Immuniteit als hoeksteen van niet-alcoholische leververvetting: de bijdrage van oxidatieve stress aan het ziekteverloop Deel 1

Abstract:

Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) wordt beschouwd als de hepatische manifestatie van het metabool syndroom en is de belangrijkste oorzaak van chronische leverziekte geworden, vooral in westerse landen. NAFLD omvat een breed spectrum van hepatische histologische veranderingen, van eenvoudige steatose tot steatohepatitis en cirrose met de mogelijke ontwikkeling van hepatocellulair carcinoom. Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) wordt gekenmerkt door lobulaire ontsteking en fibrose. Verschillende onderzoeken meldden dat insulineresistentie, redox-onbalans, ontsteking en ontregeling van het lipidenmetabolisme betrokken zijn bij de progressie van NAFLD. De mechanismen voorbij de evolutie van eenvoudige steatose naar NASH zijn echter nog niet duidelijk begrepen. Recente bevindingen suggereren dat verschillende geoxideerde producten, zoals lipiden, cholesterol, aldehyden en andere macromoleculen, het begin van de ontsteking kunnen veroorzaken.

Aan de andere kant wijst nieuw bewijs op aangeboren en adaptieve immuniteitsactivering als de drijvende kracht achter het ontstaan ​​van leverontsteking en fibrose. In deze review bespreken we hoe immuniteit, veroorzaakt door oxidatieve producten en op zijn beurt oxidatieve stress bevordert in een vicieuze cirkel, de NAFLD-progressie voedt. Verder onderzochten we het toenemende belang van het metabolisme van immuuncellen bij het bepalen van ontstekingen, en beschreven we de mogelijke toepassing van getrainde immuunontdekkingen in de pathologische context van NASH.

Klik op kopen afstanden voordelen product

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Inleiding

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is defined as the pathological hepatocyte fat accumulation in >5 procent van het leverweefsel, bij afwezigheid van virale hepatopathie, alcoholgebruik, medicijngebruik en andere secundaire oorzaken [1]. Er bestaat een breed spectrum aan aandoeningen, variërend van de "eenvoudige" vetophoping van hepatocyten tot een meer complex histologisch beeld dat wordt gekenmerkt door cytolytische schade, lobulaire ontsteking en fibrose [2], namelijk niet-alcoholische steatohepatitis (NASH). Het kan gecompliceerd worden door de ontwikkeling van cirrose en/of hepatocellulair carcinoom (HCC), wat in hoge mate de verslechtering van de prognose bepaalt [1,2]. Daarom is NAFLD, vanwege de hoge incidentie in westerse landen en de ingewikkelde klinische behandeling, een van de belangrijkste zorglasten van de 21e eeuw geworden [1,2].

NAFLD is bestudeerd als de hepatische complicatie van het metabool syndroom (MS) en als een onafhankelijke risicofactor voor de ontwikkeling van hart- en vaatziekten [1,3,4]. De belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling en progressie van NAFLD vertegenwoordigden de pathologische achtergrond die MS definieert, wat een verdere toename van het cardiovasculaire risico in een vicieuze cirkel bepaalt [4-6]. Daarom, in een scenario waarin de prevalentie van MS toeneemt [7] en virale hepatitis efficiënt worden gecontrasteerd, is NAFLD de eerste oorzaak van levertransplantatie in westerse landen geworden [1,7,8]. Tegenwoordig vormt het de wereldwijd overheersende hepatopathie met een prevalentie van 6-35 procent wereldwijd (25-26 procent in Europa), met grote variaties als gevolg van etniciteit [8,9].

Vanuit pathogenetisch oogpunt wordt NAFLD beschouwd als het resultaat van een multifactoriële interactie tussen genetische achtergrond (waaronder genomische instabiliteit, single nucleotide polymorphisms (SNP's), microRNA-expressie), omgevingsfactoren en dysmetabolisme, met een prominente rol van insulineresistentie (IR). [10,11] (Figuur 1).

Figuur 1.

De complexiteit van NAFLD-pathogenese als resultaat van multifactoriële ziekte.SNP's: polymorfismen met één nucleotide; miRNA: microRNA-expressie; MS: metabool syndroom; FFA's: vrije vetzuren; ROS: reactieve zuurstofspecies; EDC's: hormoonontregelende stoffen; IL-6: Interleukine-6; TNF-: geruchtennecrosefactor-; TGF- : transformerende groeifactor- ; NAFLD: niet-alcoholische leververvetting; NASH: niet-alcoholische steatohepatitis; HCC: hepatocellulair carcinoom. Verschillende factoren (genetisch, epigenetisch en omgevingsfactoren) zijn betrokken bij het ontstaan ​​en de progressie van NAFLD. Het begin van een insulineresistentie (IR)-status is een kritieke gebeurtenis die zowel bijdraagt ​​aan het begin als aan de verergering van de ziekte. In dit complexe scenario lijken oxidatieve stress, ontsteking, verminderde immuunrespons en intestinale dysbiose allemaal samen te kunnen werken en progressie te bevorderen, wat de kans op het optreden van HCC beïnvloedt.

Dienovereenkomstig suggereerde een recente consensus van deskundigen dat metabole (disfunctie) geassocieerde leververvetting (MAFLD) een geschiktere definitie zou zijn [12]. De belangrijkste factor in NAFLD-pathogenese is geïdentificeerd als de hepatische accumulatie van vrije vetzuren (FFA's) [13]. Mitochondria-activiteit gaat deze FFA-overbelasting tegen, waardoor de permeabiliteit van het binnenmembraan toeneemt met het verlies van zijn biologische functie [14]. Het directe gevolg van deze stoornis is de mitochondriale disfunctie geassocieerd met de reactieve soortproductie, die op zijn beurt verantwoordelijk is voor verschillende gevolgen, zoals mtDNA-mutaties, accumulatie van lipotoxische tussenproducten en pro-inflammatoire cytokineproductie, die IR, immuunrespons en dus ziekte bevorderen. progressie [15]. Bovendien wijst nieuw bewijs op aangeboren en adaptieve immuniteitsactivering als de drijvende krachten achter het ontstaan ​​van leverontsteking en fibrose [16,17] (Figuur 1).

In deze review bespreken we de mechanismen die ten grondslag liggen aan de overspraak tussen oxidatieve stress en immuundisfunctie in NAFLD-evolutie met nieuwe inzichten in de concepten van immuuncelmetabolisme en getrainde immuniteit.

1.1. Overzicht van moleculaire mechanismen van oxidatieve stress in NAFLD

Chronische leverziekten worden gekenmerkt door overmatige productie van reactieve soorten en redox-onbalans [18]. NAFLD is een zeer complexe ziekte waarbij verschillende factoren betrokken zijn, genetische, epigenetische en omgevingsfactoren. Momenteel is de "multiple hit"-pathogenese de geaccepteerde theorie om de ontwikkeling ervan te verklaren, waarbij een mechanistisch overzicht wordt gegeven waarin deze factoren parallel werken [19]. In dit model werkt oxidatieve stress als een hoeksteen in de progressie van NAFLD.

Normaal reactieve soorten mediëren een overvloed aan cellulaire functies zoals apoptose, proliferatie, metabolisme en regulering van de immuunafweer [20,21]. Omgekeerd leidt overmatige productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) tot oxidatieve stress, waardoor de fysiologische redoxsignalering in gevaar komt met de daaruit voortvloeiende cellulaire schade [22,23]. Dit fenomeen wordt zelfs nog relevanter in het geval van krachtige ROS-productie, gegenereerd in een weefseloxidatieve micro-omgeving [24]. Een typisch voorbeeld is de ijzerstapeling die optreedt bij sommige NASH-patiënten, waardoor de Fenton-reactie wordt vergemakkelijkt die het uiterst giftige H O uit H2O2 genereert [14].

De lever beschikt over krachtige scavenging-systemen om de productie van ROS tegen te gaan, vooral afkomstig van mitochondria en cytochroom P450 (CYP) en andere enzymen. Wanneer de ROS-productie echter het wegvangende vermogen overwint, treedt er een redox-onevenwichtigheid op en worden continu superoxide-anionradicalen (O2·−) en waterstofperoxide (H2O2) gevormd als bioproducten van energetisch metabolisme [14,25]. Dit omvat hepatocyten, Kupffer-cellen (KC's), neutrofielen en andere leverceltypen, die ten grondslag liggen aan de overspraak tussen oxidatieve stress en immuniteit bij de progressie van de ziekte.

Bovendien overbelasten FFA's afkomstig van de voeding, afgegeven door het vetweefsel of geproduceerd door de novo lipogenese, de lever en dienen als substraat voor de productie van lipotoxische stoffen (bijv. Ceramiden, lysofosfatidylcholines en diacylglycerol), vooral door mitochondriën en CYP-activiteiten. [26-30]. Deze metabole stress bevordert pro-inflammatoire cytokine-afgifte en celdood, wat op zijn beurt een van de belangrijkste mechanismen van schade in het NAFLD-histologische beeld vertegenwoordigt [31,32]. ROS kan worden gegenereerd in verschillende organellen, zoals mitochondriën, endoplasmatisch reticulum (ER) en peroxisomen, maar ook door veel enzymen zoals xanthine-oxidase, CYP2E1, cyclo-oxygenasen, NADPH-oxidase (NOX) en lipoxygenase [20,33].

1.1.1. Oxidatieve stress afgeleid van mitochondriale disfunctie

De belangrijkste bron van ROS in NAFLD wordt vertegenwoordigd door mitochondriën, die ook verantwoordelijk zijn voor de ontregeling van het lipidenmetabolisme in het geval van een verstoord biologisch functioneren, typisch gemarkeerd bij metabole stoornissen [34,35]. Dienovereenkomstig worden veranderingen in het zuurstofverbruik, de activiteit van de elektronentransportketen (ETC) en de vetzuuroxidatie (FAO) uitgebreid beschreven in de literatuur. In feite wordt de lever tijdens de vroege stadia van NAFLD geconfronteerd met een hoge instroom van externe FA's, en verschillende onderzoeken toonden de toename van FAO aan in verschillende diermodellen van NASH [36-40], hoewel er enkele tegenstrijdige gegevens bestaan ​​in menselijke modellen [41 –52]. Een recente studie beschreef bijvoorbeeld de verhoging van FAO na 4 weken bij muizen die met een vetrijk dieet (HFD) werden gevoerd, terwijl na 8 weken de normale -oxidatie was hersteld [53]

In de lipidenrijke toestand probeert de lever inderdaad de overmatige productie van lipotoxische moleculen tegen te gaan door triglyceriden te accumuleren en FAO te beheersen [24,54,55], zelfs als verschillende factoren zoals IR, leptine en enterokinase ook een rol zouden kunnen spelen. rol in dit scenario [56]. ETC-resultaten worden ook gewijzigd door overbelasting van FA's, aangezien de aanwezigheid van FA's, met name meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA's), O2 ·- genereert en complex I en III inactiveert [57-60], door directe interactie met ETC-componenten of interferentie met membraanvloeibaarheid die lokt protonenlekkage uit [57-62]. De rol van oxysterolen bij de progressie van NAFLD mag niet worden onderschat, zoals gesuggereerd door nieuw bewijs [63]. In een recent onderzoek is zelfs aangetoond dat cholesterolsuppletie bij HFD-gevoede muizen de leveraccumulatie van specifieke oxysterolen bepaalde (bijv. 7-hydroxycholesterol, 7-ketocholesterol en 5-cholestane -3, 5, 6-triol), die synergetisch werkten met FA's om de mitochondriale functie en biogenese te verstoren, waardoor NAFLD-progressie werd vergemakkelijkt [27].

In de literatuur zijn er nog verschillende discrepanties over de mitochondriale disfunctie bij eenvoudige steatose en NASH, zoals veranderingen in cytochroom-c-oxidase (COX)-activiteit [41,64-69], zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën [70-72], oxidatieve fosforylering (OXPHOS) efficiëntie [68,71,72] en ATP-niveaus [72-76], zowel bij patiënten als bij muizenmodellen. In het bijzonder resulteerde de COX-activiteit onveranderd, verminderd of verhoogd; ATP-niveaus zijn beschreven als normaal of verlaagd; mitochondriale zuurstofopname was verhoogd, normaal of grotendeels afgenomen; OXPHOS resulteerde in augmented of onveranderd [64–70,72–76].

1.1.2. ER-bijdrage aan oxidatieve stress

Een belangrijke bijdrage aan oxidatieve stress komt ook voort uit ER-stress. De productie van H2O2 komt bijvoorbeeld voort uit de overdracht van elektronen naar moleculaire zuurstof die wordt aangestuurd door ER-oxidoreductase-1, dat op zijn beurt elektronen ontving van eiwitdisulfide-isomerase in het proces van eiwitvouwing [24]. Verschillende dierstudies toonden aan dat de verhoogde activiteit van C/EBP homologe proteïne (CHOP) betrokken is bij UPR-gemedieerde ROS-productie tijdens langdurige ER-stress [77,78]. Verstoringen in de GSH / GSSH-verhouding in ER-lumen brengen eiwitmisvouwing en ROS-productie met zich mee [79-81].

Bovendien fosforyleert RNA-afhankelijke eiwitkinase-achtige ER eukaryote initiatiefactor -2 kinase (eIF2a) nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2), waardoor de translocatie naar de kern en de expressie van antioxidantenwapens zoals heem worden bevorderd oxygenase-1 (HO-1) ​​[82]. Daarom is de overspraak tussen ER-stress en mitochondriale disfunctie momenteel van belang en moet verder onderzoek worden gedaan om de specifieke bijdrage ervan in deze context te beoordelen.

2. Redoxbiologie en immuunregulatie bij NAFLD-progressie

Redox-balans is voornamelijk betrokken bij zowel adaptieve als aangeboren immuniteit, en draagt ​​bij aan macrofaag-, lymfocyt- en dendritische cel (DC) signalering en cytokine-responsmodulatie [83]. Het eerste bewijs van de rol van oxidant in immuunactiviteit werd beschreven in 1991, toen werd aangetoond dat H2O2 bij micromolaire concentraties nucleaire factor kappa-licht-keten-versterker van geactiveerde B-cellen (NF-KB) transcriptie induceerde in menselijke T-lymfocyten [84] .

Bij verschillende leverziekten is de overspraak tussen redox-onbalans en immuunrespons beschreven [85]. Ontsteking en oxidatieve stress treden gelijktijdig op in de lever en voeden elkaar. Bovendien bevordert aanhoudende oxidatieve stress het ontstaan ​​van een chronische ontsteking die de oorzaak is van de nadelige samenhang tussen leverziekte en de systemische complicaties ervan.

Reactieve soorten activeren verschillende transcriptionele factoren en receptoren zoals NF-KB, activatorproteïne-1 (AP-1), p53, hypoxie-induceerbare factor 1-alpha (HIF-1 ) , peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR- ), -catenine/Wnt en Nrf2, die op hun beurt de expressie moduleren van moleculen die betrokken zijn bij ontsteking [86]. Merk op dat NF-KB een belangrijke bemiddelaar is van het ROS-bevorderende effect, direct geactiveerd door reactieve soorten en indirect door ROS-beschadigd DNA [87].

Bij NAFLD is overmatige ophoping van lipiden de primaire beweging van metabole stress, die aangeboren immuunactivatie bevordert, de drijvende kracht achter ontsteking in NASH [88-90]. KC's worden met name geactiveerd door ROS en andere stimuli en worden de belangrijkste hepatische producenten van ROS, evenals cytokines, groeifactoren en chemokines [91-93].

2.1. De rol van PRR's

Bij NAFLD wordt de lever continu binnengedrongen door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) (bijv. Bacteriële producten, lipopolysacchariden-LPS), schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's) en metabolieten (bijv. FFA's, mitochondriaal DNA, lipotoxische producten) die worden waargenomen door patroonherkenningsreceptoren (PRR's), zoals tolachtige receptoren (TLR's) en nucleotide-bindende oligomerisatie-domeinachtige receptoren (NLR's) met de daaruit voortvloeiende activering van pro-inflammatoire cascades [94-97]. Het meest bekende DAMP dat vrijkomt door beschadigde cellen is het hoge mobiliteit groep box 1-eiwit (HMGB1), dat TLR4 activeert met de daaruit voortvloeiende my{11}}afhankelijke inductie van de NF-kB-route [98,99]. In een muismodel van ischemie/reperfusieschade induceerde superoxide-anion NOX-activering door TLR4 in neutrofielen [100]. Verschillende experimentele muismodellen toonden aan dat interactie tussen mtDNA en TLR-9 cytokine- en fibrogene reacties induceerde in KC's en leverstellaatcellen (HSC's) [101-103].

Een groep cytoplasmatische PRR's wordt echter gevormd door oligoadenylaatsynthase (OAS)-achtige receptoren (OLR's), sensoren van nucleïnezuren. In geval van schade kunnen dsDNA, microbieel en mtDNA worden gedetecteerd door OLR's, die transcriptie van pro-inflammatoire genen activeren door een remmer van nucleaire factor kappa-B kinase subunit ε (IKKε) en activator eiwit 1 (TBK1) signalering [17].

In leverontstoken gebieden en op HSC's is er een hogere expressie van receptoren voor geavanceerde glycatie-eindproducten (RAGE's), een klasse van PRR's [104]. De vorming van AGE's bevordert de vorming van een aanzienlijke hoeveelheid ROS; bovendien activeren geoxideerde RAGE's NOX1, wat bijdraagt ​​aan de ROS-productie [105]. NLR-familie pyrine-domein met 3 (NLRP3) is een PRR die interageert met PAMP's en DAMP's en betrokken is bij het genereren van ontstekingsmaskercomplexen. Met name ROS geproduceerd door mitochondriën en NOX's bevordert de vorming van NLRP3-ontstekingsmaskers [106], terwijl aaseters zoals catalase en superoxide dismutase (SOD) de activering ervan remmen [107]. Dienovereenkomstig is gesuggereerd dat de kristalstructuur van NLRP3 erg gevoelig is voor variaties in de red ox-balans [108].

Over het algemeen activeren PRR's verschillende intracellulaire doelen, zoals Transforming Growth Factor- (TGF-) geactiveerde kinase 1 (TAK1) en apoptose-signaalregulerende kinase 1 (ASK1), beide leden van de mitogeen-geactiveerde eiwitkinasekinases (MAP3K) -familie, die activeren op hun beurt andere kinasen zoals c-Jun-N-terminale chinas (JNK), adenosinemonofosfaat-geactiveerde proteïnekinase (AMPK) en IkB, dus met een sleutelrol in NASH-pathogenese [109-111].
Interessant is dat, afgezien van receptorinteractie, verschillende rapporten beschreven dat ROS stroomafwaartse aangeboren immuniteitssignalering zou kunnen beïnvloeden [112]. H2O2 verhoogt bijvoorbeeld de activiteit van MAPK's (bijv. p38) en daarmee de JNK-route, die op zijn beurt de productie van verdere ROS bevordert [113-115]. Bovendien kunnen NF-kB, AP-1 en PPAR's direct worden gemoduleerd door oxidatieve soorten, waardoor de transcriptie van cytokines wordt geïnduceerd [116-119]. ROS en lipideperoxidatieproducten zoals hydroxinonenal- (HNE-) en malondialdehyde- (MDA-) adducten kunnen NF-kB direct activeren of door remming van IKK-fosforylering in aangeboren immuuncellen [120-122].

Daarom is het natuurlijke gevolg van aanhoudende stimuli chronische ontsteking, activering van HSC's met collageenafzetting, verhoogde IR en verdere afwijkende expressie van pro- en antioxidant-enzymen [123-125]. De aanwezigheid van redox-onbalans en lipideperoxidatie is echter een gemeenschappelijk kenmerk van NAFLD en NASH [26] en de betrokkenheid van adaptieve immuniteit lijkt een sleutelfactor te zijn in NAFLD-progressie. Dienovereenkomstig hebben onlangs Azzimato V. et al. beschreef dat levermacrofagen pro-inflammatoir zijn bij NASH, maar niet bij NAFLD en obesitas, hoewel tekenen van oxidatieve stress aanwezig zijn in beide aandoeningen, aangezien NRF2 gedownreguleerd is [126].

2.2. De rol van OSE's

Oxidatieve stress is beschreven als de belangrijkste trigger bij het stimuleren van adaptieve immuniteit, vooral via geoxideerde fosfolipiden en aldehyden die worden gegenereerd door lipideperoxidatie, zoals MDA, malondialdehyde-acetaldehyde (MAA) en 4-HNE-eiwitadducten, formeel oxidatieve stress genoemd. specifieke epitopen (OSE's) [127-129]. OSE's zijn betrokken bij verschillende systemische ziekten en atherosclerose, door zowel aangeboren als adaptieve immuniteit te stimuleren [127,130].

Specifieke anti-OSE immunoglobuline G (IgG) komt veel voor (ongeveer 40 procent) bij volwassenen met NAFLD of NASH en bij kinderen met NASH (60 procent). Bovendien zijn ze in hoge mate in verband gebracht met fibrose, de ernst van leverlobulaire ontsteking en een intrahepatisch infiltraat van B-cel- en T-celaggregaten [128,131,132]. Deze waarnemingen werden bevestigd in diermodellen van NAFLD en NASH. Met name anti-OSE IgG-titers correleerden met B-celrijping in plasmacellen, terwijl behandeling met antioxidanten met N-acetylcysteïne antilichaamrespons verhinderde [131,133,134]. Muizen die vooraf zijn geïmmuniseerd met eiwit-MAA-adducten vertonen een Th1-polarisatie van CD4 plus T-lymfocyten in de lever, die IFN- produceren, waardoor KCs M1-activering wordt bevorderd [131]. Dienovereenkomstig correleert IgG bij patiënten met NASH-anti-OSE's met circulerende interferon (IFN-) niveaus [133]. De betrokkenheid van Th1- en Th17-lymfocyten bij de evolutie van NAFLD naar NASH is algemeen gerapporteerd [131,135-138]. Tegelijkertijd wordt in NAFLD muizenmodellen de hoeveelheid CD4 in de lever plus regulatoire T-cellen (Tregs) lymfocyten verminderd [139,140]. Treg-cellen zijn meestal betrokken bij het handhaven van zelftolerantie en het beheersen van overmatige T-celactivering in de lever [141,142]. Het lijkt erop dat ROS Treg-celapoptose bevordert, waardoor Th1- en Th17-pro-inflammatoire activiteit wordt vergemakkelijkt [139,140].

Daarom weerspiegelt de B-celactiviteit met anti-OSE IgG-productie de aanwezigheid van oxidatieve stress en ontsteking. Daarentegen is beschreven dat anti-OSE IgM-afname bij NAFLD-patiënten in vergelijking met controles en omgekeerd correleert met obesitas en leverschade [143]. Dienovereenkomstig beschermt T15 natuurlijk IgM tegen geoxideerde fosfatidylcholine tegen NASH in LDLR KO-muizen gevoed met een HF-HC-dieet, waarschijnlijk door de door geoxideerde LDL geïnduceerde activering van KC's te voorkomen [144].

het voorkomen van de door geoxideerde LDL geïnduceerde activering van KC's [144]. Al met al onderstrepen deze bevindingen hoe oxidatieve onevenwichtigheid zich gedraagt ​​als de hoeksteen van NAFLD-progressie, waardoor aangeboren immuniteit wordt aangewakkerd om cytokines en nieuwe reactieve soorten te produceren die ontsteking in stand houden door adaptieve immuuncellen (samenvatting in tabel 1).

3. De immuunrespons bij HCC-ontwikkeling

Tegenwoordig vertegenwoordigt HCC wereldwijd de vijfde meest voorkomende tumor en de derde belangrijkste doodsoorzaak door kanker, resulterend in meer dan 600{2}} sterfgevallen per jaar [145]. Het kan in de NAFLD-context optreden, onafhankelijk van de omringende gevorderde fibrose of cirrose, waardoor het verloop van de ziekte wordt bemoeilijkt en de prognose enorm verslechtert [146].

HCC-pathogenese blijft uiterst complex en omvat verschillende en niet volledig opgehelderde biologische dynamieken. In de afgelopen decennia hebben verschillende bevindingen, parallel aan de genetische en epigenetische mechanismen rond de ontwikkeling en verslechtering van HCC, drie gekoppelde elementen onthuld die een tumorale micro-omgeving creëren: chronische flogose, oxidatieve stress en ontregeling van het immuunsysteem [146-148].

Normaal gesproken vertegenwoordigt ontsteking de adaptieve reactie op weefselbeschadiging, waarbij verschillende mechanismen betrokken zijn (dilatatie van bloedvaten, rekrutering van immuuncellen en productie van cytokinen) en die gericht zijn op het beschadigen van de resolutie en het herstel van de homeostase [149].

We hebben eerder het belang beschreven van de bidirectionele relatie tussen oxidatieve stress en immuniteit bij NAFLD-progressie. Bovendien, wanneer de ontstekingsprikkels aanhouden of de regulatiemechanismen worden verstoord, treedt er een "niet-oplossende ontsteking" op, die pathologische gevolgen zoals fibrose en metaplasie bepaalt, zoals beschreven bij verschillende menselijke ziekten, waaronder HCC [149,150]. Daarom is chronische ontsteking van cruciaal belang voor de ontwikkeling van HCC, dus deze tumor vertegenwoordigt een klassiek paradigma van aan ontsteking gerelateerde kanker [151]. In overeenstemming met de huidige wetenschappelijke kennis hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat meer dan 90 procent van de HCC's ontstaan ​​in de context van leverontsteking en, interessant genoeg, vermindert het gebruik van niet-steroïde anti-inflammatoire middelen de incidentie en/of recidief ervan [149,152-154 ].

Het aangeboren immuunsysteem wordt getriggerd door oxidatieve stress en aanhoudend letsel om niet alleen te reageren tegen "niet-zelf" potentiële pathogenen, maar ook tegen DAMPS, wat het opkomende concept van "steriele ontsteking" aanmoedigt dat zeer cruciaal lijkt te zijn bij de ontwikkeling van HCC [155,156 ].

Zoals eerder vermeld, worden de meeste DAMP's geproduceerd onder omstandigheden van oxidatieve stress en/of mitochondriale disfunctie [156,157]. De hoge ROS-productie induceert mtDNA-schade, veroorzaakt mitochondriale disfunctie en genereert zo een vicieuze cirkel waarin een gebrekkige productie van enzymen die betrokken zijn bij de respiratoire elektronentransportketen optreedt, waardoor de ROS-productie verslechtert [158]. Nadat het is vrijgegeven in het cytosol en de extracellulaire omgeving, werkt mtDNA als DAMP, omdat het de niet-gemethyleerde CpG-DNA-motieven bevat [159,160].

Bovendien wordt mitochondriale disfunctie ook in verband gebracht met ontregeling van mitochondriale splijting, mitochondriale permeabiliteitsovergang (MPT) poriën en necroptose (een vorm van geprogrammeerde celdood), allemaal betrokken bij NASH en progressie van leverkanker [158,161-163].

Zoals reeds beschreven, is een belangrijke DAMP HMGB1, een alomtegenwoordig nucleair niet-histoneiwit dat deelneemt aan DNA-replicatie, transcriptie en reparatie [164]. De biologische activiteit van vrijgegeven HMGB1 hangt af van de redoxtoestand (volledig geoxideerd of disulfide), die wordt gemoduleerd door de oxidatieve kenmerken van de tumorale micro-omgeving [165].

De volledig geoxideerde HMGB1-vorm bevordert immunotolerantie, vermindert de rijping en activering van DC's en bevordert zo de ontsnappingsmechanismen van het tumorimmuun [165].

DC's zijn een belangrijke hepatische cellulaire populatie, waarvan de veranderingen, in termen van verminderde functionaliteit, zoals verminderde rijping en falen van HCC-geassocieerde antigeenpresentatie, betrokken zijn bij tumorpathogenese [166-168]. Bij HCC-patiënten is de hoeveelheid geactiveerde DC's (CD83-positieve DC's) in hepatische knobbeltjes lager dan in cirrotische of gezonde controleweefsels [169].

Bovendien impliceert de lagere DCs-expressie van menselijke leukocytenantigeen (HLA) klasse-I-moleculen het verlies van antigeenpresentatie-activiteit, en draagt ​​zo bij aan verminderde rekrutering van tumorspecifieke lymfocyten [170]. Gezien de belangrijke functie van DC's in het samenspel tussen aangeboren en adaptieve immuunreacties, veroorzaakt de verstoring van de efficiëntie van deze mechanismen een zwakke T-cel immuunrespons tegen kanker [171]. Dienovereenkomstig zijn CD14 plus cytotoxisch T-lymfocyt-geassocieerd eiwit (CTLA)-4 plus DC's, een recent geïdentificeerde subset, oververtegenwoordigd in het tumorweefsel van HCC-patiënten en zijn ze betrokken bij de productie van sommige regulerende cytokines (bijv. , IL-10), die de CD4 plus T-cel immuunrespons onderdrukken, waardoor de tumorprogressie wordt vergemakkelijkt [172].

Zoals reeds besproken, gedraagt ​​de disulfidevorm van HMGB1 zich als een DAMP, activeert TLR4 en bevordert de aangeboren immuunrespons met pro-inflammatoire en chemoattractieve effecten [173].

De activering van TLR's, door de stimulatie van JNK- en NF-kB-routes, leidt tot verschillende gevolgen, waaronder onder andere de productie van Tumor Necrosis Factor (TNF-) (in staat om de proliferatie van tumorcellen te induceren) evenals vele andere bemiddelaars die betrokken zijn bij de rekrutering en polarisatie van verschillende ontstekingsceltypen [174-177]. Met name hoge niveaus van macrofaag-koloniestimulerende factor (MCSF) en chemokine (CC-motief) ligand 2 (CCL2), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en TGF induceren rekrutering en infiltratie van macrofagen in peritumoraal weefsel, hun polarisatie in M2-fenotype evenals de differentiatie in tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's) [178,179] (Figuur 2).

Figuur 2.

Oxidatieve stress, ontsteking en immuunontregeling bij HCC-progressie. NASH: niet-alcoholische steatohepatitis; ROS: reactieve zuurstofspecies; DAMP's: schade-geassocieerde moleculaire patronen; PAMP's: pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen; LPS: lipopolysaccharide; OPE's: oxidatiespecifieke epitopen; HMGB1: Hoge Mobiliteit Groep Doos 1; ECM: extracellulaire matrix; NLRP3: pyrinedomein van de NOD-achtige receptorfamilie dat -3 bevat; TLR: Toll-achtige receptor; DC's: dendritische cellen; NK's: natuurlijke killercellen; HSC's: hepatische stellaatcellen; CAF's: kanker-geassocieerde fibroblasten; MCSF: macrofaag-koloniestimulerende factor; CCL2: chemokine (CC-motief) ligand 2; VEGF: vasculaire endotheliale groeifactor; EGF: epidermale groeifactor; HGF: hepatocytgroeifactor; FGF: fibroblastgroeifactor; IL-6: interleukine 6; IL-8: Interleukine 8 chemokine; CXCL12: CXC-motiefligand 12; MMP3: matrixmetalloproteasen 3; MMP-9: matrixmetalloproteasen 9; TGF- : transformerende groeifactor- ; IL-10: Interleukine 10. Ononderbroken lijnen geven directe en stabiele mechanismen aan; stippellijnen geven indirecte en potentiële aan.

Ontsteking geketend met oxidatieve stress (beide constant aanwezig in de NASH-context), mitochondriale disfunctie (inclusief het vrijgeven van mtDNA) en veranderingen in de darmmicrobiota (met name de werking van LPS) bevorderen allemaal de aanmaak van DAMPS en PAMPS. Deze moleculen kunnen op hun beurt TLR's en Inflammasomen stimuleren en activeren, wat resulteert in de productie van cytokines, chemokines en groeifactoren. Deze gebeurtenissen impliceren verschillende gevolgen en in het bijzonder: (i) rekrutering, activering en differentiatie van monocyten in TAM's, cellen die kunnen bijdragen aan de angiogenese en fibrose, in samenwerking met CAF's; (ii) Activering en differentiatie van HSC's in myofibroblastachtige cellen, waardoor de fibrogenese verslechtert.

Bovendien dragen geactiveerde HSC's bij aan de immunotolerantie, waardoor NK's-functies worden verstoord (met name het vermogen van NK om HSC-apoptose te induceren) en T-regs-activering wordt bevorderd. Deze laatste gebeurtenissen worden ook vergemakkelijkt door de bovengenoemde TAM's die een Th2-immuunrespons kunnen bevorderen, wat leidt tot een toestand van immunotolerantie. Al met al dragen de hierboven geïllustreerde mechanismen bij aan de verslechtering en progressie van de HCC.

Bovendien vertegenwoordigt ROS-productie een cruciaal punt in het proces van macrofagische differentiatie in M2 en TAM's, en antioxiderende behandeling, waardoor de productie van superoxide O2- wordt verminderd, remt TAM's differentiatie en tumorigenese in muismodellen van kanker [180,181].

Bovendien kunnen TAM's verder differentiëren in immunotolerante M2-macrofagen, waarvan de aanwezigheid in HCC geassocieerd is met een slechte overlevingskans na curatieve resectie [182]. Deze cellen kunnen namelijk door de uitscheiding van cytokines (zoals TGF- en IL-10), chemokines, groeifactoren en matrixmetalloproteasen bijdragen aan fibrose, tumorgroei en -progressie, ontwikkeling van intrahepatische metastasen, angiogenese en, met name, immuunonderdrukking door Th{4}}type immuunrespons te bevorderen [182,183].

Het genexpressieprofiel van HCC-patiënten onthult een verschuiving van een Th1- naar een Th2-immuunrespons, wat een centrale rol suggereert die wordt gespeeld door cellulaire immuundisregulatie bij het verschijnen van levertumoren [184]. De mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verandering zijn nog niet volledig opgehelderd, hoewel verschillende mediatoren geproduceerd door ofwel stromacellen of tumorcellen, zoals IL-10, glucocorticoïde hormonen, ROS, apoptotische cellen en het immuuncomplex bijdragen aan het creëren van een bepaalde micro-omgeving die vergemakkelijkt de polarisatie van T-cellen in Th2-lymfocyten [185]. Deze verschuiving brengt een toename van Th2-cytokineniveaus met zich mee (dwz IL-4, IL-5 en IL-10) en een verlaging van Th1-cytokineniveaus (dwz IFN-, IL{{12 }}, IL-15, IL-18 en IL-2). Dit is relevant omdat CD4 plus Th1-lymfocyten door de productie van IFN- de antitumorale respons in HCC versterken en dienovereenkomstig is een significante afname van CD4 plus Th1--cellen bij patiënten met levercirrose en HCC gemeld, wat hun belang in de biologie van leverkanker [186,187].

Interessant is dat M2-gedifferentieerde TAM's de immuuntolerantie bevorderen, wat ook de Tregs-rekrutering bevordert [178]. Tregs, gekenmerkt door de CD25-expressie op hun oppervlak en door de activiteit van intracellulaire transcriptionele factor forkhead box P3 (Foxp3), zorgen fysiologisch voor zelftolerantie door zelfreactieve immuuncellen te onderdrukken. In het bijzonder wordt HCC geassocieerd met de aanwezigheid van een bepaalde T-regs-subset, namelijk geïnduceerde T-regs (iTregs), zowel in het perifere bloed als in de tumorale micro-omgeving. De uitputting van iTregs lijkt antitumorale immuunresponsen te kunnen bepalen [188,189]. In dit opzicht lijkt de productie van TGF- en de inductie van T-regs te worden begunstigd door van myeloïde afgeleide suppressorcellen (MDSC's), een subset van inflammatoire monocyten sterk vertegenwoordigd in tumorweefsel van HCC-patiënten [190].

Bovendien lijkt afwijkende samenwerking tussen TAM's en mesenchymcellen in de lever betrokken te zijn bij het genereren van een vicieuze cirkel die het begin van de tumor veroorzaakt. Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) kunnen epidermale groeifactor (EGF), hepatocytgroeifactor (HGF), fibroblastgroeifactor (FGF), IL-6, IL-8, chemokine CXC-motief ligand 12 ( CXCL12), en matrixmetalloproteasen (MMP-3 en MMP-9) ​​[179,191,192]. Door middel van cyclo-oxygenase 2 (COX-2) en uitgescheiden eiwitzuur rijk aan cysteïne (SPARC), rekruteren en stimuleren CAF's TAM's, die de activering van fibroblasten verder kunnen verhogen door de uitscheiding van TNF- en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF). ), het genereren van een biologisch mechanisme waardoor flogose en fibrose elkaar stimuleren met de betrokkenheid van HSC's [193] (Figuur 2). Nogmaals, interessant genoeg speelt oxidatieve stress een centrale rol in de biologische dynamiek rond dit proces, zoals bewezen door verschillende klinische en diermodellen die suggereren dat de ROS en van lipoperoxidatie afgeleide producten (met name H2O2 en MDA-adducten) de HSC-activering bevorderen [ 194].

De activering van HSC's vertegenwoordigt een scharniermoment in deze foto. Geactiveerde HSC's kunnen inderdaad differentiëren in een senescent profiel, waardoor de rekrutering en activering van immuuncellen uit de bloedbaan, inclusief TAM's, wordt geïnduceerd en de signalering van de groeifactorreceptor, in het bijzonder PDGF en TGF-, wordt verhoogd [195]. In overeenstemming hiermee suggereren recente bevindingen het TGF-vermogen om de activering en functies van Natural Killer (NK)-cellen te remmen door het zoogdierdoelwit van de rapamycine (mTOR)-route te onderdrukken [196]. NK-cellen bemiddelen normaal gesproken hun functies door cytolytische korrels te produceren die perforine, granzymen, tumornecrosefactor-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) en IFN- bevatten, en spelen daarom een ​​dubbele rol: cytolytische werking en regulatie van de andere immuuncellen [197] .

In NK-cellen remt de receptoractiviteit, gemoduleerd door geactiveerde HSC's, de normale werking van hepatische NK-cellen en draagt ​​zo bij aan de ontwikkeling en progressie van leverkanker [198]. Nog meer in de HCC-context kan het functietekort van de NK een cruciale rol spelen, aangezien deze cellen apoptose van geactiveerde HSC's kunnen induceren, wat uiteindelijk resulteert in een antifibrotisch effect [199]. Bovendien genereren aanhoudende ontsteking en oxidatieve stress apoptose-resistente geactiveerde HSC's, waardoor de afzetting van fibrose wordt verbeterd [200].

Geactiveerde HSC's zijn ook betrokken bij de bevordering van immunotolerantiemechanismen, het afscheiden van cytokines, die MDSC-expansie en rekrutering van T-regs in tumorweefsel induceren [201]. Zoals eerder vermeld, kunnen Tregs op hun beurt interfereren met de aangeboren immuniteit en de activiteit van NK-cellen en DCs reguleren (voornamelijk door de productie van ontstekingsremmende cytokines zoals TGF- en IL-10) [202]. Bovendien zouden T-regs ook de adaptieve immuunrespons kunnen verstoren door T-celproliferatie, CD8 plus T-celinfiltratie in kankerweefsel en IFN-secretie te onderdrukken [203,204]. Zoals bekend vertegenwoordigt IFN-secretie een fundamenteel moment om de activering van naïeve CD4 plus en CD8 plus T-cellen tegen pathogenen en kanker te bevorderen [205]. Voor effectieve T-celactivering is de antigeenpresentatie door Antigen Presenting Cells (APC's) aan de CD4/CD8 plus T-celreceptor niet voldoende [206], en het samenspel tussen lymfocyten co-stimulerende receptoren (bijv. CD28, ICOS, CD137, OC40 en CD27) en hun relatieve liganden (bijv. CD80/86, B7RP1, CD137L, OC40L en CD70) op APC's zijn essentieel [207].

Ondertussen wordt de fysiologische modulatie van de T-lymfocytenrespons gemedieerd door co-remmende receptoren die worden geactiveerd door andere liganden [207]. Deze interacties, waaronder CTLA-4-CD80/, 86 en geprogrammeerde dood 1 (PD-1)-PD-L1, vertegenwoordigen de zogenaamde "immuuncontrolepunten". Relevant is dat chronische ontsteking in NASH een weefselmicro-omgeving creëert die de ontwikkeling van uitgeputte T-cellen bevordert: deze cellen brengen hoge niveaus van cohibitoire receptoren tot expressie (bijv. TLA-4 en PD-1) en lage effectorcytokines, met als gevolg verminderde cytotoxiciteit tegen kanker [208].

Daarom wordt, gezien dit bewijs, de mogelijkheid om het immuunsysteem tegenwoordig te reguleren beschouwd als een zeer fascinerende therapeutische grens. Met name de toediening van immuuncontrolepuntremmers (ICI), zoals anti-CTLA-4- en PD1-geneesmiddelen, vertegenwoordigt een bemoedigende therapeutische strategie bij patiënten met dit neoplasma [209].

Over het algemeen laten deze onderzoeken zien hoe de ontregeling van het immuunsysteem in HCC, in termen van kwantiteit en functieveranderingen van immuuncellen, bijdraagt ​​aan het creëren van een tumorale micro-omgeving waarin de ontwikkeling en progressie van kanker uit de hand lopen.

In dit heterogene scenario dat zeer verschillende celpopulaties omvat, zou de oxidatieve onevenwichtigheid de fil rouge kunnen vertegenwoordigen die alle elementen van dit inflammatoire netwerk met elkaar verbindt.

4. Toekomstperspectieven: de rol van getrainde immuniteit

In de loop der jaren is NAFLD een van de belangrijkste gezondheidsproblemen geworden in het tijdperk van de obesitaspandemie, en er zijn sterke wetenschappelijke inspanningen gericht op het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het ontstaan ​​en de evolutie ervan, waarbij de interpretatie lijkt te worden vertegenwoordigd door persistentie van ontstekingen , grotendeels gekoppeld aan de activering van macrofagen [210]. Zoals eerder vermeld, zouden deze cellen betrokken kunnen zijn bij het aansturen van dit gecompliceerde pathologische beeld bij het ontwikkelen van verschillende metabole gevolgen zoals IR, obesitas, type II diabetes mellitus en atherosclerose, alle processen gebaseerd op een verminderde controle van de oxidatieve stress-onevenwichtigheid [211].

De medische vooruitgang en de nieuwe geavanceerde wetenschappelijke kennis hebben de oude definitie van het functioneren van het immuunsysteem veranderd. Meerdere contacten met sommige antigenen (bijv. PAMP's, DAMP's), evenals metabolische stimuli, zouden een secundaire immuunrespons kunnen veroorzaken die niet uitsluitend wordt gemaakt door adaptieve immuuncellen [212,213]. Volgens de internationale wetenschappelijke gemeenschap vertegenwoordigt de term "Trained Immunity" (TI) een geheel van immunologische processen waarbij cellen van niet-specifieke immuniteit betrokken zijn, in het bijzonder monocyten en NK's, afkomstig van een tweede antigeen contact [212]. Dit tweede contact zou de activering van verschillende signaalroutes kunnen veroorzaken, die verschillende effecten hebben op de cellulaire genexpressie die op hun beurt voornamelijk gericht zijn op het produceren van een krachtigere immuunreactie tegen antigenen in vergelijking met het eerste contact [212,214].

In tegenstelling tot immuunaanpassing die plaatsvindt in B-lymfocyten, door de productie van beenmergcelclusters die in staat zijn om een ​​specifieke respons tegen een bepaald antigeen uit te werken, is dit type aanpassing voornamelijk gebaseerd op epigenetische veranderingen, gekoppeld aan een andere histonacetylering of de werking van sommige siRNA zoals miR-155 en daarom heeft het een duur die kan variëren van enkele dagen tot enkele jaren [212,215,216]. Een TI-respons is niet "antigeenspecifiek" en kan worden overgedragen op nieuwe celgeneratie tijdens medullaire rijping, waardoor ze de mogelijkheid krijgen om tegen de antigenen te reageren met een typische "getrainde respons" [217-219].

Om de reden voor de mogelijke betrokkenheid van TI bij het complexe NAFLD-scenario echter beter te verduidelijken, is een van de belangrijkste aspecten de onderlinge verbinding tussen TI-respons en celmetabolisme [220,221]. Het immunometabolisme vertegenwoordigt het hoeksteenonderzoeksveld voor het begrijpen van de regulatie van de ontstekingsreactie (zoals in M1-macrofagen), die voornamelijk wordt ondersteund door de glycolytische activiteit en met als gevolg een stopzetting van de Krebs-cyclus. Sommige metabolische producten van deze cyclus, zoals succinaat of alfa-ketoglutaraat, spelen een belangrijke rol als regulerende bemiddelaars in dit proces [222].

Bovendien zijn sommige enzymen van mitochondriale ETC betrokken bij de TI, waaronder succinaatdehydrogenase (SDH), dat een van de belangrijkste biologische doelen van itaconaat zou zijn [223]. Al met al bevestigde dit wetenschappelijke bewijs de cruciale rol van de mitochondriën in dit complexe biologische netwerk waardoor de pathogenese van sommige immuun-metabolisch gemedieerde ziekten, die nog niet volledig bekend zijn, beter kon worden opgehelderd.

De balans tussen succinaat en alfa-ketoglutaraat bepaalt de regulatie van sommige effectoren van TI, waaronder Jumanji-domein bevattende (JMJ) en tien-elf translocaties (TET), die voornamelijk zouden werken door de modificatie van de histonenacetylering, zoals H3K4 [224] . Hiertoe zouden het onderzoek naar het mitochondriale metabolisme van monocyten en de cellulaire omschakeling van de ETC naar de glycolytische overheersende energetische route bij dieren (vetrijk dieetmodel) en klinische modellen van NAFLD nuttige routes kunnen zijn om de betrokkenheid van TI hierbij volledig te begrijpen. complex pathologisch beeld.

Bovendien is een ander belangrijk punt dat in deze context kan worden beoordeeld, vertegenwoordigd door de Itaconate-activiteit, een van de belangrijkste regulerende mediatoren van TI, die rechtstreeks voortkomt uit de omzetting van cis-aconitaat gemaakt door immuunresponsief gen 1 (IRG1) -enzym [225,226].

IRG-1-expressie wordt genetisch en epigenetisch gereguleerd door LPS, dat de expressie ervan stimuleert via een pad dat proteïnekinase C (PKC)-activering omvat [227]. De miR93 daarentegen verlaagt de IRG-1-expressie door in te werken op de transcriptiefactor Interferon Regulatory Factor-9 [228].

Itaconate werkt als een ontstekingsremmende mediator, klaar om de ongerechtvaardigde en overmatige activering van de ontstekingscascade te reguleren, en werkt via verschillende mechanismen: stopt de activiteit van SDH, betrokken bij de co-enzym Q-synthese en vervolgens ontstekingsactivatie en fructose-6- fosfaatkinase; vormt complexen met glutathion; remt de transcriptie IkB-zeta-factor, betrokken bij de synthese van IL-6; activeert de Nrf2 door de kelch-achtige ECH-geassocieerde proteïne 1 (KEAP1) alkylering [229,230]. LPS kan een toename van de productie van pro-inflammatoire cytokines induceren, al snel gevolgd door een stimulans voor de synthese van itaconaat door activering van IRG-1. In een onlangs gepubliceerd artikel is het belang van de TI benadrukt in een muismodel van ischemie/reperfusie leverschade, gebruikt als een bekend model van leverschade door oxidatieve stress, waarin de Nrf2-activiteit hierin essentieel lijkt te zijn. instelling [231.232].

Bovendien krijgt deze hypothese, in het licht van de verhoogde intestinale permeabiliteit voor verschillende immuun-triggerende antigenen bij NAFLD-patiënten, nog meer belangstelling. Dit zou niet alleen de mogelijkheid kunnen bieden om het pathogenetische proces rond NAFLD beter te begrijpen, maar zou de wetenschappelijke gemeenschap kunnen aanzetten tot het begrijpen van het natuurlijke beloop en het ontstaan ​​van complicaties, evenals om het te evalueren als een potentieel therapeutisch doelwit in de werkelijke last van de optimale ziekte. medische behandeling [233.234]

Vanwege de hoofdrol van macrofagen in NAFLD en hun essentiële betrokkenheid bij de regulatie van oxidatieve stress-onevenwichtigheid, niet alleen in de lever maar ook in perifere weefsels zoals vetweefsel en vasculaire weefsels, lijkt het redelijk om de mogelijke betrokkenheid van de TI te onderzoeken. in deze context. De beoordeling van itaconaatsynthese, IRG-1-expressie evenals de synthese en de biologische respons afgeleid van de activiteit van de bovengenoemde transcriptiefactoren en/of het onderzoeken van het effect afgeleid van de toediening, in diermodellen, van het itaconate vertegenwoordigen enkele belangrijke onderzoekspunten die wachten om te worden aangepakt.