simpson en Inverse Simpson-indexen), bèta-diversiteit (Bray-Curtis-ongelijkheid) en de belangrijkste taxonomische verschillen. In lijn met eerdere studies [54] werd de darmmicrobiota van wilde vogels gekenmerkt door een grotere microbiële rijkdom (Figuur 1B, alle alfa-diversiteitsindexen), evenals een duidelijke en meer heterogene microbiële samenstelling dan CLM (Figuur 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, wildling vs. CLM; en figuur S1). In termen van microbiële kenmerken werden de darmmicrobiota van CLM en wildling-muizen gekenmerkt door verschillende bacteriële taxa (Figuur S1). In lijn met Rosshart et al. [54], bacteriële taxa van wilde muizen behoren tot Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter en het pathogene geslacht Helicobacter, dat het van het wild afkomstige niet-gedomesticeerde profiel van dit model karakteriseerde (Figuur S1).

Figuur 1. HSD-impact op de bacteriële samenstelling van CLM (n=10/groep) en wildling-muizen (n=11 voor wildling Ctrl en n=12 voor wildling-HSD). (A) Experimenteel ontwerp. C57BL/6 CLM- of wildling-muizen werden gevoed met 0,5% NaCl (controle, Ctrl) of 4% NaCl met hoog zoutgehalte (HSD) en darmbacteriën, gekenmerkt door 16S rRNA-genampliconsequencing. (B) Indexen voor alfadiversiteit van fecale darmmicrobiota van CLM en wildling; van links naar rechts worden de volgende indexen weergegeven: Observed (OUT-rijkdom), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Verschillen tussen groepen worden statistisch geëvalueerd met de Wilcoxon-test. (C) Hoofdcoördinatenanalyseplot van de ordening van de bètadiversiteit op basis van de ongelijkheidsmetriek van Bray-Curtis tussen CLM versus wildling (boven), CLM-controle versus CLM HSD (linksonder) en wildling-controle versus wildling HSD (rechtsonder); scheiding en homogeniteit tussen groepen werden respectievelijk berekend met PERMANOVA- en PERMDISP-tests. * p Kleiner dan of gelijk aan 0.05; ** p Kleiner dan of gelijk aan 0.01; **** p Kleiner dan of gelijk aan 0.0001. Figuur 1. HSD-impact op de bacteriële samenstelling van CLM (n=10/groep) en wildling-muizen (n=11 voor wildling Ctrl en n=12 voor wildling-HSD). (A) Experimenteel ontwerp. C57BL/6 CLM- of wildling-muizen werden gevoed met 0,5% NaCl (controle, Ctrl) of 4% NaCl met hoog zoutgehalte (HSD) en darmbacteriën, gekenmerkt door 16S rRNA-genamplicon-sequencing. (B) Indexen voor alfadiversiteit van fecale darmmicrobiota van CLM en wildling; van links naar rechts worden de volgende indexen weergegeven: Observed (OUT-rijkdom), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Verschillen tussen groepen worden statistisch geëvalueerd door de Wilcoxon-test. (C) Hoofdcoördinatenanalyseplot van de ordening van de bètadiversiteit op basis van de ongelijkheidsmetriek van Bray-Curtis tussen CLM versus wildling (boven), CLM-controle versus CLM HSD (linksonder) en wildling-controle versus wildling HSD (rechtsonder); scheiding en homogeniteit tussen groepen werden respectievelijk berekend met PERMANOVA- en PERMDISP-tests. * p Kleiner dan of gelijk aan 0,05; ** p Kleiner dan of gelijk aan 0,01; **** p Kleiner dan of gelijk aan 0,0001.

HSD induceerde een significante vermindering van de bacteriële diversiteit (Figuur 1B, alle alfa-diversiteitsindexen) evenals een significante microbiële verschuiving in de samenstelling van CLM (Figuur 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl versus CLM HSD). Daarentegen werd de darmmicrobiota van wildling-muizen gekenmerkt door een hogere diversiteit bij HSD (Figuur 1B, Observed & Chao1-indexen), afwijkend van CLM, en ze werden ook gekenmerkt door een minder uitgesproken verschuiving van de microbiële samenstelling bij HSD vergeleken met CLM (Figuur 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, wildling Ctrl vs. wildling HSD).

3.2. De darmmicrobiële samenstelling van Wildling-muizen is resistenter tegen HSD dan CLM

Verschillen in bacteriële samenstelling tussen wildling en CLM werden verder taxonomisch gekarakteriseerd. Op fylumniveau waren de meest voorkomende phyla in termen van relatieve overvloed: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, wildlingen: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, wildlingen: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7%, wilde vogels: 0,7 ± 1,3%) en Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%, wilde vogels: 0%/niet gedetecteerd) (Figuur 2). Het darmmicrobiële profiel vertoonde nog meer verschillende hoeveelheden voor alle fyla gedetecteerd in fecale monsters tussen wildlingmuizen en CLM (Figuur 2). Met name de kernmicrobiota-phyla Firmicutes, Bacteroidota en Verrucomicrobiota waren significant verschillend tussen de twee modellen (Figuur 2). Meer specifiek werd op familieniveau een andere bijdrage waargenomen in de microbiota van wilde vogels dan in de CLM-darmmicrobiota voor de meeste bacteriën die eerder werden gerapporteerd als HSD-gevoelig [28], waaronder Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae en Akkermansiaceae (Figuur 3). In overeenstemming hiermee werden vergelijkbare trends op geslachtsniveau bevestigd tussen wildling- en CLM-monsters voor de belangrijkste leden van de bovengenoemde families; hiervan waren de meest representatieve Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum en Akkermansia (figuren S1 en 4). Om de impact van HSD op CLM en de samenstelling van de darmflora van wilde vogels verder te karakteriseren, hebben we ook de impact van het voedingsregime op verschillende classificatieniveaus geanalyseerd. Op fylumniveau werd de met HSD behandelde CLM-darmmicrobiota gekenmerkt door een significante uitputting van Firmicutes en verrijking van Verrucomicrobiota (Figuur 2), maar geen van de belangrijkste fyla werd aangetast door HSD in monsters van wilde vogels (Figuur 2). Op familieniveau werd de CLM-darmmicrobiota gekenmerkt door een significante uitputting van melkzuurproducerende bacteriën zoals Lactobacillaceae, evenals SCFA-producenten zoals Peptostreptococcaceae en Clostridiaceae (Figuur 3). Bovendien hebben we bij HSD-gevoede CLM toenames waargenomen bij Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae en Eggerthellaceae (Figuur 3). Daarentegen beïnvloedde HSD verschillende bacteriefamilies in de darmmicrobiota van wilde vogels, waaronder de twee zeer overvloedige Muribaculaceae en Prevotellaceae, die beide toenamen na HSD (Figuur 3). Bacteriële modulatie die het meest heeft bijgedragen aan het HSD-effect bij CLM omvatte de toename van de geslachten Akkermansia, Parasutterella en Enterorhabdus, evenals de afname van Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens-groep, Muribaculum en Anaerovorax (Figuur 4). Met uitzondering van Roseburia werd geen van de bovengenoemde geslachten aangetast door HSD in de darmmicrobiota van wilde vogels, terwijl het geslacht Anaerovorax een tegenovergestelde tendens vertoonde dan die van CLM (Figuur 4).

Figuur 2. HSD-effect op bacteriële fyla uit de darmmicrobiota van CLM (n=10/groep) en wildling-muizen (n=11 voor wildling Ctrl en n=12 voor wildling-HSD). De totale samenstelling in termen van relatieve fyla-abundantie wordt weergegeven door een staafdiagram per individu (boven) en een boxplot voor specifieke fyla (onder); statistische vergelijkingen werden uitgevoerd tussen groepen door middel van de Wilcoxon-test. * p Kleiner dan of gelijk aan 0.05; ** p Kleiner dan of gelijk aan {{10}}.01; *** p Kleiner dan of gelijk aan 0,001; **** p Kleiner dan of gelijk aan 0,0001.

Figuur 3. Impact van voedselconsumptie met een hoog zoutgehalte op bacteriële families van CLM (n=10/groep) en wildling-muizen (n=11 voor wildling Ctrl en n=12 voor wildling-HSD). De totale samenstelling op gezinsniveau wordt weergegeven door middel van een staafdiagram per individu (bovenaan) en een boxplot voor specifieke gezinnen (onderaan); statistische vergelijkingen werden uitgevoerd tussen groepen door middel van de Wilcoxon-test. * p Kleiner dan of gelijk aan 0.05; ** p Kleiner dan of gelijk aan {{10}}.01; *** p Kleiner dan of gelijk aan 0,001; **** p Kleiner dan of gelijk aan 0,0001.

Figuur 4. Veranderingen in bacteriële geslachten in CLM (n=10/groep) en wildling-muizen (n=11 voor wildling Ctrl en n=12 voor wildling-HSD). De totale bijdrage aan de relatieve overvloed op geslachtsniveau wordt uitgezet als een cirkelvormige staafdiagram per individu (bovenaan) en een boxplot voor specifieke geslachten (onder); statistische vergelijkingen werden uitgevoerd tussen groepen door middel van de Wilcoxon-test. * p Kleiner dan of gelijk aan 0.05; ** p Kleiner dan of gelijk aan 0.01; *** p Kleiner dan of gelijk aan 0,001; **** p Kleiner dan of gelijk aan 0,0001.

3.3. HSD beïnvloedt voorspellende microbiële functies bij CLM, maar niet bij Wildling-muizen

PICRUSt 2-output detecteerde geen enkel significant verschil tussen microbiële gemeenschapsfuncties van wildling-HSD versus onbehandelde wildling-muizen voor zowel KEGG-orthologie als MetaCyc-pathway-annotaties, met als enige uitzondering de door HSD geïnduceerde verhoogde functie van het recG-gen voor een ATP-afhankelijke helicase uit de KEGG-orthologie (Figuur 5A). De HSD-impact op CLM werd gekenmerkt door een significante afname van voorspellende functies voor KEGG-orthologie, waaronder het gen spp (sucrose-6-fosfatase) en pfkA (fosfofructokinase 1), beide betrokken bij het zetmeel- en sucrosemetabolisme, wat in lijn is met eerdere bevindingen [28] (Figuur 5A). Bovendien werd de darmmicrobiota van HSD-gevoede CLM gekenmerkt door verminderde voorspellende functies van genen die betrokken zijn bij membraantransport (feoB voor ijzertransport, AB 2P AB 2 permease-eiwit, AB 2A AB 2 ATP-bindend eiwit), glutaminebiosynthese (glnA) Transcriptieregulator van de LacI-familie (lacI, galR) en transketolase (tktA, tktB) (Figuur 5A). Voor MetaCyc-routes heeft HSD de CLM-darmmicrobiota aanzienlijk verrijkt met voorspellende functies geassocieerd met nitraatreductie (denitrificatieroute), afbraak van galactose (afbraak van D-galactaraat, superroute van afbraak van D-glucaraat en D-galactaraat), afbraak van fenylpropanoaat, zure berging, afbraak van succinaat tot butaanzuur en afbraak van aminozuren (afbraak van aromatische amines, afbraak van L-leucine) (Figuur 5B). Bovendien verloor de HSD-darmmicrobiota in CLM, in lijn met eerdere bevindingen [28], voorspellende functies voor de biosynthese van aminozuren (superroute van de biosynthese van L-alanine, biosynthese van L-lysine), gemengde zuurfermentatie, waarbij aanvullende nieuwe kenmerken verloren gingen zoals N- afbraak van acetylglucosamine/N-acetylmannosamine/N-acetylneuramaat en afbraak van deoxyribonucleosiden (afbraak van pyrimidine en purine, biosynthese van inosine5fosfaat III) (Figuur 5B).

Figuur 5. Vervolg.

Figuur 5. Effect van HSD op de voorspellende metagenomische functies van de darm in CLM (n=10/groep) en wildling (n=11 voor wildling Ctrl en n=12 voor wildling HSD) darmmicrobiota. PICRUSt2-uitvoer uitgezet als spijkerschriftplot voor KEGG Orthologie-annotatie (A) en MetaCyc-paden (B), uitgedrukt als log2 gemiddelde verhouding van het aantal voorspellende functies tussen HSD versus Ctrl-monsters. Alle statistische vergelijkingen werden uitgevoerd tussen Ctrl- en HSD-groepen door middel van de Wilcoxon-test.

4. Discussie

Het is bekend dat de complexe en diverse darmmicrobiota van wilde vogels veerkrachtiger zijn tegen bepaalde ziektemodellen [51] en voedingsregimes, zoals een hoge vetinname [54,55]. Geen enkele eerdere studie heeft echter de effecten van een hoge natriuminname op de in het wild afkomstige darmmicrobiota van muizen geëvalueerd. Hier hebben we voor het eerst onderzocht hoe HSD de darmmicrobiota van wilde vogels beïnvloedt in vergelijking met CLM. Interessant genoeg hebben onze resultaten aangetoond dat het wildlingmicrobioom, vergeleken met CLM, beter bestand is tegen HSD-verstoring op zowel compositorisch als voorspellend functioneel niveau. Het is algemeen bekend dat een hoge zoutinname het risico op verschillende ziekten, zoals cardiovasculaire of auto-immuunziekten, zou kunnen verergeren door de samenstelling van het darmmicrobioom en de immuunhomeostase te veranderen [25,29,31,34,63-65]. In lijn met eerdere rapporten werden door HSD geïnduceerde verschuivingen in de darmmicrobiota bij CLM gekenmerkt door significante veranderingen in microbiële diversiteit, samenstelling en voorspellende functies [28]. Gezondheidsbevorderende bacteriën zoals de Peptostreptococcaceae-familie en de geslachten Lactobacillus, Roseburia en Tuzzerella namen af ​​in termen van relatieve overvloed in CLM, terwijl Akkermansia aanzienlijk toenam in HSDfed-groepen. We hebben ook hogere relatieve hoeveelheden HSD gedetecteerd in Defluvitaleaceae, Enterorhabdus en Parasutterella. Interessant is dat het geslacht Parasutterella een kerncomponent is van de darmmicrobiota van zowel CLM als mensen, waar het zich gedraagt ​​als een accharolyticum en producent van succinaat [66]. Het is bekend dat zowel Enterorhabdus uit de Eggerthellaceae-familie als Parasutterella uit de Sutterellaceae-familie verrijkt zijn bij patiënten met IBD [67,68], wat verder aangeeft hoe HSD de ziekteontwikkeling kan beïnvloeden. Interessant genoeg vertoonden wildlingmuizen echter geen vergelijkbare entiteit van door HSD geïnduceerde microbiële verschuivingen, zoals CLM. Desondanks nam de diversiteit van wilde vogels aanzienlijk toe op HSD voor waargenomen OTU's en Chao1-metrieken, en waren slechts een paar taxa betrokken bij de HSD-verstoring van de darmmicrobiota van wilde vogels, waaronder een toename van Anaerovorax, gekoppeld aan een afname van Erysipelatoclostridium, Roseburia en Lachnospiraceae UCG-004 geslacht. Roseburia was de enige bacteriële signatuur die gewoonlijk werd gedeeld tussen HSD-groepen vergeleken met de overeenkomstige controles, ondanks het feit dat HSD-gevoede CLM nog steeds wordt gekenmerkt door een hogere overvloed aan deze bacterie vergeleken met HSD-gevoede wildlingmuizen. Merk op dat butyraatproducerende bacteriën zoals Roseburia een lagere relatieve overvloed hebben bij patiënten met colitis ulcerosa [69] en er werd ook waargenomen dat deze vermindering gecorreleerd was met het genetische risico op IBD bij menselijke proefpersonen [70]. Dit komt overeen met eerdere bevindingen, waarbij verschuivingen in bacteriële geslachten zoals Roseburia of Lactobacillus geassocieerd bleken te zijn met een risico op hypertensie, mogelijk bevorderd door een westers dieet [71]. De bacteriële samenstelling van de darmen wordt ook geassocieerd met darmmotiliteit en fysiologie [72].

cistanche voordelen voor mannen versterken het immuunsysteem

Het geslacht Anaerovorax is eerder waargenomen bij muizen met abnormale darmfysiologie en verminderde motiliteit [73]; de verrijking van Anaerovorax in HSD voor wilde muizen kan echter leiden tot een andere rol van deze taxa in de context van darmhomeostase en goed functioneren. In lijn met eerdere bevindingen hebben we een toename waargenomen in het geslacht Akkermansia in de HSD-groep van CLM [28], terwijl de darmmicrobiota van wilde muizen was uitgeput van dit geslacht, wat ook consistent is met eerdere onderzoeken naar dit model [51, 53–55]. Hoewel het geslacht Akkermansia een potentieel probioticum is vanwege het positieve effect op het verbeteren van de immunologische en metabolische profielen van de gastheer (bijvoorbeeld bij obesitas en diabetes type 2) [42,74-77], is de rol van dit geslacht nog steeds onduidelijk vanwege zijn negatieve eigenschappen. correlatie met klinische resultaten bij colorectale kanker [78], de ziekte van Parkinson [79,80] en multiple sclerosepatiënten [81]. In overeenstemming met onze eerdere resultaten verkregen met MetaCyc-routes [28], vertoonde CLM na HSD verminderde voorspellende microbiële functies geassocieerd met zetmeel- en sucrosemetabolisme voor KEGG-orthologie. De kleine verschuivingen in de darmbacteriële samenstelling van HSD-gevoede wildling-muizen konden echter geen significante variaties in voorspellende bacteriële functies veroorzaken, wat erop wijst dat van wildling afkomstige darmmicrobiota en metabolische/ecologische netwerken veel stabieler zijn en zich veel gemakkelijker zouden kunnen aanpassen aan HSD-geïnduceerde voedingsvariaties vergeleken met CLM-darmecosystemen, wat verder onderzoek rechtvaardigt. Het vermelden waard is ook de mogelijke invloed van de darmschimmelgemeenschap op het darmbacteriële netwerk op verschillende voedingsregimes. Eerdere studies hebben al gesuggereerd hoe potentiële interacties tussen bacteriën en schimmels betrokken zijn bij de homeostase van het immuunsysteem van de gastheer en de ontwikkeling van ziekten [82-85]. In deze context wordt CLM verder beperkt door hun lagere bacteriële complexiteit vergeleken met wilde muizen, wat de vestiging van een diverse darmmycobiota kan belemmeren [54]. Toekomstige studies zullen de bijdrage van darmschimmelgemeenschappen aan de darmmicrobiota en gastheerimmuniteit kunnen bepalen door gebruik te maken van het wildling-model. Samenvattend levert onze studie gegevens op over hoe een hoge natriuminname een natuurlijk, uit het wild afkomstig microbieel ecosysteem van de darm beïnvloedt in vergelijking met een gedomesticeerde darmbacteriële gemeenschap van CLM. Onze studie toonde aan dat HSD de bacteriële taxa en darmmicrobiota bij wilde muizen niet op dezelfde manier beïnvloedt als voor een gedomesticeerde darmmicrobiota van CLM. Deze divergentie, zoals eerder vermeld voor andere voedingsregimes of aandoeningen zoals vetrijke diëten [54,55], geeft aan dat toekomstig onderzoek nodig is in natuurlijke muizenmodelsystemen om de impact van voedingsinterventies op complexere darmecosystemen te recapituleren en in te schatten. zoals bij mensen.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem