Hoe uit te drukken in menselijke nieren en urinewegen door humaan defensine

Voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstract

Achtergrond:De mechanismen die de steriliteit in de urinewegen handhaven, zijn onvolledig begrepen. Recente studies hebben het belang van antimicrobiële peptiden (AMP) bij de bescherming van de urinewegen tegen infectie aangetoond. Hier karakteriseren we de expressie en relevantie van het AMP humaan alfa-defensine 5 (HD5) in de mensnieren urinewegen bij normale en geïnfecteerde personen.

Methodologie/Belangrijkste bevindingen:Met behulp van RNA geïsoleerd uit de mensnier, ureter en blaasweefsel, voerden we kwantitatieve realtime PCR uit om aan te tonen dat DEFA5, het gen dat voor HD5 codeert, constitutief tot expressie wordt gebracht in de urinewegen. Met pyelonefritis nam de DEFA5-expressie significant toe in denier. Met behulp van immunoblot-analyse nam de HD5-productie ook toe met pyelonefritis. Immunokleuring gelokaliseerde HD5 in het urotheel van de blaas en urineleider. In de nier werd HD5 voornamelijk geproduceerd in het distale nefron en de verzamelbuisjes. Met behulp van immunoblot- en ELISA-assays werd HD5 niet routinematig gedetecteerd in niet-geïnfecteerde menselijke urinemonsters, terwijl de HD5-productie in de urine toenam bij E.coli-urineweginfectie.

Conclusies/Betekenis:DEFA5 komt tot expressie in de urinewegen bij niet-geïnfecteerde personen. In het bijzonder wordt HD5 tot expressie gebracht in het urotheel van de lagere urinewegen en in de verzamelbuisjes van denier. Bij infectie neemt HD5-expressie toe in denieren niveaus worden detecteerbaar in de urine. Voor zover wij weten, vertegenwoordigen onze bevindingen de eerste die HD5-expressie en -productie in de menselijke nier kwantificeren. Bovendien is dit het eerste rapport dat de aanwezigheid van HD5 in geïnfecteerde urinemonsters detecteert. Onze resultaten suggereren dat HD5 een belangrijke rol kan spelen bij het handhaven van de steriliteit van de urinewegen.

Cistanche UK voor nierziekte, klik hier om het monster te krijgen

Invoering

De urinewegen, afgezien van de urethrale gehoorgang, zijn meestal steriel ondanks de nabijheid van de fecale flora. De precieze mechanismen waarmee de urinewegen hun steriliteit behouden, zijn niet goed begrepen. Voorgestelde mechanismen die bijdragen aan de verdediging van de urinewegen omvatten urinestroom, veranderingen in de pH en osmolariteit van de urine, regelmatige blaaslediging, chemische afweercomponenten van het uroepitheel en epitheliale uitscheiding/instroom van effector-immuuncellen met bacteriële stimulatie [1]. Bovendien is recentelijk aangetoond dat antimicrobiële peptiden (AMP's) een belangrijke rol spelen bij het handhaven van de steriliteit van de urinewegen [2]. AMP's, die dienen als natuurlijke antibiotica die door bijna alle organismen worden geproduceerd, zijn een alomtegenwoordige component van het aangeboren immuunsysteem. AMP's zijn kationische moleculen die tot expressie worden gebracht door fagocytische witte cellen en epitheelcellen. Bij mensen en andere zoogdieren vormen defensines een belangrijke familie van AMP's. Defensines hebben doorgaans een breedspectrum antimicrobiële activiteit tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën, virussen, schimmels en protozoa [2,3]. Defensinen worden aanvankelijk gesynthetiseerd als preproproteïnen en ondergaan verwerking om rijpe, biologisch actieve peptiden te worden [4]. Bij mensen worden defensines ingedeeld in een van de twee families, afhankelijk van hun disulfide-overbruggingspatroon - de alfa-defensines of de bèta-defensines [5].

In de urinewegen komen bèta-defensines op grote schaal tot expressie in het uroepithelium. Epitheelcellen die de bekledennierlus van Henle, distale tubulus en verzamelbuis brengen constitutief humaan bèta-defensine 1 (hBD1) tot expressie. Hoewel de niveaus van hBD1 in de urine onvoldoende zijn om binnendringende bacteriën te doden, biedt hBD1 een snelwerkende antimicrobiële coating van buisvormige lumina en voorkomt het infectie door de bacteriële hechting aan het urotheel te remmen [6]. Recente studies geven aan dat de redox-toestand van hBD1 de antimicrobiële potentie significant beïnvloedt, zodat het gereduceerde peptide veel krachtiger is dan de disulfide-gekoppelde geoxideerde vorm [7]. De betekenis hiervan aan het urotheeloppervlak is niet vastgesteld. Een ander defensine, humaan bèta-defensine 2 (hBD2) wordt niet constitutief tot expressie gebracht in gezond nierweefsel; hBD2-expressie wordt echter geïnduceerd door infectie [8].

In tegenstelling tot de bèta-defensines is de rol van van epitheel afgeleide alfa-defensines niet goed beschreven in de urinewegen. De expressie en functie van alfa-defensines HD5 en HD6 zijn meestal gerapporteerd in de dunne darm, waar ze door Panethcellen worden uitgescheiden in de darmcrypten en bijdragen aan het evenwicht van de darmmicrobiota [9]. HD5 is ook gelokaliseerd in de mannelijke en vrouwelijke geslachtsorganen, met bewijs dat suggereert dat het induceerbaar is en belangrijk bij het uitroeien van infecties [10,11,12]. Urine-HD5 is gedetecteerd bij patiënten die ileale neoblaasreconstructie en ileale leiding-urine-omleiding hebben ondergaan, waarbij de bron van HD5-productie voornamelijk werd toegeschreven aan de ileale Paneth-cellen [13,14]. HD5 heeft antibacteriële activiteit tegen veelvoorkomende uropathogene grampositieve bacteriën en gramnegatieve bacteriën [15]. HD5 heeft ook antimicrobiële activiteit tegen uropathogene virussen zoals adenovirus en BK-virus [16,17,18]. In deze studie bieden we de eerste beschrijving en kwantificering van HD5-expressie in de mensnieren de expressie ervan in de lagere urinewegen tijdens steriliteit en infectie verder definiëren.

Resultaten

DEFA5-mRNA wordt constitutief tot expressie gebracht in de menselijke blaas, urineleider en nier

Kwantitatieve real-time PCR toont aan dat alle geteste blaas-, ureter- en niermonsters zonder infectie constitutief DEFA5 tot expressie brachten. DEFA5-expressie was significant groter in de lagere urinewegen dan in de hogere urinewegen (p= 0.014). In de blaas (n=4) was de gemiddelde DEFA5-expressie 4.656637 transcripten per 10 ng RNA en in de urineleider (n=4) was de gemiddelde DEFA5-expressie 41126170 transcripten per 10 ncRNA (Figuur 1A) . In de nier (n=6) was de gemiddelde DEFA5-expressie 2.9376274 transcripten per 10 ng RNA. DEFA5-expressie werd afzonderlijk geanalyseerd in de niercortex, medulla en bekken. DEFA5-expressie varieerde niet significant per niergebied (p= 0.45).

DEFA5-expressie en HD5-peptide-expressie nemen toe met pyelonefritis

Kwantitatieve real-time PCR-analyse uitgevoerd op nierweefsels met pyelonefritis toonde een significante toename in DEFA5-expressie in vergelijking met niet-geïnfecteerde nierweefsels. Met pyelonefritis (n= 6) nam de gemiddelde DEFA5-expressie toe tot 7.82961.052 transcripten per 10 ng RNA (p= 0.019) (Figuur 2A).

Om deze toename in expressie met pyelonefritis verder te evalueren, voerden we immunoblot-analyse uit op hetzelfde nierweefsel dat werd gebruikt voor realtime PCR-analyse om te evalueren op gelijktijdige toenames in HD5-peptideproductie (Figuur 2B, middelste paneel). Immunoblot-analyse, waarbij gebruik werd gemaakt van polyklonale HD5-antisera, toonde een significant hogere productie van HD5-peptiden aan in nierweefsels met pyelonefritis (n=6) in vergelijking met niet-geïnfecteerde nierweefsels (n=6). Niet-geïnfecteerde nierweefsels brachten 300625 ng HD5/gram nat weefselgewicht tot expressie, terwijl nierweefsel met pyelonefritis 600621 ng HD5/gram nat weefselgewicht tot expressie bracht (p.0.0001). Blots werden opnieuw gesondeerd met GAPDH om te dienen als laadcontrole (Figuur 2B, middelste paneel) en een zilvervlek werd ook uitgevoerd om gelijke eiwitbelading te bevestigen (Figuur 2B, bovenste paneel).

HD5-peptide wordt geproduceerd in de menselijke nieren en urinewegen

Immunokleuring werd uitgevoerd om de HD5-productie in de urinewegen te lokaliseren. Immunohistochemie (IHC) toonde aan dat HD5-immunoreactiviteit aanwezig was in het urotheel van de urineleider en blaas van alle onderzochte monsters (n=4, figuur 3). IHC toonde ook aan dat HD5 werd geproduceerd in tubuli van de niercortex en medulla van alle exemplaren (n= 6, figuur 4). Immunofluorescentie (IF) toonde aan dat HD5-expressie het grootst was in het distale nefron en de verzamelbuisjes (Figuur 5). Het interstitium en de glomeruli vertoonden geen HD5-immunoreactiviteit. De immunokleuring getoond in Figuren 3, 4 en 5 werd uitgevoerd met behulp van een monoklonaal anti-HD5-antilichaam (8C8) van de muis dat het HD5-propeptide herkent (Abcam, Cambridge, MA). De resultaten waren vergelijkbaar bij gebruik van polyklonaal anti-HD5-antilichaam van konijn dat het HD5-propeptide en rijpe peptide herkent (gegevens niet getoond) - wat suggereert dat HD5 wordt opgeslagen als een propeptide.

Met pyelonefritis nam de HD5-immunokleuring aanzienlijk toe. De HD5-immunoreactiviteit nam toe in het proximale nefron, het distale nefron en de verzamelbuisjes (Figuur 4 en Figuur 5). Net als bij niet-geïnfecteerde monsters vertoonden de glomeruli en het interstitium geen HD5-expressie bij infectie. Negatieve controles vertoonden geen HD5-immunoreactiviteit.

Geïnfecteerde menselijke urine bevat meetbare

concentraties van HD5-peptide

Immunoblot-analyse, met behulp van polyklonaal konijnenantiserum dat de voorloper proHD5 detecteert en verder verwerkte vormen identificeerde meetbare niveaus van HD5 in 13 van de 15 geteste urinemonsters die waren geïnfecteerd met uropathogene E.coli (Figuur 6A en B). Indien aanwezig, varieerden HD5-spiegels, genormaliseerd naar urinecreatinine, van 299,8–669.7630 ng HD5/mg urine Cr (110,67 ng/ml–276,67 ng/ml), wat overeenkomt met 11,10–27,67 nmol/L. Geïnfecteerde urinemonsters (n=15), HD5 was op of onder de detectielimiet van (,50 ng). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) op dezelfde urinemonsters, met behulp van het monoklonale antilichaam van de muis (8C8) dat alleen de voorloper proHD5 detecteert, detecteerde meetbare niveaus van proHD5 in 13 van de 15 geïnfecteerde geteste monsters. Urine-proHD5-concentraties varieerden van 122,78–490.060,03 ng HD5/mg urine Cr (30,02 ng/ml–200,5 ng/ml), indien aanwezig (Figuur 7).

Discussie

In deze studie bieden we de eerste karakterisering van HD5 in de menselijke nier, urineleider en blaas. Van HD5 is aangetoond dat het een belangrijke AMP is die invasieve infectie in de darm voorkomt en tijdens infectie in het genitaal kanaal wordt gereguleerd [11,18,19,20,21]. Van epitheliale afgeleide AMP's, zoals HD5, is aangetoond dat ze belangrijk zijn bij het handhaven van de steriliteit in de urinewegen [8,22,23,24]. Deficiënties in deze aangeboren mucosale afweer kunnen leiden tot acute en/of chronische infectie [25,26].

Onze kwantitatieve realtime PCR-resultaten tonen aan dat DEFA5 constitutief tot expressie wordt gebracht in de menselijke nieren, urineleiders en blaas. DEFA5-expressie neemt toe van de bovenste urinewegen naar de lagere urinewegen - als gevolg van de stroom van de urinestroom en de toenemende nabijheid van het invasiepunt van de microbiota. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die de expressie van DEFA5 in de menselijke nier en blaas kwantificeert. Onlangs hebben Townes et al aangetoond dat een normale distale ureter DEFA5 tot expressie kan brengen [14]. Onze resultaten suggereren ook dat DEFA5 constitutief tot expressie wordt gebracht door de distale ureter. Hoewel de expressie van DEFA5 in de urinewegen bijna 100- keer lager is dan die gevonden in gastro-intestinale weefsels, is de basale uroepitheliale expressie van DEFA5 vergelijkbaar met de expressie van eerder beschreven urinespoorversterkers zoals cathelicidine, hBD-1, hBD -2 en ribonuclease 7[6,8,22,24,27]. PCR-gegevens tonen aan dat DEFA5-expressie in de nier significant omhoog wordt gereguleerd met infectie [27,28,29]. Dit induceerbare patroon van expressie is analoog aan DEFA5-expressie in het vrouwelijke voortplantingsstelsel waar DEFA5-expressie toeneemt met salpingitis [30]. In de urinewegen hebben Townes et al. een trend laten zien in de richting van een grotere ureterale expressie van DEFA5 bij patiënten met UTI's die urinewegomleiding van het ileale kanaal hebben ondergaan [14].

Onze immunoblot-analyse vormt een aanvulling op de realtime PCR-gegevens door aan te tonen dat de productie van HD5-peptiden toeneemt met pyelonefritis. Dit induceerbare patroon van HD5-productie is vergelijkbaar met dat van sommige leden van de bèta-defensine-familie. hBD2 vertoont een induceerbaar patroon van productie met infectie van de urinewegen en/of chronische pyelonefritis [8,31,32]. Het is aangetoond dat de productie van HD5-peptide toeneemt in het bovenste vrouwelijke geslachtsorgaan en de mannelijke urethra met ontsteking [11,30].

Met behulp van immunokleuring laten we zien dat HD5 uniform wordt geproduceerd door het urotheel van de urineleider en de blaas. Omdat de overgrote meerderheid van UTI's het gevolg zijn van fecale flora die opstijgt in de blaas, suggereren deze resultaten dat HD5-expressie aanwezig is op locaties waar microbiële blootstelling het vaakst voorkomt [33]. Daarom is HD5 ideaal gepositioneerd om oplopende microbiële infectie te voorkomen. In de nier wordt HD5 voornamelijk geproduceerd in het distale nefron en de verzamelbuis. Deze bevindingen suggereren dat HD5 wordt geproduceerd op locaties waar het zal worden gepositioneerd om optimale antimicrobiële activiteit te hebben. Eerdere studies hebben aangetoond dat de antimicrobiële eigenschappen van defensines afhankelijk zijn van de zoutconcentratie - waarbij hogere zoutconcentraties de antimicrobiële activiteit verminderen [23,34,35]. We speculeren dat de lage zoutconcentraties van het distale nefron en de verzamelbuisjes een gunstig milieu bieden voor antimicrobiële activiteit van HD5.

Immunoblot- en ELISA-analyse tonen ook aan dat HD5 op lage niveaus in de urine wordt uitgescheiden. Gezien de grootte (8,1 kDa en 3,7 kDa) en de positieve lading van proHD5 en volledig verwerkt HD5, is het mogelijk dat een bepaald urinair HD5-peptide, althans gedeeltelijk, afkomstig is van plasmafiltraat. Toch is er weinig bewijs dat suggereert dat HD5 aanhoudt in het plasma [27]. Om in de urine te verschijnen, zou HD5 bovendien moeten ontsnappen aan de efficiënte peptide-absorptiemechanismen in de proximale tubulus [6,36]. Ten slotte ondergingen de gebruikte urinemonsters centrifugatie voordat de tests werden uitgevoerd, waarbij cellulaire bronnen van HD5 werden verwijderd. Bij de gedetecteerde concentraties is het onwaarschijnlijk dat urinair HD5 direct antimicrobieel is tegen uropathogene micro-organismen, aangezien volledig verwerkt HD5 een minimale remmende concentratie (MIC) tussen 6-10 mg/ml heeft tegen veelvoorkomende gramnegatieve uropathogene bacteriën [15]. De mucosale oppervlakteconcentraties zijn echter waarschijnlijk hoger. Verder toont immunoblot-analyse aan dat HD5-concentraties significant hoger zijn in de nier. Deze resultaten suggereren dat HD5 betrokken is bij de mucosale verdediging van de urinewegen. Een analoog patroon wordt gezien met hBD1, waar de urinaire concentraties van hBD1 onvoldoende zijn om antimicrobiële activiteit te vertonen, maar hogere peptideconcentraties worden gedetecteerd in de buurt van de niertubuli [6,31].

Omdat IHC aantoont dat proHD5 een belangrijke vorm van HD5 in de nier is en omdat zowel volwassen als proHD5 in de urine worden gedetecteerd, speculeren we dat HD5 voornamelijk wordt uitgescheiden als een voorlopermolecuul en vervolgens proteolytische verwerking ondergaat om volwassen vormen te genereren - vergelijkbaar met de gastro-intestinale en urogenitale kanalen [11,30,37]. In de dunne darm produceren Paneth-cellen trypsine, dat het HD5-propeptide splitst zodat het volledig verwerkte peptide de overheersende vorm in het darmlumen is [37]. In de mannelijke urethra zijn de belangrijkste verwerkings- en activerende enzymen voor HD5 neutrofiele proteasen die worden bijgedragen door

neutrofielen gerekruteerd naar de plaats van infectie [11]. De bijdragen van epitheliaal trypsinogeen, urinair trypsine en/of neutrofiele proteasen op HD5-verwerking in de urinewegen tijdens infectie moeten nog worden bepaald. Bovendien moeten de effecten van veranderingen in de urineomgeving op de HD5-functie (veranderingen in osmolariteit, pH en kationische concentraties) ook nog worden bepaald.

Concluderend, dit is de eerste studie om de expressie en productie van HD5 in de urinewegen te identificeren en te kwantificeren. Onze resultaten suggereren dat HD5 een van epitheel afkomstig AMP is dat een belangrijke rol kan spelen in de aangeboren immuniteit van het menselijke uroepitheel, waardoor de translocatie van binnendringende pathogenen in de bloedsomloop wordt voorkomen. Opheldering van de factoren die de HD5-productie reguleren, kan nieuw inzicht verschaffen in de pathogenese van UTI's bij patiënten met een risico op UTI's en patiënten met chronische infecties.

Methoden:

Studie goedkeuring

Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten die aan deze studie deelnamen. Voor proefpersonen jonger dan 18 jaar werd schriftelijke toestemming van de ouders/voogd verkregen. De NationwideChildren's Hospital (NCH) Institutional Review Board keurde deze studie goed samen met het toestemmingsproces en de documenten (IRB07-00383).

Monsters van menselijk weefsel en urine

Niet-geïnfecteerd distaal ureter- en blaasweefsel (n= 4) werd verkregen van kinderen die ureterale re-implantatie ondergingen om andere redenen dan terugkerende infectie. Niet-geïnfecteerde niermonsters (n=6) werden verkregen van patiënten die een nefrectomie ondergingen voor niertumoren. Weefselmonsters waren vrij van macroscopische tekenen van ziekte of ontsteking. Nierweefsel van patiënten met chronische pyelonefritis werd geleverd door het Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Twee onafhankelijke pathologen bevestigden de histopathologische diagnose van pyelonefritis. Weefselmonsters werden snel ingevroren of bewaard als neutrale, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde secties. Secties van niet-geïnfecteerd nierweefsel werden vóór opslag in de cortex, medulla of nierbekken ontleed (n=4).

Niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde urinemonsters werden verkregen van kinderen die zich presenteerden op de afdeling spoedeisende hulp van het NCH of de nefrologiekliniek. De diagnose UWI werd gesteld door een positieve urinekweek volgens de American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Alle geïnfecteerde urinemonsters hadden 106 CFU/ml E.coli. Urine-pH-waarden varieerden van 5,5 tot 8,5 (gemiddelde urine 6,9). De ionische samenstelling van de urine werd niet gemeten. Urinemonsters werden gecentrifugeerd om urinesediment te verwijderen en er werd een proteaseremmercocktail toegevoegd (Thermo Scientific, Rockford, IL, VS).