Immunostimulerende activiteit van water-extraheerbare polysachariden uit Cistanche Deserticola als plantenadjuvans in vitro en in vivo

Invoering

Vaccins zijn belangrijk voor het beheersen of voorkomen van ziekten. Nieuw gegenereerde en momenteel in ontwikkeling zijnde vaccins zijn zeer gezuiverde recombinante antigenen met een hogere veiligheid, maar gezuiverde antigenen kunnen geen bevredigende immuunrespons stimuleren vergeleken met verzwakte of geïnactiveerde pathogeenpreparaten. Met behulp van adjuvantia kunnen vaccins aanhoudende immuunreacties opwekken [1,2]. In beide vaccins zijn nieuwe krachtige adjuvantia een algemeen onderwerp van zorgontwikkeling en de menselijke gezondheid. Tot op heden zijn verschillende adjuvantia geïdentificeerd en uitgebreid bestudeerd. Deze adjuvantia geven vaccins verschillende voordelen, waaronder het verminderen van de benodigde hoeveelheid antigenen, het minimaliseren van het aantal immunisaties dat nodig is voor normale immuunreacties, en het induceren van snellere, bredere en sterkere immuunreacties.3–5]. Hoewel er veel krachtige adjuvantia zijn ontwikkeld, zoals lipopolysacharide (LPS) en Freund's complete adjuvans (FCA), worden ze vanwege hun toxiciteit niet op grote schaal toegepast. Daarom zijn slechts enkele adjuvantia, zoals Aluin, goedgekeurd voor klinisch gebruik [6]. Over het geheel genomen moeten effectievere en veiligere adjuvantia worden ontwikkeld om betere profylactische en therapeutische vaccins tegen infectieuze en niet-infectieuze ziekten te bevorderen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE IMMUNITEIT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Veiligheid is een belangrijke overwegingsfactor bij de ontwikkeling van adjuvantia. Chinese kruidachtige bestanddelen omvatten voedingsstoffen en belangrijke actieve composieten, zoals fenolverbindingen en polysachariden, die kunnen werken als krachtige immunostimulantia [7-9]. Onder hen zijn polysachariden uit traditionele Chinese kruiden op grote schaal onderzocht vanwege hun immunostimulerende activiteiten en lage toxiciteit. Inuline is bijvoorbeeld een immuunadjuvans zonder de toxiciteit van andere adjuvantia zoals FCA. AdvaxTM delta-inuline-adjuvans heeft ook met succes de immunogeniciteit van het vaccin verbeterd [10,11]. Astragalus, ook bekend als Huangqi in het Chinees en Radix Astragali in het Latijn, is wijd verspreid over de hele wereld. Polysacharide is een van de belangrijkste actieve ingrediënten die verantwoordelijk is voor de immuunmodulerende activiteit. Experimentele studies hebben aangetoond dat Astragalus-polysacharide zowel in vitro als in vivo sterke immunomodulerende effecten bezat [12, 13]. Polysachariden van Lycium barbarum als vaccinadjuvans vertoonden ook goede verbeteringen en stimulerende effecten [14, 15]. Deze onderzoeken suggereerden dat Chinese kruidenpolysachariden ideale kandidaten waren voor de ontwikkeling van adjuvans.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, "Rou Cong Rong" in het Chinees) is een waardevol traditioneel Chinees kruid en wordt algemeen beschouwd als "Ginseng van de woestijnen" vanwege zijn superieure tonische effecten. Het wordt gedistribueerd in droge of semi-aride gebieden in Xinjiang. In China wordt de gedroogde, vlezige stengel al honderden jaren als versterkend voedsel gebruikt [16, 17]. Jarenlang werd gekookte CD gebruikt als tonisch voedsel om door overbelasting veroorzaakte beperkingen te behandelen, wat erop wijst dat het veilig is voor orale toediening. Deze plant wordt algemeen beschouwd vanwege zijn brede geneeskrachtige functies. Recente fytochemische en farmacologische onderzoeken hebben aangetoond dat polysachariden de belangrijkste biologisch actieve componenten waren en verschillende biologische effecten hadden, waaronderimmunomodulerende activiteit, antioxiderende werking en ontstekingsremmende effecten[18–21]. De immuunversterkende activiteit van water-extraheerbare polysachariden uit C. deserticola in Xinjiang werd echter zelden gerapporteerd.

Het is algemeen bekend dat DC's belangrijke antigeenpresenterende cellen (APC's) zijn die signalen leveren die nodig zijn voor het initiëren van immuunreacties en het moduleren van aangeboren en adaptieve cellen. Sommige adjuvantia die de opname van antigeen door DC's verbeteren, kunnen co-stimulerende of MHC-moleculen verhogenverbeteren de immuniteit. Wanneer de rijping van DC’s begint, worden er meer co-stimulerende moleculen en cytokines geproduceerd en vertonen DC’s verschillende fenotypes [22, 23].

In deze studie hebben we eerst onderzocht of WPCD de activering van DC's via de TLR4-signaleringsroute in vivo zou kunnen bevorderen. Omdat DC's de link vormden tussen aangeboren en adaptieve immuunresponsen, veronderstelden we dat DC's-activatie gestimuleerd door WPCD de uitkomst van adaptieve immuniteit zou beïnvloeden. We onderzochten de specifieke immuunrespons op ovalbumine (OVA) bij muizen die werden behandeld met WPCD, inclusief titers van IgG-, IgG1- en IgG2a-subklasse, T- en B-proliferatie en de productie van cytokine. We onderzochten of WPCD-behandeling de activiteit van DC's en Treg-cellen in de milt van deze muizen zou verhogen. Onze bevindingen bewezen de potentiële immuunmodulerende activiteit van natuurlijke polysachariden van C. deserticola en breidden de toepassingsmogelijkheden ervan uit.

materialen en methodes

Dieren

Acht tot tien weken oude vrouwelijke C57BL/6-, BALB/c- of ICR-muizen werden gekocht bij het First Hospital van de Xinjiang Medical University (Urimuqi, Xinjiang, China). De muizen werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden volgens de richtlijnen van het Animal Care and Use Committee (ACUC) van de Xinjiang University for Animal Health and Wellbeing. De dierproefprocedures waren goedgekeurd door de AUCC van de Xinjiang Universiteit.

Extractie van waterige extracten

C. deserticola is een fabriek in de provincie Xinjiang in China. Het ruwe polysacharide werd verkregen door waterextractie en ethanolprecipitatie. In het kort werd 100 g gedroogde C. deserticola vermalen tot poeder en vervolgens gefilterd. Het poeder werd herhaaldelijk bij kamertemperatuur onder terugvloeiing gekookt met petroleumether en vervolgens gedurende 1 uur met watervrije ethanol onder terugvloeikoeling gekookt om gekleurde ingrediënten en lipiden te verwijderen. De residuen werden driemaal geëxtraheerd met kokend water en de extracten werden samengevoegd, gedurende 10 minuten bij 4000 rpm gecentrifugeerd en gedurende 4 uur bij 60°C gerefluxt. Vier keer het volume van 95% ethanol werd aan de oplossing toegevoegd om ruwe polysachariden neer te slaan. De ruwe polysachariden werden opnieuw opgelost in gedestilleerd water en behandeld met Sevage-reagens om eiwitten te verwijderen. Extracten werden opgelost in PBS en gesteriliseerd door een filter van 0,22- μm. Tenslotte bedroeg het totale suikergehalte van WPCD 59,58%, zoals blijkt uit de fenol-zwavelzuuranalyse [24].

Generatie van DC's

BM-DC's werden gegenereerd volgens de eerder beschreven methode met kleine aanpassingen [25]. Beenmerg-DC's van C57BL/6-muizen werden uitgespoeld met RPMI-1640 compleet medium (Gibco) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (Hyclone). De verzamelde cellen werden opnieuw gesuspendeerd in RPMI-1640 medium met 50 μM -mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO) en 20 ng/ml murine GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) en geïncubeerd bij 37˚ C in 5% CO2-atmosfeer. De helft van het kweekmedium werd elke 1 à 2 dagen vervangen door vers medium dat GM-CSF bevatte. Cellen werden op dag 6 verzameld, gedurende 24 uur behandeld met verschillende doses WPCD en LPS (100 ng / ml) (Sigma, St. Louis, MO) en vervolgens beoordeeld met behulp van flowcytometrie.

Detectie van rijping van DC's en T-celactivering in vitro

Het in vitro rijpingseffect van WPCD op BM-DC's werd geëvalueerd op basis van fenotypische analyseresultaten door FAC's. Op dag 7 werden BM-DC's van C57BL/6 geïnduceerd in de aanwezigheid van GM-CSF en vervolgens behandeld met verschillende concentraties WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0,1 en 0,2 mg/ml) gedurende 12 uur in drievoud. LPS (100 ng/ml) werd gebruikt als positieve controle. Nadat BM-DC's waren gewassen in PBS en Fc Block (BD Biosciences, CA) was gebruikt om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen, werden cellen gekleurd in PBS met behulp van de juiste FITC-, PE- of APC-geconjugeerde CD40, CD11c, CD. {23}}, CD80- en MHC-II-antilichamen (BD) gedurende 20 minuten bij 37˚C. De gekleurde cellen werden gedetecteerd door FAC's Calibur (BD). De data-analyse werd uitgevoerd met FlowJo-software (Tree Star).

In het DCs-rijpingsexperiment in vitro werden ook supernatanten van celkweken verzameld om IL-12 en TNF- te analyseren met behulp van cytokinetestkits (Boster, Wuhan, China) volgens de instructies van de fabrikant. De absorptie bij 450 nm werd gemeten met een ELISA-plaatlezer (Bio-Rad, VS). Cytokinehoeveelheden in de monsters werden berekend met standaardcurven van recombinante cytokinen volgens de lineaire regressiemethode.

Om hun allogene stimulerende activiteit te testen, werd het experiment van gemengde lymfocytreactie (MLR) uitgevoerd volgens de vorige methode [26] door middel van MTT (Sigma, St. Louis, MO) assay. In het kort werden BM-DC's van C57BL/6-muizen die als stimulatorcellen werden gebruikt, op dag 7 teruggevonden in RPMI-1640 medium plus GM-CSF en behandeld met verschillende concentraties WPCD gedurende 12 uur bij 37˚C. De cellen werden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in RPMI-1640 medium voordat ze in de 24-putjesplaat werden uitgeplaat. Cellen die reageren op de suspensie van enkelvoudige plenocyten werden geïsoleerd uit BALB/c-muizen. BM-DC's werden gemengd met splenocyten volgens de verhoudingen van 1:5 en 1:10. De cellen werden in triplo gedurende drie dagen bij 37°C in een atmosfeer van 5% CO2 gekweekt. LPS-behandeling werd gebruikt als positieve controle. Vervolgens werden culturen toegevoegd met 20 μl MTT voor de laatste kweek van 4- uur. De absorpties bij de meetgolflengte (490 nm) en de referentiegolflengte (650 nm) werden gemeten voor T-celproliferatieanalyse. Alle monsters werden gemeten tegen een achtergrondcontrole.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN UW IMMUUNSYSTEEM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Behandeling met TLR4-remmer in vitro

BM-DC's werden gedurende 1 uur voorbehandeld met 5 μM TAK-242 (remmer van TLR4, Medchemexpress Inc. VS) en vervolgens gedurende 12 uur samen gekweekt met verschillende concentraties WPCD (100 en 200 ug / ml). in aanwezigheid of afwezigheid van Golgi Stop in drievoud. In de positieve controle werd LPS toegevoegd. Cellen en supernatanten werden gedetecteerd door FAC's voor het analyseren van oppervlaktemarkers CD86 en CD40 en door ELISA voor het analyseren van respectievelijk cytokines TNF-a en IL-12.

Immunisatieprotocol

Acute toxiciteitstest

Bij de orale acute toxiciteitstest in dit onderzoek werden 40 gezonde volwassen ICR-muizen gebruikt. ICR-muizen werden vóór de dosering gevast (voedsel maar geen water gedurende de nacht). WPCD werd oraal toegediend in doses van respectievelijk 0, 50, 500 of 5000 mg/kg lichaamsgewicht aan elk dier gedurende 7 dagen. Met zoutoplossing behandelde en met aluin behandelde muizen werden opgenomen in de controlegroep. De dieren werden gedurende 14 opeenvolgende dagen dagelijks geobserveerd. De muizen werden individueel geobserveerd om de mortaliteit en klinische symptomen te registreren. Bovendien werden tijdens het experiment het lichaamsgewicht en de voedsel- en waterconsumptie gemeten. Op dag 14 werd de milt- of thymusindex berekend als (milt- of thymusgewicht/lichaamsgewicht) x 10.

Detectie van WPCD-immunomodulerende activiteit in vivo.

Om te onderzoeken of WPCD immunomodulerende activiteit had, werd ovalbumine (OVA) (Sigma) gebruikt als het modelantigeen en werden vrouwelijke ICR-muizen willekeurig verdeeld in 7 groepen (negatieve controlegroep (0,9% NaCl en WPCD 400 ug ) en de positieve controle (Aluin 200 ug met OVA)). De muizen kregen tweemaal subcutaan 10 µg OVA alleen of WPCD met OVA toegediend, afhankelijk van de dosis van 20, 100 of 400 µg met een interval van 2-weken. Bloedmonsters en milt werden verkregen na de boostervaccinatie om IgG-titers, de IgG-subklassen, proliferatie en cytokine van splenocyten, DC-oppervlaktemarkers en Treg-frequentie te detecteren.

Detectie van OVA-specifieke antilichamen

OVA-specifieke IgG-titers en subklassen werden onderzocht met ELISA volgens de voorgaande methode [27]. ELISA-platen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) werden overnacht gecoat en vervolgens geblokkeerd. Serummonsters werden serieel verdund voor IgG-titeranalyse of de detectie van IgG1 en IgG2a (Southern Biotech, Inc.). De platen werden vervolgens gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd met PBST dat HRP-geconjugeerd anti-muis IgG, IgG1 en IgG2a bevatte. De colorimetrische reactie werd ontwikkeld met tetramethylbenzidine (TMB) en vervolgens werden de absorpties bij 450 nm/655 nm gemeten en uitgedrukt als eenheden voor optische dichtheid (OD).

Detectie van proliferatie van splenocyten en cytokine

De proliferatie van splenocyten werd bepaald met de MTT-test. Op dag 21 na de eerste vaccinatie werd een enkele splenocytensuspensie verkregen. Cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium in platen met 96-putjes volgens de concentratie van 1 x 106 cellen/putje in drievoud. De kweken werden gedurende 48 uur bij 37 °C gestimuleerd met OVA (eindconcentratie 10 ug/ml), ConA (eindconcentratie 5 ug/ml) (Sigma, St. Louis, MO) en LPS (eindconcentratie 100 ng/ml). . Cellen werden 48 uur gekweekt en 20 μl (5 mg / ml) MTT (Sigma, St. Louis, MO) werd aan elk putje toegevoegd en nog eens 4 uur geïncubeerd. Na het toevoegen van 50 μl DMSO aan elk putje om de kleurontwikkeling te stoppen (Sigma), werden de platen afgelezen bij 570 nm door een microtiterplaatlezer (BioRad, CA, VS). De proliferatie van splenocyten werd uitgedrukt als stimulatie-index (SI), wat de OD570 nm-verhouding was van een gestimuleerd putje tot een niet-gestimuleerd putje.

De opbrengsten aan IL-4 en IFN- in T-cellen werden gemeten door intracellulaire cytokinekleuring volgens een gepubliceerd protocol met kleine aanpassingen [27, 28]. Op dag 21 na de eerste vaccinatie werd een enkelvoudige splenocytsuspensie bereid. Na lyse van rode bloedcellen werd de splenocyt (2 x 106 cellen/ml) geïncubeerd met OVA (10 ug/ml) voor 4- uur stimulatie en werd Golgi stop (BD) toegevoegd voor 12 uur incubatie, PMA als positief controle. Cellen werden verzameld, gewassen met PBS, gekleurd met CD4-FITC/CD8-FITC, en gefixeerd en gepermeabiliseerd met Cytofix/Cytoperm-kit (BD) volgens de instructies van de fabrikant. Intracellulaire cytokinekleuring werd uitgevoerd met de juiste concentratie IL-4-PE- of IFN- -APC-antilichamen bij 4˚C gedurende 20 minuten. Gekleurde cellen werden gedetecteerd door FAC's. De data-analyse werd uitgevoerd in de FlowJo.

Beoordeling van DC-rijping en Treg-cellen in de milt

Voor de analyse van DC-rijping uit splenocyten bij muizen werd kleuring van het celoppervlak uitgevoerd met CD11c-PE-, CD40-FITC- en CD80-APC-antilichamen. Op dag 3 na de eerste vaccinatie werd een enkele splenocytsuspensie (1 x 106 cellen/ml) verkregen en werden de cellen onderworpen aan dubbele kleuring. De fluorescentie-intensiteiten werden gemeten door de FACs Calibur en de gemeten gegevens werden geanalyseerd door FlowJo.

Om te observeren of WPCD de frequentie van CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-cellen naar beneden zou kunnen reguleren. Op dag 7 na de tweede vaccinatie werd een enkelvoudige splenocytsuspensie bereid. De splenocyt (2 x 106 cellen/ml) werd onderworpen aan kleuring van het celoppervlak met CD4-APC-antilichaam, gevolgd door nucleaire cytokinekleuring met de juiste CD25-FITC- en Foxp3-PE-antilichamen met de regulerende T-celkleuringskit voor muizen (eBiosciences) volgens de instructies van de fabrikant. De frequentie van CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-cellen werd getest op FAC's. De data-analyse werd uitgevoerd in de FlowJo.

statistische analyse

Er werden one-way variantieanalyse (ANOVA) tests (Tukey's Multiple-Comparison Test) uitgevoerd om de verschillen tussen meerdere experimentele groepen te analyseren. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ±SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Resultaten WPCD bevorderde de rijping en functie van BM-DC's in vitro

Adaptieve immuniteit wordt bepaald door de activering van DC’s, inclusief de soorten co-stimulerende moleculen en cytokines [29, 30]. In eerste instantie onderzochten we of WPCD de expressie van co-stimulerende moleculen zou kunnen bevorderen. Volgens verschillende doses WPCD, BM-DC's

van C57BL/6 werden toegediend. De expressieniveaus van CD11c, CD86, CD80, CD40 en MHC-II in cellen werden geanalyseerd (Fig. 1). De cellen gepoort met SSC en FSC toonden aan dat de behandeling met verschillende doses WPCD de morfologie van BM-DC's niet veranderde (gegevens niet getoond). De expressieniveaus van CD86, CD80 en CD40 werden op een dosisafhankelijke manier significant opgereguleerd in vergelijking met de onbehandelde groep en bereikten het plateau onder de dosis van 20 ug/ml WPCD, maar het verschil was niet significant vergeleken met de LPS-groep (Fig. 1A–1C). Het expressieniveau van MHC-II was significant verhoogd tot de maximale waarde onder de dosis van 50 ug/ml (figuur 1D). De analyseresultaten van cellulaire oppervlaktemarkers toonden aan dat DC's behandeld met LPS of WPCD significant verhoogde expressieniveaus van CD86, CD80, CD40 en MHC-II vertoonden en fenotypische rijping bevorderden.

Sommige adjuvantia zouden de co-stimulerende moleculen op DCs kunnen verhogen of direct de uitscheiding van cytokinen kunnen induceren. IL-12 en TNF- zijn de belangrijkste cytokinen voor het activeren van de Th1-immuunrespons. We analyseerden de opbrengsten aan cytokine in BM-DC's na WPCD-behandeling. Nadat BM-DC's gedurende 12 uur waren behandeld met verschillende inhoud van WPCD, werd het supernatant verzameld om de inhoud van IL-12 en TNF- te detecteren met een ELISA-kit. WPCD zou dosisafhankelijk de productie van IL-12 (Fig. 2A) en TNF- (Fig. 2B) kunnen verhogen. De resultaten toonden aan dat WPCD de functionele rijping van DC's zou kunnen induceren.

Bij een immuunrespons is het noodzakelijk om DC's functioneel te activeren. Vervolgens werd het hogere niveau van allogene T-celproliferatie geïnduceerd door volledig volwassen DC's. Daarom werd de functionele respons van DC's op WPCD onderzocht door MLR. Het allostimulerende vermogen van door WPCD geïnduceerde DC's, vergelijkbaar met LPS, werd dramatisch verbeterd op een dosisafhankelijke manier bij de aangegeven verhouding (Fig. 2C en 2D). De resultaten gaven aan dat WPCD de antigeenpresentatie verbeterde en de T-celrespons door MLR in vitro optimaliseerde.

WPCD bevorderde de rijping van DC's via de TLR4-route

Uit de bovenstaande resultaten zou kunnen worden afgeleid dat door WPCD geactiveerde BM-DC's vergelijkbare DC-oppervlaktemolecuul-expressies aangaven als LPS (een TLR4-ligand). We veronderstelden daarom dat BM-DC's worden geactiveerd door WPCD via de TLR4-route. Nadat BM-DC's waren voorbehandeld met TAK-242 (TLR4-remmer) en gedurende 12 uur samen met WPCD en LPS waren gekweekt, vond de expressie van CD40, CD86, TNF-a of IL{{12 }} werd gedetecteerd door FAC's of ELISA. Zoals getoond in Fig. 3A en 3B resulteerde de TAK-242-behandeling in de aanzienlijk neerwaarts gereguleerde expressies van CD40 en CD86 geïnduceerd door LPS of WPCD, en cytokineproductie van IL-12 of TNF-a was ook significant verlaagd (Fig. 3C en 3D). De resultaten gaven aan dat WPCD DC-rijping via de TLR4-route zou kunnen activeren.

WPCD verbeterde de humorale en cellulaire immuniteit

Ter vergelijking evalueerden we de effecten van WPCD op het opwekken van humorale immuunrespons bij met OVA geïmmuniseerde muizen. Vóór vaccinatie en op dagen 14, 21,

35 en 49 na de eerste vaccinatie werd bloed verzameld om IgG-titer en serum van IgG-subklassen met ELISA te detecteren. De IgG-antilichaamrespons op OVA nam toe met de toename van de dosis WPCD-toediening (100 en 400 ug) op een dosisafhankelijke manier (Fig. 4). De optimale concentratie was 100 µg/ml WPCD en verhoogde de IgG-responsen met twee keer vergeleken met de OVA alleen op dagen 21, 35 en 49 (Fig. 4A). Aanzienlijke stijgingen in OVA-specifieke IgG1- en IgG2a-antilichaamniveaus onder 20 en 100 ug WPCD-toediening werden verkregen vergeleken met de OVA-groep in serum op dag 35 (Fig. 4B). Ondertussen bevorderde Alum alleen de expressieniveaus van OVA-specifieke IgG- en IgG1-antilichamen in de geïmmuniseerde muizen. WPCD alleen veroorzaakte geen OVA-specifieke antilichamen. De bovenstaande resultaten gaven aan dat WPCD hogere antilichaamtiters en meer gebalanceerde Th1/Th2-reacties genereerde dan Aluin.

Proliferatie van splenocyten is een andere indicator van cellulaire immuniteit. ConA stimuleert T-cellen en LPS stimuleert de proliferatie van B-cellen. Op dag 21 na de eerste vaccinatie werd een enkele splenocytsuspensie verkregen en respectievelijk gestimuleerd met OVA (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/ml) peptide, ConA (5 ug/ml) en LPS ( 5 µg/ml) gedurende 48 uur. Vervolgens werd de proliferatie van T-cellen gemeten met de MTT-methode. WPCD kon de door OVA-antigeen, Con A-mitogeen en LPS-mitogeen gestimuleerde splenocytproliferatie aanzienlijk bevorderen bij de muizen die waren geïmmuniseerd met OVA en WPCD (Fig. 5) en de optimale concentratie van WPCD was 100 ug/ml. Deze gegevens gaven aan dat WPCD als vaccinadjuvans bij met OVA geïmmuniseerde muizen effectiever de activering van T-cellen en B-cellen zou kunnen induceren dan Aluin.

Alle geteste WCPD-adjuvantia geformuleerd met OVA-vaccins genereerden een even sterke humorale en cellulaire immuniteit (Fig. 4 en 5). Op basis van deze gegevens hebben we, om de WPCD-invloeden op de OVA-specifieke T-helper (Th)-celrespons verder te evalueren, de cytokine-expressies in CD8+ en CD4+ T-cellen verder geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (Fig. 6). . Op dag 21 na de eerste vaccinatie werd een enkele splenocyt van muizen geïsoleerd en vervolgens samen met de OVA (10 ug/ml) gekweekt. De IL-4-opbrengst in CD4+ T-cellen in de groep waaraan 100 ug OVA/WPCD was toegediend, was significant hoger dan die in de OVA/Alum-groep en de OVA-groep en vergelijkbaar met die in PMA (Fig. 6A). Bovendien was de IFN-opbrengst in CD8+ en CD4+ T-cellen ook significant verhoogd bij de muizen waaraan OVA/WPCD (20, 100 en 400 µg) was toegediend (Fig. 6B en 6C). Vergeleken met Aluin-adjuvans vertoonde WPCD een beter vermogen om IL-4- en IFN-secreties uit T-cellen te induceren.

WPCD-gestimuleerde rijping van DC's en verlaagde Treg-frequentie in vivo DC's worden erkend als de krachtigste APC's die betrokken zijn bij het initiëren van primaire immuunreacties. Zo onderzochten we op dag 3 na de eerste vaccinatie ook de effecten van WPCD op CD40 en CD80 op DC's in de milt bij muizen (Fig. 7A en 7B). De muizen in de 100-ug OVA/WPCD-groep produceerden significant hogere niveaus van CD40 en CD80 op DC's dan die in de OVA/Alum-groep. Deze gegevens toonden aan dat WPCD DC's kon activeren en DC-rijping bij muizen kon induceren. Treg-cellen kunnen de tolerantie en immuunreacties in evenwicht brengen. Om verder te onderzoeken hoe WPCD de immuunrespons moduleerde, werden Treg-cellen in de milt bij muizen gekleurd met een regulerende T-celkleuringskit voor muizen. Op dag 21 na de eerste vaccinatie werd een verminderde frequentie van CD25+ Foxp3+ Treg-cellen waargenomen in het totale aantal CD4+ T-cellen (Figuur 7C). Vergeleken met de OVA- en OVA/Alum-groepen vertoonde de WPCD-groep een aanzienlijk verminderde Treg-frequentie.

Veiligheidsevaluatie van WPCD bij muizen

Om de orale acute toxiciteit te schatten, hebben we de acute toxiciteitstest uitgevoerd. De muizen die oraal 5000 mg/kg lichaamsgewicht toegediend kregen, vertoonden geen abnormaal gedrag of bijwerkingen en er werd geen sterfte gevonden in de toxiciteitsevaluatietest. Er werd geen significant verschil in lichaamsgewichtstoename, Thymus-index en Milt-index geregistreerd bij verschillende groepen muizen waaraan verschillende doses WPCD werden toegediend, en er was geen significant verschil (Tabel 1). Na 14 dagen werd geen sterfte waargenomen. Daarom was de LD50-waarde van WPCD meer dan 5000 mg per kg lichaamsgewicht.

Om te testen of WPCD negatieve effecten had op de groei van de muizen, werd vóór en na subcutane vaccinatie respectievelijk het lichaamsgewicht van elke muis bepaald (Tabel 2). Bij de daaropvolgende observatie van de muizen werden geen bijwerkingen of abnormaal gedrag waargenomen. Bovendien vertoonde het lichaamsgewicht van de muizen waaraan WPCD was toegediend en de muizen waaraan een zoutoplossing of OVA/Aluin was toegediend geen significant verschil. Deze observatieresultaten toonden aan dat de toediening van WPCD veilig was.

Discussie

Adjuvantia zijn sleutelcomponenten in vaccins [31]. Dankzij de vooruitgang op het gebied van genomica en proteomica worden steeds meer recombinanten en synthetische vaccinmoleculen geïdentificeerd. Daarom zijn meer adjuvantia en formuleringen vereist. Sommige krachtige adjuvantia houden doorgaans verband met verhoogde toxiciteit, bijvoorbeeld FCA. Daarom is het noodzakelijk om een ​​veilige formulering te vinden die verschillende synergetische componenten bevat die uiteindelijk de gewenste immuunrespons teweegbrengen.Polysachariden uit Chinese kruiden zijn niet giftigen vertonen geen significante bijwerkingen [32,28]. Voor een bepaald vaccin is een veilig adjuvans nodig.

Cistanche deserticola is een belangrijk versterkend kruid en komt wijdverspreid voor in droge gebieden en warme woestijnen in het noordwesten van China. Cistanche deserticola maakt zich grote zorgen vanwege de bioactiviteiten ervan, waaronder immunomodulerende, antioxidatieve, antibacteriële en antitumorale effecten [20,21]. Er is enige vooruitgang geboekt bij de structurele karakterisering en immunologische activiteit van Cistanche deserticola, dat een goede kandidaat is voor de ontwikkeling van adjuvantia. We hebben experimenteel de adjuvante effecten en het mechanisme van WPCD in vitro en in vivo geëvalueerd. Subcutane toediening van WPCD bevorderde op significante wijze de humorale en cellulaire immuunresponsen door de serumantilichamen en de proliferatie van lymfocyten te verhogen, de expressie van cytokines te verbeteren, de DC-rijping opwaarts te reguleren en de frequentie van CD neerwaarts te reguleren4+ CD{{5} } Foxp3+ Treg-cellen.

DC's zijn belangrijke APC's voor het primen van naïeve T-cellen. De activering van DC's is belangrijk voor adjuvantia. DC's, vooral DC's afgeleid van muizenmerg, worden vaak gebruikt om adjuvantia en vaccins te evalueren. Flowcytometrie kan de cellen die zijn geactiveerd na het vangen van een antigeen onderscheiden van omliggende cellen. Bij FCM-analyse wordt de mate van aggregatie van gestimuleerd

cellen is een indirecte indicator voor het evalueren van de veiligheid van immunomodulatoren [3]. Gegevens over de activiteit van WPCD-adjuvans in DC's in vitro kunnen dus waardevolle informatie opleveren voor diermodellen. Op basis van het BM-DC-model werden de expressieniveaus van MHC-II, CD86, CD80 en CD40, cytokineproductie en allogene T-celproliferatie gedetecteerd in het optimale WPCD-concentratiebereik. De expressieniveaus van MHC-II, CD86, CD80 en CD40 werden opwaarts gereguleerd in BM-DC's en de opbrengsten van TNF-a en IL-12 werden dosisafhankelijk verhoogd. De allogene T-celproliferatie werd waargenomen. De morfologie van BM-DC's was niet veranderd. Door de activering van BM-DC's en de uitscheiding van inflammatoire cytokines in vitro te induceren, zou WPCD-adjuvans de hoeveelheid antigeen en het aantal APC's aanzienlijk kunnen verhogen en T-cellen kunnen stimuleren om IFN- uit te scheiden, wat bijdraagt ​​aan de versterking van de immuunmodulerende activiteit.

VerscheideneChinese kruidachtige polysacharidenzijn in staat het immuunsysteem te activeren en beschikken over uitstekende adjuvante eigenschappen door het stimuleren van DC-rijping via de TLR4-route [33,28]. We nemen dus aan dat TLR4 deelneemt aan de signaalroute van door WPCD geïnduceerde DC-rijping. Zoals verwacht resulteerden behandelingen met TLR4-remmers in een significante afname van TNF-a en IL-12. Bovendien belemmerde de remming van de TLR4-route ook de expressie van CD40 en CD80 op DCs, wat aangeeft dat de rijping van DCs afhankelijk was van TLR4. Daarom is het duidelijk dat TLR4 deelneemt aan de door WPCD geïnduceerde rijping van DC's.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE IMMUNITEIT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

De optimale dosis adjuvantia en vaccinformulering wordt in veel experimenten empirisch bepaald. Om de dosis-responsrelatie van WPCD-adjuvans en OVA-antigenen bij muizen te onderzoeken, hebben we verschillende WPCD-doses geselecteerd op basis van eerder gerapporteerde gegevens van BM-DC's in vitro om ICR-muizen tweemaal subcutaan toe te dienen. We ontdekten dat WPCD de opbrengst aan OVA-specifieke antilichamen aanzienlijk verhoogde en een gebalanceerde Th1/Th2-immuunrespons induceerde met een verhoging van de IgG1- en IgG2a-niveaus. Vooral het IgG2a-niveau was hoger dan dat van behandeling met Aluin in de optimale dosis. Daarom resulteerde WPCD in hogere niveaus van specifieke antilichamen en een hogere werkzaamheid bij de lagere injecties.

Nieuwe vaccins vereisen de inductie van sterke cellulaire reacties, waarbij antilichamen, T-helpercellen (Th) en cytotoxische T-lymfocyten (CTL's) betrokken zijn. Therapeutisch vaccin heeft tot doel sterkere T-celreacties te induceren. Het ideale adjuvans vergroot de potentie van het vaccin en bevordert de celgemedieerde immuniteit zonder toxische effecten te veroorzaken [34]. Van de observaties in geïmmuniseerde muismodellen leidde WPCD tot een toename van OVA-specifieke en niet-specifieke proliferatie van splenocyten vergeleken met Alum. Sommige adjuvantia verhogen de cytokines en het immuunsysteem. Saponinen kunnen bijvoorbeeld celgemedieerde immuunreacties stimuleren tegen een antigeen dat normaal gesproken alleen antilichamen induceert. We selecteerden IL-4 en IFN- als indicatoren om indirect de niveaus van immuniteiten bij muizen te evalueren. WPCD zou meer IL-4- en IFN-secreties kunnen induceren dan Aluin. Er werden dus sterke T-helper-celreacties en cytokinesecreties waargenomen als gevolg van WPCD-vaccinatie, wat suggereert dat WPCD lymfocyten efficiënter zou kunnen stimuleren om het Th1--type cytokine en het Th2--type cytokine uit te scheiden dan Aluin.

Adjuvantia die de antigeenpresentatie beïnvloeden, kunnen complexe immuunprocessen beïnvloeden. Treg-cellen kunnen Th1- en Th2-reacties moduleren [35]. Een geschikte dosis WPCD kan de rijping van DC's bij muizen bevorderen door de expressieniveaus van CD80 en CD40 te verhogen en het vermogen van OVA-antigeenpresentatie in de vroege immuunrespons te versterken. De experimentele resultaten van de DC-activering en de Treg-frequentie toonden aan dat WPCD de rijping van DC's induceerde en de Treg-frequentie in de milt bij muizen verlaagde. Deze resultaten bewezen dat WPCD de werkzaamheid van OVA-vaccins verhoogde door de targeting van antigeenpresenterende cellen te vergroten en T-celspecifieke activering te bevorderen.

Bij de ontwikkeling van adjuvantia is het moeilijk om selectief de juiste immuunrespons tegen de overeenkomstige infectie te induceren. Een geschikt adjuvans moet lage bijwerkingen en toxiciteit voor mens of dier hebben. Er moet dus rekening worden gehouden met de veiligheid van WPCD, inclusief bijwerkingen op de onmiddellijke en lange termijn. In deze studie onderzochten we de acute toxiciteit van WPCD en het negatieve effect van WPCD op de groeiprestaties van muizen gedurende 110 dagen. De resultaten van de acute toxiciteit van WPCD toonden aan dat lichaamsgewicht, thymusindex of miltindex geen significant verschil vertoonden. De LD50-waarde van WPCD was ruim 5000 mg per kg lichaamsgewicht. Tijdens de experimentele daaropvolgende observatie van de muizen werden geen bijwerkingen of abnormaal gedrag bij muizen gevonden. Deze resultaten gaven aan dat WPCD veilig was.

Concluderend vertoonde WPCD, een ruw polysacharide gewonnen uit de C. deserticola uit Xinjiang, in deze studie enkele eigenschappen van adjuvantia. WPCD versterkte bijvoorbeeld zowel de Th1- als de Th2-respons door DC's te activeren, de antilichaamresponsen te verhogen en de cytokineproductie te verbeteren. Bovendien hebben we het mechanisme van de werkzaamheid van WPCD onderzocht door de rijping en functie van DCs via de TLR4-route in vitro te analyseren. Bij de muizen die alleen met WPCD werden behandeld, werd geen duidelijke bijwerking waargenomen. Daarom bezat WPCD een hogere immuunstimulerende activiteit bij cellulaire en humorale immuunreacties. Hulpstoffen zijn een mengsel van verschillende verbindingen. Een mengsel van verschillende ruwe extracten kan grotere gunstige effecten hebben dan een enkel plantenextract. Het is noodzakelijk om WPCD-extracten systematisch te onderzoeken, hun werkzaamheid en veiligheid te testen en de mechanismen van hun effecten op te helderen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE IMMUNITEIT PHGS75% ECH 30% ACT 12%