Hoe niertubulaire cellen te beschermen die zijn aangetast door gentamicine-geïnduceerde apoptose?
Mar 10, 2022
Beschermende effecten van Zhibai Dihuang Wan op niertubulaire cellen die zijn aangetast door gentamicine-geïnduceerde apoptose
Voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com
trefwoorden: acuut nierziekte, apoptose, Gentamicine,Nierbuiscel, nier.
Abstract
Etnofarmacologische relevantie: Zhibai Dihuang Wan (ZDW) is een oud traditioneel Chinees medicijn dat bestaat uit acht kruideningrediënten en is gebruikt voor de behandeling van chronischenierontstekingen en diabetes gedurende duizenden jaren. Niettemin is de invloed van ZDW op acutenierletsel is nog niet bekend. We wilden de invloed van ZDW op celgroei identificeren engentamicine-geïnduceerd apoptotisch letsel bijrenale tubulaire cellen.
Materialen en methoden: we hebben ZDW geëxtraheerd met kunstmatige darmvloeistof en behandelde ratrenale tubulaire cellen(NRK-52E) met verschillende concentraties van de ZDW-extractie. Celproliferatie engentamicine-geïnduceerdapoptosevan NRK-52E-cellen werden geëvalueerd met respectievelijk real-time proliferatiemonitoring en annexine V-kleuring. Western-blotting werd gebruikt om de niveaus van Bcl-2- en caspase-3-expressie te evalueren. Het effect van ZDW opgentamicine-geïnduceerdnierverwonding werd ook gevolgd bij muizen met behulp van de terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde biotinylated UTP nick end labeling (TUNEL) -assay en de meting van serumcreatinine en bloedureumstikstof.
Resultaten: We ontdekten dat 30 μg/ml ZDW de celproliferatie van de rat bevorderderenale tubulaire cellen. ZDW drukte ook een dosisafhankelijk beschermend effect uit tegen:gentamicine-geïnduceerdapoptosein de cellen. Voorbehandeling met 3 μg/ml of 30 μg/ml ZDW verhoogde Bcl-2 maximaal en verlaagde gesplitste caspase-3 in degentamicine-behandelde NRK-52E-cellen. Van de kruideningrediënten van ZDW, alleen Phellodendron amurense Rupr., schors (Cortex Phellodendri), en Anemarrhena asphodeloides Bunge, remde wortelstok zowel degentamicine-geïnduceerde Bcl-2 afname en gesplitste caspase-3 toename. Phellodendron amurense Rupr., schors en Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok ook geremdgentamicine-geïnduceerdapoptosebij bepaalde concentraties; deze twee ingrediënten waren echter minder effectief dan ZDW. In het muismodel vangentamicine-geïnduceerde nefropathie, verminderde de ZDW-behandeling apoptotische cellen in de niercortex aanzienlijk en verbeterde de nierfunctie.
Conclusies: Onze resultaten suggereren dat ZDW bij adequate doses verzwaktgentamicine-geïnduceerd apoptotisch letsel bijrenale tubulaire cellenen beschermt ooknierenvangentamicine-geïnduceerde verwonding bij muizen.
1. Inleiding
Kruidengeneesmiddelen worden al eeuwenlang gebruikt om verschillende ziekten te behandelen, vooral in de Chinese samenleving. Onlangs zijn de mogelijke bijwerkingen van kruiden op denierzijn gemeld (Isnard Bagnis et al., 2004). In 1991 rapporteerden nefrologen in België over veel jonge vrouwen die extracten van Chinese kruiden hadden ingenomen die Aristolochia fang chi bevatten in dieetregimes en met verschillende gradaties van nierfalen (Vanherweghem et al., 1993). De blootstelling aan de onbedoeld toegevoegde Aristolochia-plant die aristolochic acid (AA) bevat, bleek de belangrijkste oorzaak te zijn van nierbeschadiging, urotheelcel-atypie en carcinoom (De Broe, 2012). Aangezien de traditionele Chinese geneeskunde over het algemeen wordt beoefend in Taiwan en het vasteland van China, komt AA-nefropathie veel voor in deze gebieden en is het een potentieel probleem voor de volksgezondheid (Grollman, 2013). De meeste nefrologen in Taiwan raden patiënten aan om traditionele kruidengeneeskunde te vermijden. Niettemin zijn sommige traditionele kruidengeneesmiddelen veelbelovend gebleken bij de behandeling van:nierziekte in preklinische studies of klinische onderzoeken (Wojcikowski et al., 2006; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Hoewel het vermijden van het gebruik van Aristolochia-planten in kruidengeneesmiddelen essentieel is, zijn kruidengeneesmiddelen nog steeds potentiële kandidaten voor de behandeling van bepaaldenierziekten.
Klik voor Cistanche-effecten voor bijnier
Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), een polyherbal-formule, is gebruikt om chronische te behandelennierontstekingen en diabetes gedurende duizenden jaren. ZDW is gemaakt van Cornus officinalis Siebold & Zucc (13,8 procent), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken (Radix Rehmanniae preparata, 27,6 procent), Dioscorea oppositifolia L. (13,8 procent), Phellodendron amurense Rupr., bast (Cortex Phellodendri, 6,9 procent), Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok (6,9 procent), Paeonia suffruticose Andrews, wortelschors (Moutan Cortex, 10,3 procent), Alisma Plantago-Aquatica L., wortelstok (Rhizoma Alismatis, 10,3 procent) en Poria cocos (Schw.) Wolf (10,3 procent), en bevat geen Aristolochia. Onder deze ingrediënten zijn Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken, Phellodendron amurense Rupr., schors en Poria cocos waarvan gemeld is dat ze gunstig zijn voor diabetische nefropathie of chronisch nierletsel in diermodellen (Yokozawa et al., 2004; Kim et al., 2008; Jiang et al., 2012; Zhao et al., 2013). ZDW zonder Anemarrhena asphodeloides Bunge en Phellodendron amurense Rupr., bast had ook een gedeeltelijk beschermend effect op vroege diabetische nefropathie bij ratten (He et al., 2007). Deze bevindingen suggereren dat ZDW mogelijk beschermende effecten heeft tegen nierbeschadiging. De invloed van ZDW op celgroei enapoptosevanrenale tubulaire cellenis nog onduidelijk.
Gentamicineis een veelgebruikt aminoglycoside-antibioticum voor de behandeling van gramnegatieve bacteriële infecties, maar het veroorzaakt acutenierletsel bij ongeveer 30 procent van de patiënten (Singh et al., 2012). In proximale tubulaire cellen van de nieren induceertapoptoseis een belangrijk cytotoxisch mechanisme vangentamicine(Servais et al., 2006).Gentamicineinduceertapoptosevia een mitochondrion-gemedieerde signaalroute, inclusief afnemende Bcl-xL en toenemende gesplitste caspase -3 en -9 (Ali, 2003; Juan et al., 2007). Tot op heden is er geen ideale klinische remedie om te voorkomengentamicine-geïnduceerde acutenierblessure. In deze studie hebben we de invloed van ZDW opgentamicine-geïnduceerdapoptoseinrenale tubulaire cellenin vitro en in vivo. Onze gegevens onthulden het beschermende effect van ZDW opgentamicine-behandeldrenale tubulaire cellenen toonde verder bijdragen van zijn ingrediënten aan het beschermende effect van ZDW.
2. materialen en methoden
2.1. Reagentia en bereiding van ZDW
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), foetaal kalfsserum en weefselkweekreagentia werden verkregen van Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, VS). Alle andere chemicaliën van reagenskwaliteit werden verkregen van Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, VS). De poeders van ZDW (batch no. 051941) en de ingrediënten (Cornus officinalis Siebold & Zucc, batch no. C810Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., root, gebakken, batch nr. C730N; Dioscorea oppositifolia L., partij nr. C624N; Phellodendron amurense Rupr., bast, partij nr. C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok, partij nr. C805N; Paeonia sufruticosa Andrews, wortelschors, batchnummer C813Y; Alisma Plantago-Aquatica L., rhizoom, batchnummer C819N; Poria cocos (Schw.) Wolf, batchnummer C827N) werden gekocht bij SunTen Pharmaceutical Co. (Taipei, Taiwan). Volgens de instructies van de fabrikant 29 g van het 8-kruidenmengsel (4 g Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 g Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken, 4 g Dioscorea oppositifolia L., 2 g Phellodendron amurense Rupr., schors, 2 g Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok, 3 g Paeonia suffruticose Andrews, wortelschors, 3 g Alisma Plantago-Aquatica L., wortelstok en 3 g Poria cocos (Schw.) Wolf) werd gekookt in 290 ml van gedestilleerd water gedurende 4 uur bij 100 1C, gefiltreerd, gevriesdroogd om 7,5 g droge extracten op te leveren, en vervolgens gemengd met 2,2 g maïszetmeel en 5,3 g poedervormige cellulose om 15 g ZDW te genereren. Alle kruiden werden geverifieerd door een professor in de kruidengeneeskunde van het Brion Research Institute of Taiwan, ROC. }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. - NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., schors - NHP-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok - NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, wortelschors- NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., wortelstok - NHP-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf - NHP -00309). De kruidengeneesmiddelen (0,1 g) werden verteerd met 1 ml kunstmatige darmvloeistof (1 procent pancreatine, 50 mM kaliumdiwaterstoffosfaat, pH 7,5) bij 37 1C gedurende 2 uur, gefiltreerd door 0.22- μ m filters, en vervolgens toegepast in celexperimenten. Bovendien werd alleen kunstmatige darmvloeistof ook gedurende 2 uur bij 37 1C geïncubeerd, gefiltreerd door 0.22- μm-filters en vervolgens toegepast in controlegroepen.
2.2. Vingerafdrukanalyse door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC)
De kwaliteit van ZDW werd gemeten met HPLC. In het kort werd {{0}}.1 g ZDW-poeder 2 uur bij kamertemperatuur opgelost in demonisch water, gefiltreerd door {{10}}.22- μm filters en vervolgens toegepast in HPLC-analyse. Honderd μl van de oplossing werd aangebracht op een 250 4,6 mm C18-kolom (Grace. Columbia, VS) met behulp van een Waters HPLC-systeem uitgerust met een 60{{18 }} controller en een 996 fotodiode-arraydetector (Waters, St. Massachusetts, VS). Het monster werd vervolgens geëlueerd met een 0-95 procent lineaire methanolgradiënt in demonisch water, pH 7,0, gedurende 60 minuten bij een stroomsnelheid van 0,8 ml/min. De eluenten werden gedetecteerd en gekwantificeerd bij 254 nm van 0 min tot 60 min bij kamertemperatuur. De analyse is 10 keer uitgevoerd en de resultaten zijn consistent.
2.3. Cel cultuur
We kochten proximale tubulaire cellen van ratten (NRK-52E) van het Bioresource Collection and Research Center (Hsinchu, Taiwan). De cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met antibioticum/antischimmeloplossing en 10 procent foetaal runderserum. Ze werden gekweekt totdat de monolaag confluent werd. De gekweekte cellen werden vervolgens voor het experiment een nacht in het serumvrije medium gekweekt. ZDW-extracten door kunstmatige darmvloeistof werden toegevoegd aan uitgehongerde cellen in de aangegeven concentratie en geïncubeerde kunstmatige darmvloeistof werd toegepast als een controlebehandeling. Na 24 uur incubatie werden celmonsters geoogst en aangebracht inapoptoseanalyse en Western blotting-analyse.
2.4. Realtime monitoring van celproliferatie
Om celproliferatie te volgen, gebruikten we het "xCELLigence" -systeem van Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN, VS). NRK-52E-cellen werden in tweevoud uitgezaaid in E-platen met een dichtheid van 10.000 cellen/putje. E-platen werden vervolgens overgebracht naar het xCELLi-glance RTCA DP-instrument voor geautomatiseerde real-time monitoring in een bevochtigde incubator met 5 procent CO2 bij 37 1C. Na 24 uur werden de cellen in de E-platen een nacht uitgehongerd. Voor de proliferatietest werden gedurende 30 minuten ZDW-extracten aan de cellen toegevoegd en vervolgens 3 mmol/lgentamicineaan de cellen is toegevoegd. De celindex, een willekeurige eenheid die de impedantie van de celsensor weerspiegelt, werd elke 15 minuten gemeten. Hellingberekening werd uitgevoerd met de RTCA-softwareversie 1.2 (Roche Applied Sciences). Er werden drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd.
2.5. Apoptose detectie
Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-annexine V/propidiumjodide (PI) dubbele kleuring werd gebruikt omapoptoseveroorzaakt doorgentamicinebehandeling. Behandelde NRK-52E-cellen werden geoogst en tweemaal gewassen met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Specifieke binding van FITC-annexine V en gekleurd met PI werden uitgevoerd met behulp van eenapoptosedetectiekit (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA, VS), volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie.
2.6. Western-blot-analyse
Twintig microgram NRK-52E-eiwitlysaat werd op elke baan van de blotstrip aangebracht en geanalyseerd met Western-blotting. Antilichamen voor Bcl-2 en caspase-3 werden gekocht bij Cell Signaling Technology (Danvers, MA, VS) en 1:1000 verdund voor de test. Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd gedetecteerd als een laadcontrole. Relatieve niveaus van de eiwitbanden werden gekwantificeerd met behulp van Quantiscan-software (Biosoft, Cambridge, Verenigd Koninkrijk).
2.7. Dieren en behandelingen
Mannelijke BALB / c-muizen van 8 weken oud en met een gewicht van 20-25 g werden verkregen van BioLasco Taiwan (Taipei, Taiwan). Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Taipei Medical University Committee of Experimental Animal Care and Use. Dieren werden gehuisvest in een centrale faciliteit, onderworpen aan een 12- uur licht-donkercyclus en voorzien van regelmatig rattenvoer en kraanwater. De experimentele groep muizen (n¼6) voorgentamicinebehandeling werden onderworpen aan intraperitoneale (IP) injectie metgentamicine(20 mg/kg/dag) gedurende 10 dagen. Het ZDW-poeder (1 of 2 g/kg) werd vooraf in zoutoplossing opgelost en oraal toegediendgentamicineelke keer injecteren. Muizen in de controlegroep (n¼6) kregen oraal en intraperitoneaal zoutoplossing toegediend. Alle muizen werden 1 dag na hun laatste injectie verdoofd door pentobarbital 30-50 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal te gebruiken (Sigma, St. Louis, MO). Dieren werden vervolgens gedood terwijl ze nog onder het effect van anesthesie waren, en bloedmonsters werden uit het hart verzameld voor de meting van serumcreatinine en bloedureumstikstof. Denierenwerden geoogst door laparotomie en het niercortexweefsel werd snel ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80C.
2.8. In situ terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde biotinyleerde UTP nick end labeling (TUNEL) test
Bevroren weefselcoupes (4 μ m) van denierwerden verwerkt met de ApopTag Fluorescein in situapoptosedetectiekit (CHEMICON International, Inc., CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Kort,nierweefselglaasjes werden voorbehandeld met proteïnase K en H2O2en geïncubeerd met het reactiemengsel dat terminale deoxynucleotidyltransferase (TdT) en digoxigenine-geconjugeerd dUTP bevat gedurende 1 uur bij 37 1C, gemonteerd met een montageoplossing die PI bevat, en uiteindelijk waargenomen met fluorescentiemicroscopie.
2.9. statistische analyse
Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden 7 standaarddeviaties (SD's). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van Student t-tests, waarbij P 0.05 als statistisch significant werd beschouwd.
3. Resultaten
3.1. Invloed van ZDW op celproliferatie
Voor de kwaliteitscontrole van ZDW hebben we HPLC gebruikt om het vingerafdrukchromatogram vast te stellen zoals weergegeven in Fig. 1. We hebben eerst de invloed van ZDW-extracten op de proliferatie van de NRK-52E-cellen onderzocht. Om de gastro-intestinale omgeving na te bootsen, werd ZDW verteerd en geëxtraheerd met behulp van kunstmatige darmvloeistof en vervolgens toegepast in celexperimenten.
Bij real-time monitoring van celproliferatie toonden zowel proliferatiecurven als hellingen aan dat de cellen behandeld met 30 g / ml ZDW hogere proliferatiesnelheden hadden in vergelijking met de met kunstmatige darmvloeistof behandelde controlecellen (Fig. 2A en B). Daarentegen verminderde 300 g/ml ZDW de proliferatiesnelheden aanzienlijk. De dosering van 30 μ g/ml ZDW bevat 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., schors, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, wortelschors, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., wortelstok en 4 μ g/ml Poria cocos (Schw.) Wolf. Deze doseringen van de ingrediënten verminderden echter de proliferatie van NRK-52E-cellen (Fig. 2C).Gentamicineremde significant de celgroei en verlaagde zelfs de celnummerindex, die gedeeltelijk herstelde met behandeling met 3 of 30 g / ml ZDW zoals getoond in Fig. 2A. Hoge doses ZDW (300 g/ml) verhoogden het remmende effect vangentamicineop celproliferatievermogen. Onze resultaten suggereren dat een lage dosis ZDW (3–30 g/ml) de proliferatie van NRK-52E-cellen bevordert, zelfs in de aanwezigheid vangentamicinebehandeling.
3.2. Invloed van ZDW op apoptose
Vervolgens evalueerden we de invloed van ZDW-extracten op degentamicine-geïnduceerdapoptosein NRK{{0}}E-cellen door annexine V/PI-kleuring en flowcytometrie. Zoals getoond in Fig. 3, induceerden ZDW-extracten van 0,3 tot 300 g/ml geen significanteapoptosein NRK-52E-cellen. Blootstelling aan 3 mmol/lgentamicineduidelijk verhoogde apoptotische cellen. Voorbehandeling van de cellen met ZDW aanzienlijk verminderdgentamicine-geïnduceerdapoptoseop een dosisafhankelijke manier, en het remmende effect piekte bij 30 g/ml en nam af bij 300 μg/ml ZDW (Fig. 3).
ZDW haalt beschermde NRK-52E-cellen uitgentamicine-geïnduceerdapoptose. Om dit resultaat te bevestigen, hebben we ook de invloed van ZDW op de apoptotische signaalroute geïnduceerd doorgentamicine. In normale NRK{{0}}E-cellen hadden ZDW-concentraties van 0,3 tot 300 g/ml geen significante invloed op de expressie van Bcl-2 en de splitsing van caspase-3 (Fig. 4).Gentamicinebehandeling verminderde significant de expressie van Bcl-2 en veroorzaakte splitsing van caspase-3 in NRK-52E-cellen. Voorbehandeling van cellen met ZDW verbeterde de expressie van Bcl-2 ingentamicine-behandelde cellen, en aanzienlijk verminderdgentamicine-geïnduceerde caspase-3 splitsing (Fig. 4).
3.3. Invloed van ZDW-ingrediënten op apoptose
De resultaten lieten zien dat de meest effectieve concentratie van ZDW dicht bij 30 μg/ml lag. In theorie bevat 30 μ g/ml ZDW 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., schors, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, wortelschors, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., wortelstok en 3 μ g/ml Poria-kokos. De extracten van deze ingrediënten in de aangegeven concentraties hadden echter geen invloed op de proliferatie van NRK-52E-cellen, zoals blijkt uit real-time monitoring van celproliferatie (gegevens niet getoond). We hebben de ingrediënten van ZDW verder afzonderlijk gecontroleerd op hun effecten op de expressie van Bcl-2 en caspase-3 splitsing vangentamicine-behandelde NRK-52E-cellen. Fig. 5 laat zien dat Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., wortel, gebakken, Dioscorea tegenover, Paeonia suffruticose Andrews, wortelschors, Alisma Plantago-Aquatica L., wortelstok en Poria cocos hadden geen invloed op de expressie van Bcl-2 en caspase-3 splitsing ingentamicine-behandelde cellen. Slechts 0,2 μg/ml Phellodendron amurense Rupr., bark en Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma bij 4 en 60 μg/ml remden beidegentamicine-geïnduceerde afname van Bcl-2 en toename van caspase-3-splitsing tegelijkertijd (Fig. 5).
Net als bij de Western-blotresultaten, onthulde annexine V/PI-kleuring dat Phellodendron amurense Rupr., blaf bij 0,2 g/ml en Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma bij 4 en 60 μg/ml significant remdegentamicine-geïnduceerdapoptose(Afb. 6). De andere kruideningrediënten hadden geen anti-apoptotisch effect opgentamicine-behandelde NRK-52E-cellen zoals onthuld door flowcytometrie (gegevens niet getoond). ZDW bevat 6,9 procent Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma. De dosering van 60 g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma was ruim boven de hoeveelheid in 300 μg/ml ZDW, de hoogste dosering die in dit onderzoek werd gebruikt. De Phellodendron amurense Rupr., schorsdosering van 0,2 g/ml was vergelijkbaar met de hoeveelheid Phellodendron amurense Rupr., schors in 3 μg/ml ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma dosering van 4 μg/ml lag dicht bij de hoeveelheid Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma in 30 μg/ml ZDW. De ZDW-concentraties van zowel 3 als 30 g/ml hadden significante anti-apoptotische effecten (Fig. 2), die gedeeltelijk het gevolg kunnen zijn van Phellodendron amurense Rupr., bark, en Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma.
3.4. Beschermend effect van ZDW op de nieren
Het beschermende effect van ZDW opgentamicine-geïnduceerdapoptosewerd verder bewezen in een muisdiermodel. Muizen werden behandeld metgentamicine(20 mg/kg/dag) of zoutoplossing als controles; de experimentele groepen werden daarnaast behandeld met ZDW (1 of 2 g/kg/dag). Aan het einde van de behandelperiode (9 dagen)nierenwerden geoogst door laparotomie en in secties gesneden voor in situ TUNEL-assays. Zoals getoond in Fig. 7, zijn de kernen inniersecties werden onthuld als heldere vlekken gekleurd met PI. De verspreide en heldere kernen die door TUNEL waren gekleurd, konden in de hele niercortex worden gedetecteerdgentamicine-behandelde dieren, maar ze werden zelden gedetecteerd in de controlemonsters. ZDW behandeling verlaagdgentamicine-geïnduceerde apoptotische kernen op een dosisafhankelijke manier. De meeste van de TUNEL-gelabelde kernen werden gezien in het epitheel van de proximale tubulus. ZDW remde de in vivogentamicine-geïnduceerde celapoptosein ratrenale tubulaire cellen. De nierfunctie van de experimentele muizen werd ook gevolgd door de concentratie van bloedureumstikstof en serumcreatinine te meten.
Fig. 8 laat zien dat de concentraties bloedureumstikstof en serumcreatinine verhoogd waren in degentamicine-behandelde groepen, en behandeling met ZDW remde deze significantgentamicine-geïnduceerde stijgingen. Deze resultaten suggereren dat ZDW in vivo een nierbeschermend effect uitdrukt.
4. Discussie
In deze studie hebben we ons gericht op het effect van ZDW opgentamicine-geïnduceerdapoptosebij ratten proximaalrenale tubulaire cellen. De belangrijkste bevindingen toonden aan dat ZDW (3 en 30 μg/ml) verzwaktegentamicine-geïnduceerde apoptotische schade in NRK-52E-cellen (Fig. 3). Voorbehandeling van ZDW ook geremdgentamicine-geïnduceerde apoptotische signalen, waaronder afname van Bcl-2 en toename van caspase-3 splitsing (Fig. 4). In een muismodel vangentamicinetoxiciteit, verminderde de ZDW-behandeling apoptotische cellen in de niercortex significant en verbeterde de nierfunctie (figuren 7 en 8). Onze resultaten suggereren dat ZDW beschermtrenale tubulaire cellenvangentamicine-geïnduceerdapoptose. Daarnaast vonden we ook dat 30 μg/ml ZDW de proliferatie van NRK- 52E-cellen bevorderde (Fig. 2), wat zou kunnen bijdragen aan het herstel van niertubuli vanacuutnierziekte. De hoge dosis ZDW (300 g / ml) verminderde echter de celproliferatie en het anti-apoptotische effect ervan nam ook af (Fig. 2 en 3). Deze resultaten laten zien dat ZDW in hoge doses cytotoxisch is voorrenale tubulaire cellen. Daarom stellen we voor dat de toediening van ZDW in adequate doses gunstig zou zijn voor patiënten met:gentamicine-geïnduceerdnierblessure.
De kruidengeneesmiddelen die in de celexperimenten werden gebruikt, werden verteerd en geëxtraheerd met behulp van kunstmatige darmvloeistof die pancreatine bevat. Pancreatine is samengesteld uit amylase, lipase en protease. In principe kunnen de biologisch toegankelijke moleculen in kruidengeneesmiddelen worden verkregen met behulp van een laboratoriumgebaseerde extractie die de gastro-intestinale omgeving nabootst in details zoals aanwezige chemicaliën en enzymen, temperatuur, blootstellingstijden en pH. In ons systeem,renale tubulaire cellenhadden een kans om te interageren met de biologisch toegankelijke moleculen in kruidengeneesmiddelen, maar niet met de grondstoffen. De effectieve biologisch toegankelijke moleculen van ZDW in ons systeem zijn nog onbekend. Absorptie van ZDW detecteren inrenale tubulaire cellenis tot nu toe moeilijk omdat er geen geschikt doelwit is om te monitoren. De kunstmatige darmextracten van ZDW oefenden echter een dosisafhankelijk effect uit in cellulaire experimenten. Deze experimenten suggereren dat de kunstmatige darmextracten van ZDW effectieve biologisch toegankelijke moleculen bevatten die inwerken op niertubulaire cellen. Aan de andere kant, oraal ZDW ook dosisafhankelijk tot expressie gebracht nierbeschermend effect ingentamicine-behandelde muizen (Fig. 7 en 8). Deze gegevens impliceren dat de effectieve moleculen van de kunstmatige darmextracten van ZDW ook kunnen voorkomen in denierenvan met ZDW behandelde muizen. Onze resultaten laten farmacologische consistentie zien tussen de cellulaire studies met kunstmatige darmextracten van kruidengeneesmiddelen en de dierstudies met orale kruidengeneesmiddelen. De toepassing van kunstmatige darmvloeistoffen in cellulaire studies is onlangs beschikbaar. In Caco-2-cellen werden kunstmatige darmvloeistoffen gebruikt om de cellulaire opnamekenmerken van L-valyl-ara-C te onderzoeken (Cheon et al., 2006). De orale biologische beschikbaarheid van bodemverontreinigingen werd in vitro gemeten met behulp van kunstmatige darmvloeistoffen (Ellickson et al., 2001). De biotoegankelijkheid van arseen in verschillende rijstsoorten werd ook bestudeerd met behulp van een in vitro gastro-intestinaal vloeistofsysteem (He et al., 2012). Kunstmatige gastro-intestinale extractie leverde resultaten op die redelijk overeenkwamen met klinische metingen van de biologische beschikbaarheid van arseen gemeten door urineonderzoek bij volwassen mensen na inname van arseenbevattende traditionele Chinese geneeskunde (Koch et al., 2007). Bovendien zal pancreatine in de kunstmatige darmvloeistof zelfverteerd worden en zijn enzymatische activiteit verliezen tijdens 37 1C-incubatie. De concentratie pancreatine in celexperimenten was ook erg laag (0,3 30 ppm). De invloed van pancreatine op celproliferatie enapoptoseis zeer beperkt. We suggereren dat kunstmatige extractie van darmvocht een van de ideale extractiemethoden is voor traditionele kruidengeneesmiddelen in celcultuurexperimenten.
Onder de kruideningrediënten van ZDW, alleen Phellodendron amurense Rupr., schors en Anemarrhena asphodeloides Bunge, wortelstok geremdgentamicine-geïnduceerdapoptosebij bepaalde concentraties (Fig. 5 en 6). Phellodendron amurense Rupr., schors en Anemarrhena asphodeloides Bunge, zou de wortelstok een rol moeten spelen bij het beschermende effect van ZDW in NRK-52E-cellen. Phellodendron amurense Rupr., schors bevat een aantal alkaloïden zoals berberine, palmatine en jatrorrhizine. Phellodendron amurense Rupr., de bast is een bekend ontstekingsremmend middel (Mori et al., 1995; Uchiyama et al., 1989) en vermindert oxidatieve stress in denierenvan diabetische ratten (Kim et al., 2008). Anemarrhena asphodeloides Bunge wordt veel gebruikt in traditionele Chinese medicijnen. De wortelstokken van Anemarrhena asphodeloides Bunge hebben antidiabetische, antibloedplaatjesaggregatie- en diuretische activiteiten (Takahashi et al., 1985). Timosaponinen geïsoleerd uit de wortelstokken van Anemarrhena asphodeloides Bunge onderdrukt de bloedplaatjesaggregatie en AA-geïnduceerde superoxidegeneratie in menselijke neutrofielen (Zhang et al., 1999a, 1999b). Anemarrhena asphodeloides Bunge speelt ook een cruciale beschermende rol bij ischemie-geïnduceerd hersenletsel (Oh et al., 2007). In tegenstelling tot ZDW, Phellodendron amurense Rupr., bark en Anemarrhena asphodeloides Bunge, bracht wortelstok anti-apoptotische effecten tot expressie over een beperkt concentratiebereik (Fig. 3 en 6). Bovendien bevorderde 30 g / ml ZDW celproliferatie, maar alle ingrediënten in 30 g / ml ZDW verminderden in plaats daarvan de celproliferatie (Fig. 2C). Dit resultaat suggereert dat het proliferatiebevorderende effect van ZDW mogelijk niet het gevolg is van de afzonderlijke ingrediënten. Het beschermende effect van ZDW kan, althans gedeeltelijk, het gevolg zijn van synergetische effecten veroorzaakt door de ingrediënten of van het genereren van gemodificeerde moleculen die worden gevormd in de farmaceutische bereidingsprocessen van ZDW. Traditioneel geloven veel Chinese geneeskundigen dat een meervoudige kruidenformule meestal effectiever is dan een enkelvoudig kruidengeneesmiddel, wat wordt ondersteund door onze resultaten.
In deze studie is degentamicineconcentratie toegepast in de celcultuurexperimenten was vergelijkbaar met eerder gepubliceerde onderzoeken (Juan et al., 2007).Gentamicineconcentraties van 1-3 mmol/l effectief geïnduceerdapoptoseinrenale tubulaire cellen, en dit concentratiebereik ligt dicht bij de in vivonierniveaus gevonden tijdensgentamicineantimicrobiële behandelingen bij muizen en ratten (El Mouedden et al., 2000a, 2000b; Sandoval en Molitoris, 2004; Servais et al., 2005). Met andere woorden, degentamicineconcentraties die in dit in vitro-onderzoek werden gebruikt, waren vergelijkbaar met de concentraties die werden gevonden in muizennierenin vivo tijdensgentamicinebehandeling. In ons muizenexperimentgentamicineeenmaal daags 20 mg/kg intraperitoneaal werd toegediend, engentamicine-geïnduceerdapoptosewerd waargenomen bij de muisnieren(Afb. 7). Deze dosering wordt voorgesteld als gelijke onderhoudsdoses voor een volwassen patiënt met een geschatte creatinineklaring van 90 ml/min (El Mouedden et al., 2000a). Bovendien was de beschermende dosering van ZDW in dit onderzoek 1 tot 2 g/kg/dag. Een muis is 7 tot 8 keer minder metabolisch efficiënt dan een mens. Gezien het verschil tussen de stofwisselingssnelheden van muizen en mensen, ligt de ZDW-dosering in dierstudies dicht bij de traditionele toepassing van ZDW bij mensen. Deze bevindingen vormen de basis voor toekomstig onderzoek bij mensen.
Caspase-afhankelijke apoptotische signalering speelt een sleutelrol bijgentamicine-geïnduceerdapoptose. In de mitochondriale route is caspase-3 een beul-caspase die tot actief kan worden gesplitst door caspase-9 dat wordt geactiveerd vanuit procaspase-9 door cytosolisch cytochroom c (Padanilam, 2003; Jiang en Wang , 2004). De mitochondriale afgifte van cytochroom c wordt gereguleerd door de Bcl-2-familie-eiwitten die binden aan het mitochondriale buitenmembraan en cytochroom c-efflux blokkeren (Yang et al., 1997). In onze studie,
gentamicineverhoogde caspase-3-splitsing en verminderde de Bcl-2-expressie in NRK-52E-cellen. Deze door mitochondriën gemedieerde apoptotische verschijnselen werden omgekeerd door ZDW-behandeling. Op basis van de bevindingen van deze studie hebben we gesuggereerd dat ZDW beschermtrenale tubulaire cellenvangentamicine-geïnduceerde apoptotische schade door remming van de mitochondriale route.
5. Conclusies
Samengevat bevorderde ZDW bij adequate doses celproliferatie en remde hetgentamicine-geïnduceerdapoptosein ratrenale tubulaire cellen. ZDW vermindert ookgentamicine-geïnduceerde niertoxiciteit in vivo. ZDW zou therapeutisch potentieel kunnen hebben voor patiënten metgentamicine-geïnduceerdnierblessure.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gesponsord door het Bureau of Health Promotion, Department of Health, ROC (DOH98-HP-1106).
