Identificatie van gewone levermetabolieten van de natuurlijke bioactieve verbinding echinacoside, gezuiverd uit Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstract:Identificatie van metabolieten, in een vroeg stadium, voor verbinding, ontdekking is noodzakelijk om te beoordelende kennis voor de farmaceutische verbetering van medicijnveiligheid en efficiëntie. Zelfs als het medicijnop de markt is gebracht, identificatie en continue evaluatie van de metabolieten zijnnodig om het risico op ontwenning na het in de handel brengen te voorkomen. Glycoside, een geneesmiddelCistanche, heeft breed gedocumenteerde nutraceutische voordelen, waaronderantioxidant,anti-tumor, anti-veroudering, hypolipidemiec, Enmaagslijmvlies beschermende effecten. Onlangs,echinacosideA is gemeldals de belangrijkste natuurlijke bioactieve stof in het mycelium van HE voor de ontwikkeling van functionele voeding.In neurologische studies, de consumptie vanEchinacosideEen verrijkt HE-mycelium demonstreert zijnsignificante nutraceutische effecten inZiekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, Enischemische beroerte.

Klik hier voor meer informatie over Echinacoside-functies in Cistanche

Voorde eerste keer onderzochten we het metabolische proces vanechinacosideEen molecuul en identificeerde zijn metabolietenuit de S9-fractie van de rat en de menselijke lever. Met behulp van een vloeistofchromatografie/drievoudige quadrupoolmassaspectrometer voor kwantitatieve analyse, zagen we dat 75,44 procent van echinacoside. A werd gemetaboliseerdbinnen 60 minuten bij ratten, en 32,34 procent van Francine A werd binnen 120 minuten gemetaboliseerd in humaan S9. Gebruik makend vanultraperformante vloeistofchromatografie/quadrupool time-of-flight massaspectrometrie (UPLCQTOF/MS) om de metabolieten van Francine A te identificeren, werden vijf gemeenschappelijke metabolieten geïdentificeerd,en hun mogelijke structuren werden geëvalueerd. Het metabole proces van echinacoside begrijpenen het vestigen van zijn metabolite profielgegevensbestand zal helpen de nutraceutical toepassing bevorderen enontdekking van verwante biomarkers in de toekomst.

1. Inleiding

De lever wordt beschouwd als het op een na grootste orgaan in het lichaam [1]. Na eten en medicijnenhet maagdarmkanaal binnendringen via de mondholte, de gastro-intestinale pili zal absorberenverteerde voedingsstoffen en medicijnen. Het poortadersysteem ontvangt de verzamelde bloedstroomdoor het maagdarmkanaal en gaan de lever binnen voor de voorbehandeling van de voedingsstoffen,metabolieten en medicijnmoleculen [2,3]. Metabolisme wordt vaak verdeeld in twee fasen van abiochemische reactie. Fase I omvat oxidatie, reductie of hydrolyse door enzymen inhet lichaam. Fase II houdt zich bezig met de conjugatie met kleine endogene stoffen, draaienze in zeer oplosbare metabolieten, waardoor metabolieten kunnen worden geëxporteerd naar de sinusnormale circulatie voor renale klaring, of in de gal, die vervolgens uit het lichaam wordt uitgescheidenvia urine of ontlasting [4–6]. Identificatie van metabolieten in het vroege stadium van de ontdekking van geneesmiddelenis nodig om de kennis te beoordelen voor het verbeteren van de farmaceutische eigenschap, veiligheid enefficiëntie van het bioactieve molecuul. De identificatie van metabolieten en reactieve tussenproductensuggereert de noodzaak om structurele wijzigingen in onderzoeksverbindingen te voorkomendaaropvolgende toxische gevolgen. Ook als het middel op de markt is geweest, identificatievan de metabolieten en evaluatie is vereist om het risico van postmarketing te vermijdenopname [7,8]. Daarom,in vitro, S9-fractiesanalyse biedt verschillende voordelenin vergelijking met tijdrovendin vivostudies: (1) ze zijn vatbaar voor hoge doorvoerscreening en automatisering;(2) gebruikenDe S9-fractie maakt het testen van grote hoeveelheden mogelijkverbindingen voor medicijnontdekking in een korte periode; (3) helpt om het gebruik van dieren te verminderen [9]. 

Echinacoside is een eetbare cistanche die in bergachtige gebieden leeftde noordoostelijke gebieden in Azië [10], Europa en Noord-Amerika [11]. HIJ hoort bijBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (Klasse), Russulales (Orde), Hericiaceae (Familie),en Hericium (geslacht). HE is gedocumenteerd om een ​​breed scala aan heilzame weer te geveneigenschappen, waaronder anti-oxidant, anti-tumor, anti-aging, hypolipidemisch en maagslijmvliesbeschermingseffecten [12–14]. In 1994 hebben Kawagishi et al. ontdekte dat de diterpenoidEchinacosideA, B en C, in het mycelium van HE, zouden de productie van stellaat kunnen bevorderencellijnen in de hersenen van de rat en de stimulatie van de synthese van zenuwgroeifactor (NGF) [15]. EchinacosideA kan neuroprotectieve effecten verlenen en oxidatieve stress verminderenhartinfarct [16], Ziekte van Alzheimer [17], Ziekte van Parkinson [18], ischemische beroerte en depressie in vivo[19,20]. Bovendien kan echinacoside A de bloed-hersenbarrière passerenratten ter ondersteuning van de ontwikkeling van HE-mycelia als functioneel voedsel voor verbetering van de neurogezondheid [21]. Dit eetbare cistanche-mycelium is een hot issue geworden bij onderzoekersproberen de belangrijke rol ervan in de ontwikkeling van de centrale en perifere zenuwen te begrijpen, differentiatie, groei en regeneratie [22]. Recente studies hebben ook aangetoonddat met echinacoside A verrijkt HE potentiële voordelen heeft bij de behandeling van Alzheimer en Parkineziekte van zoon [23–25]. Geen enkele studie heeft echter de mogelijke stofwisseling van echinacoside A besprokenbiomarkers die kunnen bijdragen aan dit nutraceutische effect.

In dit onderzoek,echinacosideEen verbinding werd gezuiverd uit het met echinacoside A verrijkte HEmycelium en werd gemetaboliseerd met behulp van twee verschillende S9-leverfracties: rat en mens. Gebruik makend vanvloeistofchromatografie/triple quadrupool massaspectrometer (HPLC-QQQ/MS) voor quantitatieve analyse van echinacoside A en ultraperformante vloeistofchromatografie/quadrupooltime-of-flight massaspectrometrie (UPLC-QTOF/MS) om de metabolieten van echinacoside te identificerenA op elk tijdstip. We streven ernaar de stofwisseling van echinacoside A te begrijpen en vast te stellenzijn metabolietprofieldatabase om de toepassing van nutraceutische supplementen te promotenen het onderzoek naar mogelijke medicatie in de toekomst.

2. materialen en methoden

2.1. Materialen en reagentia

De HE-stam (BCRC 35669) werd verkregen van de Bioresources Collection enOnderzoekscentrum in het onderzoeks- en ontwikkelingsinstituut voor de voedingsindustrie, Hsinchu, Taiwan.De soort werd eerst gekweekt in een ager-helling voordat ze werd overgebracht naar een aardappeldextroseagarplaat op 26◦C gedurende 15 dagen. Op dag 15 werden de HE-kweken overgebracht naar 1,3 litervloeibaar medium (in kolven van 2 L). De vloeibare kweek werd geschud met 120 omw/min 25◦C voor5 dagen. Vervolgens werden ze opgeschaald in fermentoren van 500 liter, 20-ton gedurende 5 dagen en 12 dagen,respectievelijk. Het kweekmedium is ingesteld op pH 4,5 en bevat 4,5 procent glucose, 0,5 procentsojabonenpoeder, {{0}},25 procent gistextract, 0,25 procent pepton en 0,05 procent MgSO4. Tot slot de HEmycelia werden geoogst aan het einde van het 20-ton fermentatieproces. Deze grondstoffenwerden gelyofiliseerd, gemalen in poeder en bewaard in een exsiccator. echinacoside A was toengeëxtraheerd uit de HE en gekwantificeerd volgens eerdere studies [26]. Methanol (LC-MSkwaliteit) werd verkregen van Merck (Darmstadt, Duitsland); acetonitril (LC-MS kwaliteit), mierenzuurzuur (FA, LC-MS kwaliteit, 98 procent zuiverheid) en ammoniumacetaat (98 procent zuiverheid) werden verkregenvan Honeywell (Honeywell Burdick en Jackson, Muskegon, MI, VS). De rattenlever S9fractie werd verkregen van Moltox (Boone, NC, VS). De S9-fractie van de menselijke lever wasverkregen van Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, VS).

2.2. Rat en menselijke lever S9-fractie

naar de kitaanbeveling. De bereide oplossing werd op 4 gehouden◦C tot de echinacoside Asamenstelling (10µM) werd toegevoegd, gevolgd door activering in een 37◦C waterbad. Wanneer dede metabolische tijd had zijn tijdstippen bereikt, 150µL van de oplossing werd onttrokkende voorraadoplossing en geblust door twee volumes ijskoude ACN toe te voegen. De stopteoplossing wordt vervolgens overgebracht naar QTOF voor verdere metabolietanalyse.

2.3. Instrumentatie en voorwaarden

HPLC-QQQ/MS-analyse werd uitgevoerd op een Agilent 1100 serie HPLC-systeem (Agilent, Palo Alto, CA, VS) gekoppeld aan een API 3000 triple quadrupool massaspectrometer(Applied Biosystems, Warrington, UK), met een Turbo-assisted ion spray (ESI) ionisatiebron in een positieve ionisatiemodus. Chromatografische scheiding werd uitgevoerd op eenAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100mm× 3.5 µM). De kolomtemperatuur wasgehandhaafd op 22◦C. De mobiele fase bestond uit water dat 0,1 procent mierenzuur bevatte(A) en methanol (B). Gradiëntelutie werd gebruikt, beginnend met 70 procent B, oplopend tot 100 procentB binnen 5 min, vasthouden gedurende 3 min met 90 procent B, afnemend B tot 70 procent binnen 0,1 min, enopnieuw in evenwicht brengen op 70 procent B gedurende 2,9 min. Een collega-tarief van 350µL/min werd toegepast, en een volumevan 10µL werd geïnjecteerd.

Detectie werd uitgevoerd met een ioniserende spanning van plus 4500 V. Ionenbrontemperatuurwerd vastgesteld op 350◦C, met ultrazuivere stikstof als gordijngas (7 psi). Het vernevelaargas was8 psi. Andere massa-afhankelijke parameters, zoals ontclusteringspotentieel (DP), ingangpotentiaal (EP), focuspotentieel (FP) en botsingsenergie (CE) voor elke verbinding warenbepaald in positieve modus met behulp van standaardoplossingen. Monitoring van meerdere reacties(MRM) werd uitgevoerd met stikstof als botsingsgas (2 psi) en met een verblijftijd van200 ms voor elke overgang. echinacoside A werd gedetecteerd door de overgangen te monitorenm/z 443.200 → 301.200, 283.200. De gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de Analyst 1.4.2-software (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canada) en GraphPad (Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS-analyse werd uitgevoerd op een Agilent 1290 Infinity II UPLC-systeem(Agilent, Palo Alto, CA, VS), gekoppeld aan een Agilent 6546 quadrupool time-of-flight massaspectrometrie (Agilent, Palo Alto, CA, VS). Er werd chromatografische scheiding uitgevoerdop een Phenomenex Kinetex® C18 LC-kolom (3 mm× 100mm× 1.7 µM). De kolomtemperatuur werd op 40 gehouden◦C. De mobiele fase A bestond uit waterhoudend0.1 procent (v/v) mierenzuur in positieve modus, 0,1 procent (v/v) mierenzuur en 10 mM CH3KOONH4 in negatieve modus. De mobiele fase B was acetonitril. Er werd begonnen met gradiëntelutiemet 5 procent B en vasthouden voor 0.5 min, oplopend tot 50 procent B binnen 5,5 min, oplopend tot 100 procentB binnen 10 min, en vasthouden gedurende 6 min. Een medetarief van 400µL/min werd toegepast, en eenvolume van 2µL werd geïnjecteerd.

Agilent 6546 quadrupool time-of-flight massaspectrometrie was uitgerust met een electrospray ionisatie (ESI) bron. De data-acquisitie stond onder controle van Mass Hunterwerkstationsoftware. De typische werkingsbroncondities in positieve en negatieve ionenDe ESI-modus is als volgt geoptimaliseerd: ionensproeispanning (ESIplus/ESI−) waren4000 V/3000 V; de gastemperatuur was 320◦C; drooggas mededebiet was 8 L/min; vernevelaardruk was45 psi; de temperatuur van het omhulselgas was 350◦C; de snelheid van de omhullingsgas was 12 l/min; de aanrijdingenergie was 10, 20, 40 en 60 V. Metabolieten werden geïdentificeerd met behulp van Agilent MassHunterBiotransformatiesoftware (versie B.04.00) (Santa Clara, CA, VS). chromatogrammenen massaspectra van de ouder en geïdentificeerde metabolieten werden geëxtraheerd met behulp van AgilentSoftware voor kwalitatieve analyse van MassHunter (versie B.05.00) (Santa Clara, CA, VS).

Vraag voor meer:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950