Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Verbetering van de productie van fenylethanoïde glycosiden door een schimmelopwekker in celsuspensiecultuur van Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹, & Xing-guo Mei²

Trefwoorden Cistanche deserticola, schimmelopwekker,fenylethanoïde glycoside, plantencelcultuur

Abstract
Wanneer, op de 15e dag van de groei, een elicitor vanFusarium solaniwerd toegevoegd bij 40 mg l^-1 totCistanche deserticolacelsuspensieculturen, de inhoud van echinacoside, acteoside en totaalfenylethanoïde glycosiden(PeG's) in gekweekte cellen namen in de volgende 27 dagen met meer dan 100 procent toe tot 15 mg g^-1droog gewicht, 9 mg g-1 droog gewicht en 57 mg g^-1 droog gewicht, respectievelijk. De uiteindelijke biomassa (1,3 mg droog wt ml^-1) niet aangetast.

Cistanche deserticola

Invoering

Cistanche deserticolama. (Orobanchaceae), een inheems kruid uit China, wordt veel gebruikt in de traditionele geneeskunde voor verschillende behandelingen, waaronder het gebruik als een kalmerend middel of een versterker van de immuunrespons (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Fenylethanoide glycosiden(PeG's) zijn de belangrijkste bioactieve metabolieten inCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) en zijn samengesteld uit vele componenten zoals echinacoside, acteoside, cisacteoside, isoacteoside, 2-acetylacteoside, cistanoside A en osmanthuside B (Wang et al. 2000). Met de toenemende vraag naar deze producten en de snelle daling van deCistanche deserticolaplanten, zou celkweek een aantrekkelijk alternatief productiemiddel zijn. Veel opwekkers (vooral schimmelopwekkers) kunnen de productie van metabolieten in plantencelkweken verhogen (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) ontdekten dat een schimmelopwekker van Fusarium solani geïsoleerd uit wortelsystemen van beideCistanche deserticolaen zijn gastheer, Halaxylon ammodendron, zou het aminozuurgehalte in calli of . kunnen verbeterenCistanche deserticolaMaar de veranderingen van het PeG-gehalte in deze calluslijn werden niet genoemd in hun onderzoek. In dit artikel werden de effecten van een elicitor van F. solani op de biosynthese van totale PeG's en twee belangrijke bioactieve PeG's (echinacoside en acteoside) en op de veranderingen van celgroei bestudeerd in de suspensiecultuur vanCistanche deserticola.

materialen en methodes

Plantencelculturen
Eelt werd veroorzaakt door schubben vanCistanche deserticolaen gehandhaafd op Gamborg's B5-medium (1968) aangevuld met 0,5 mg indol-3-azijnzuur l^-1, 2 mg kinetine l^-1,en 1 g caseïnehydrolysaat l^-1. De pH werd voor sterilisatie op 6 ingesteld. Alle experimenten werden uitgevoerd in schudkolven van 250 ml, die elk 100 ml medium bevatten op een roterende schudder (120 rpm en 25 graden) onder duisternis. Het inoculum was ongeveer 100 g vers wt l^-1.

effectieve inhoud van cistanche deserticola--fenylethanoïde glycoside

Bereiding van schimmelopwekker

Scheiding van schimmelstam, Fusarium solani en bereiding van schimmelopwekker werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Verschillende hoeveelheden (koolhydraatequivalenten) schimmelopwekker werden op de 15e dag aan de schudkolfculturen toegevoegd (totale kweekperiode was 42 dagen).

Biomassaaccumulatie en levensvatbaarheidstest
Cellen uit een schudkolf werden gewassen met gedestilleerd water en gevriesdroogd tot een constant gewicht. Zo werd het droge gewicht bepaald. De levensvatbaarheid van de cellen (percentage levensvatbare cellen in een celpopulatie) werd bepaald door de reductie van 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (Towill & Mazur 1975).

fenylethanoïde glycosidevancistanche deserticola

Bepaling van de inhoud van echinacoside, acteoside en totaalfenylethanoïde glycosiden(PIN's)
Extractie van PeG's werd uitgevoerd volgens de methode van Du & Liu (1993). GevriesdroogdCistanche deserticolacellen werden geëxtraheerd met 70 procent (v/v) ethanol. De ethanolfractie werd geconcentreerd, ontvet met waterverzadigd ethylacetaat en daarna uitgeloogd met waterverzadigd n-butanol. De n-butanolfractie werd geconcentreerd, opgelost in water, geladen in een harskolom met macroporiën (AB-8, chemisch product van Nankai University, Tianjin, China), en achtereenvolgens geëlueerd met water en methanol. De methanolfractie werd verzameld en het totale PeGs-gehalte werd bepaald door standaard echinacoside te gebruiken bij 334 nm. Echinacoside en acteoside werden bepaald met behulp van de Nova Pak C18-kolom (250 x 4,6 mm) in een HPLC-systeem (water) met een UV-detector (334 nm).

Resultaten

Effect van schimmelopwekker op biomassaaccumulatie en totale PeG's-biosynthese. Effecten van schimmelopwekker op celbiomassa en totale ophoping van PeG's waren afhankelijk van de toegevoegde dosering (koolhydraatequivalenten). Zoals weergegeven in figuur 1, waren lagere doses elicitor gunstig voor het droge gewicht vanCistanche deserticolacellen. De piek was met de elicitor bij 20 mg l^-1(geven 1,76 mg droog wt ml^-1).
De totale accumulatie van PeG's werd significant verhoogd door de schimmelopwekker tussen 20 mg l^-1en 80 mg l^-1. Opwekker bij 40 mg l-1 behaalde de hoogste opbrengst (57 mg g^-1), wat meer dan het dubbele was van wat werd verkregen in de niet-opwekkende controlecultuur. Het verdere experiment gebruikte de schimmelopwekker bij 40 mg1^-1.

Fig. 1. Droog celgewicht en totale accumulatie van PeG's in suspensiecelkweek vanCistanche deserticolaals reactie op verschillende doses schimmelopwekker. Op de 15e dag werd een schimmelopwekker aan het medium toegevoegd. Monsters werden genomen na nog eens 27 dagen. , Uiteindelijk droog celgewicht; ◆, de totale inhoud van PeG. Waarden zijn gemiddelden van drievoudige resultaten en foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties.

Tijdsverloop van celgroei en PeG's-biosynthese
Figuur 2 toont het tijdsverloop van de levensvatbaarheid van de cellen en de biosynthese van PeG's (echinacoside en acteoside) van suspensiecellen nadat kweken waren onderworpen aan een 40 mg l^-1schimmelopwekker op de 15e d. In de daaropvolgende 27 dagen van kweek, echinacoside en acteoside, waren de twee belangrijkste bioactieve PeG's inCistanche deserticola, beide aanzienlijk toegenomen. Op de 39e dag werden beide maximale accumulaties bereikt, tot 14,7 mg g^-1droog gewicht en 8,9 mg g^-1 droog gewicht, respectievelijk. Een significant verschil in cellevensvatbaarheid tussen de met elicitor behandelde kweken en de controle werd niet waargenomen.

Fig. 2. Levensvatbaarheid van de cellen en biosynthese van echinacoside en acteoside in suspensiecelkweek vanCistanche deserticolana behandeling met 40 mg l^-1schimmel opwekker. Schimmelopwekker werd toegevoegd aan het medium op de 15e dag, Echinacoside-behandeld met opwekker; , echinacoside-controle; , met acteoside behandeld met elicitor;○,

acteoside-controle; , cellevensvatbaarheid behandeld met elicitor; , cellevensvatbaarheid-controle. Waarden zijn gemiddelden van drievoudige resultaten en foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties.

Discussie

Veel componenten afgeleid van schimmels (celwandfragmenten, polysachariden, oligosachariden, glycoproteïnen, enz.) zijn gebruikt als verschillende schimmelopwekkers bij de productie van secundaire metabolieten bij veel plantencelsoorten. In dit artikel wordt het homogenaat (voornamelijk samengesteld uit polysachariden) van schimmelstam Fusarium solani geïsoleerd uit wortelstelsels vanCistanche deserticolaen Halaxylon ammodendron bleek een effectieve opwekker te zijn voor de biosynthese van PeG's in de celkweek vanCistanche deserticola. Het gebruik van deze elicitor om de synthese van PeG's in cellen te stimuleren was niet alleen significant, maar werd ook snel na opwekking aangetoond. Deze conclusie kwam overeen met enkele eerdere studies over plantencelcultuur (Wang et al. 2001).

In de vorige studie van Li et al. (1998), toen een schimmelopwekker van F. solani aan het kweekmedium werd toegevoegd, werd callus geïnduceerd uit de zaden vanCistanche deserticolain de daaropvolgende subcultuur op lange termijn in leven kunnen blijven en de productie van iridoïden kan worden verbeterd. Het gaf aan dat gekweekte cellen secundaire metabolieten van ziekteresistentie kunnen synthetiseren wanneer ze worden aangevallen door micro-organismen. Hoewel iridoïden niet werden bepaald in ons experiment, hebben we aangetoond dat polysachariden van F. solani kunnen worden gebruikt als effectieve schimmelopwekkers bij de productie van PeG's metCistanche deserticolacellen.

effectieve inhoud van cistanche deserticola--fenylethanoïde glycoside

Uit: ' Verbetering vanfenylethanoïde glycosidenproductie door een schimmelopwekker in celsuspensiecultuur vanCistanche deserticola' door Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437-1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Gedrukt in Nederland.

Referenties

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Studie van de sterke effecten vanCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. en Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. China J. Chin. Mater. Med. 26: 143-146.
Du NS, Liu JL (1993) Bepaling vanfenylethanoïde glycosideninCistanche deserticoladoor macrovesiculaire harsspectrofotometrie. nat. Prod. Onderzoek Ontwikkelen. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutriëntenvereisten van suspensieculturen van sojawortelcellen. Exp. Cel res. 50: 151-158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Studie van de chemische bestanddelen en farmacologische effecten vanCistanche deserticolama. en Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Kin. traditie. Kruid. Geneesmiddelen 26: 143-146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Effect van elicitor van Fusarium solani op het aminozuurgehalte vanCistanche deserticolaeelt. China J. Northwest Pharm. 13: 247-248.
Towill LE, Mazur P (1975) Onderzoek naar de reductie van 2,3,5-trifenyltrazoliumchloride als levensvatbaarheidstest voor plantenweefselculturen. Kan. J. Bot. 53: 1097-1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Verbetering van de productie en uitscheiding van taxol in Taxus Chinensis-celcultuur door schimmelopwekking en mediumvernieuwing. toepassing microbiologisch. Biotechnologie. 55: 404-410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Analyse vanfenylethanoïde glycosidein het extract van kruiden Cistanchis door LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Zonde. 35: 839-842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Remming van stikstofmonoxide door fenylethanoïden in geactiveerde macrofagen. EUR. J. Farm. 400: 137-144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Effecten van salicylzuur op door schimmelopwekkers geïnduceerde membraan-lipideperoxidatie en taxolproductie in celsuspensieculturen van Taxus Chinensis. Proc. Biochem. 37: 477-482.