In Silico Ontwerp van een nieuw polyvalent multi-subunit peptidevaccin dat gebruik maakt van kruisimmuniteit tegen menselijke viscerale en cutane leishmaniasis: een op immuno-informatica gebaseerde aanpak

Abstract

Context Leishmaniasis is een groep door vectoren overgedragen infectieziekten die worden veroorzaakt door meer dan 20 pathogene Leishmania-soorten die endemisch zijn in veel tropische en subtropische landen. De opkomst van resistente stammen, de nadelige bijwerkingen van anti-Leishmania-medicijnen en het ontbreken van een preventieve vaccinatiestrategie vormen een bedreiging voor de gevoelige bevolking. Onlangs hebben veel groepen onderzoekers het gebied van de omgekeerde vaccinologie benut om vaccins te ontwikkelen, waarbij de nadruk vooral lag op het induceren van immuniteit tegen viscerale of cutane leishmaniasis.

cistanche tubulosa – Ontstekingsremmend

MethodenDit huidige werk omvat het ophalen van twaalf experimenteel gevalideerde leishmanial antigene eiwitsequenties uit de UniProt-database, gevolgd door hun antigeniciteitsprofilering met behulp van ANTIGENpro- en Vaxijen 2.0-servers. MHC-bindende epitopen hiervoor werden voorspeld met behulp van zowel NetCTL 1.2- als SYFPEITHI-servers, terwijl epitopen voor B-cellen werden berekend met behulp van ABCpred- en BepiPred 2.0-servers. De gescreende epitopen met significant hogere scores werden gebruikt voor het ontwerpen van het vaccinconstruct met geschikte linkers en natuurlijke adjuvantia. De secundaire en tertiaire structuren van het synthetische peptide werden bepaald door respectievelijk conditionele willekeurige velden, ondiepe neurale netwerken en profiel-profiel threading-uitlijning met iteratieve structuurassemblagesimulaties. Het 3-D-vaccinmodel werd gevalideerd via CASP10-geteste verfijning en de MolProbity-webserver. Moleculair koppelen en simulatie van normale modusanalyse op meerdere schaalniveaus werden uitgevoerd om het beste vaccin-TLR-complex te analyseren. Ten slotte onthulden bevindingen uit computationele immuunsimulaties veelbelovende cellulaire en humorale immuunreacties, wat suggereert dat het gemanipuleerde chimere peptide een potentieel breedspectrumvaccin is tegen viscerale en cutane leishmaniasis.

cistanche voordelen voor mannen versterken het immuunsysteem

Trefwoorden Leishmaniasis · Omgekeerde vaccinologie · TLR · Multi-epitoop vaccin · Moleculair dynamische simulatie · Homologiemodellering

Invoering

Leishmaniasis is een groep parasitaire ziekten die worden veroorzaakt door verschillende leden van het geslacht Leishmania, een dimorf intracellulair parasitair protozoa [1]. Leishmaniasis treft de meeste bevolkingsgroepen uit de lage sociaal-economische status van tropische en subtropische landen over de hele wereld [2]. Het is een door vectoren overgedragen ziekte en de parasieten worden overgedragen door het bijten van de geïnfecteerde vrouwelijke phlebotomine-zandvliegen (WHO, 2019). Volgens de laatste rapporten van de Wereldgezondheidsorganisatie vinden er jaarlijks 700, 000 tot 1 miljoen nieuwe gevallen en zo'n 26,000 tot 65, 000 sterfgevallen plaats (WHO, 2019). In Oost-Afrika komen regelmatig uitbraken van viscerale leishmaniasis voor. Het oostelijke Middellandse Zeegebied is verantwoordelijk voor 70% van de gevallen van cutane leishmaniasis wereldwijd (WHO, 2019). In 2017 vonden 20.792 van de 22.145 (94%) nieuwe gevallen die aan de WHO werden gemeld, plaats in zeven landen: Brazilië, Ethiopië, India, Kenia, Somalië, Zuid-Soedan en Soedan (WHO, 2017). Vanwege het alarmerende scenario moeten ook in ons land de maatregelen voor het beheersen en uitroeien van de ziekte worden onderstreept. Leishmaniasis heeft een verscheidenheid aan klinische manifestaties en er zijn drie primaire vormen van de ziekte: visceraal (ook bekend als kala-azar en de meest ernstige vorm van de ziekte), cutaan (de meest voorkomende) en mucocutaan (WHO, 2019). . Bewijs van zelfgenezing in enkele gevallen van cutane leishmaniasis (CL) en de daaruit voortvloeiende immuniteit tegen herinfectie leidt tot de mogelijke reikwijdte van vaccinatie als een haalbare methode om leishmaniasis gedurende de periode onder controle te houden [3]. Tot op heden is er echter geen goedgekeurd vaccin beschikbaar tegen menselijke leishmaniasis. Hoewel een aantal potentiële kandidaat-vaccins de klinische proeffase hebben doorlopen, bevinden vele zich nog in de vroege onderzoeks- en ontwikkelingsfase [4]. De ontwikkeling van peptidevaccins is een overheersend en veelbelovend onderzoeksgebied op dit gebied. In tegenstelling tot hele levende of verzwakte parasieten of hun op subeenheden gebaseerde vaccins, hebben synthetische peptiden verschillende voordelen, waaronder de afwezigheid van potentieel schadelijke materialen, een lagere antigeencomplexiteit, goede stabiliteit en lage kosten om op te schalen [1, 5]. Het ontwikkelen van nieuwe vaccins vereist diepere inzichten in immunologie, moleculaire biologie en chemische technologie. Daarom werken wetenschappers in al deze arena’s hand in hand aan het ontwerpen en produceren van veilige, effectieve vaccins [6]. Een ideaal vaccin tegen leishmaniasis zou langdurige immuniteit en een evenwichtige TH-1 en TH-2-gemedieerde immuunrespons moeten opwekken [4, 7]. Op immuno-informatica gebaseerde benadering voor het ontwerpen van een dergelijk nieuw kandidaat-vaccin is een nieuwere strategie die voornamelijk gebruik maakt van computationele hulpmiddelen om binnen korte tijd een structureel stabiel en immunogeen multi-subunit peptidevaccin te voorspellen. Eiwitten waarvan in eerdere immunologische onderzoeken met experimentele diermodellen of andere in silico-analyses voornamelijk werd gevonden dat ze de vereiste immunogene kenmerken hadden voor het verlenen van immuniteit tegen de ziekte, waren de best mogelijke epitoopkandidaten [1, 8-10]. Van de onderzochte eiwitten is het LACK-eiwit (Leishmania-activated C-kinase antigen) een sterk geconserveerd eiwit onder alle Leishmania-soorten, en het wordt beschouwd als een levensvatbare vaccinkandidaat tegen menselijke leishmaniasis [11]. Het is bewezen dat het een belangrijk doelwit is van de immuunrespons bij gevoelige BAL b/c-muizen [12]. KMP-11 (kinetoplastide-membraaneiwit-11) is aanwezig in alle kinetoplastide-protozoa en wordt ook beschouwd als een potentiële vaccinkandidaat waarvan is aangetoond dat het de IL-10-niveaus in muismodellen verhoogt, wat wijst op het immunogene potentieel ervan [13]. Leishmanolysine, of GP63, is een oppervlakteproteïnase dat is gepostuleerd als een virulentiefactor die betrokken is bij de directe interactie van de parasiet met de gastheermacrofaagreceptor [14]. De membraaneiwitten LCR1 en GP46 blijken ook de productie van IFN-gamma te verhogen en worden daarom beschouwd als behulpzaam bij het ontwikkelen van een algemeen vaccin tegen Leishmania-infecties [5, 15]. Heat shock-eiwitten (HSP's) zijn sterk geconserveerde moleculen die zeer immunogeen zijn voor het induceren van zowel MHC-I- als MHCII-routes van adaptieve immuniteit en waarvan wordt aangenomen dat ze een relevante rol spelen bij de ontwikkeling van vaccins tegen infectieuze leishmaniasis [16]. Leishmania hydrofiel geacyleerd oppervlakte-eiwit-B (HASP-B) komt alleen tot expressie in infectieuze parasieten, wat een rol suggereert in de virulentie van de parasiet en daarom een ​​potentiële kandidaat-vaccin [17]. Kinetoplastide parafagellar rod (PFR)-eiwitten zijn ook van therapeutisch en profylactisch belang vanwege hun beperkte evolutionaire distributie, organisatie van hoge orde en hoge immunogeniciteit [18]. Op dezelfde manier fungeren cysteïneproteasen en proteofosfoglycanen ook als essentiële virulentiefactoren voor de parasieten in zoogdiergastheren en zijn ze aantrekkelijke medicijndoelen voor leishmaniasis [19-21]. Bovendien werd bèta-tubuline-eiwit ook eerder gekarakteriseerd als een T-celstimulerend antigeen van Leishmania, hoewel de werkzaamheid ervan als vaccinkandidaat nog niet is uitgeprobeerd [22]. Bèta-tubuline van L. donovani wordt ook beschouwd als een potentieel geneesmiddeldoelwit tegen viscerale leishmaniasis [23]. Ten slotte is aangetoond dat het translatiefactoreiwit eIF5A van L. braziliensis heterologe bescherming tegen leishmaniasis bij dieren induceert wanneer het wordt toegediend als een vaccin in combinatie met een ander recombinant eiwit. Het verhoogt de uitscheiding van parasietspecifieke cytokines bij gevaccineerde dieren. eIF5A-eiwit is ook geconserveerd in alle eukaryoten [24]. Eerder hebben Khatoon et al. beschreef een op immuno-informatica gebaseerde aanpak om een ​​peptidevaccin met meerdere subeenheden tegen viscerale leishmaniasis (VL) te ontwerpen door de secretoire eiwitten van L. donovani te onderzoeken [6]. Hier hebben we verschillende leishmanial-antigenen geselecteerd voor verschillende infectieuze soorten van de parasiet. Tegelijkertijd zijn al deze eiwitten al geïdentificeerd (hetzij door in vitro dierstudies, hetzij door gebruik te maken van computerhulpmiddelen) om een ​​immuunrespons op te wekken, waardoor beschermende immuniteit wordt veroorzaakt. De geselecteerde eiwitsequenties behoorden tot een van de vijf pathogene soorten van Leishmania, namelijk Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi en Leishmania amazons, waaronder L. donovani de belangrijkste parasiet is die viscerale leishmaniasis (VL) veroorzaakt, terwijl de anderen zijn primair verantwoordelijk voor het veroorzaken van cutane (CL) of mucocutane leishmaniasis (MCL). De grondgedachte achter de keuze voor zulke diverse soorten geconserveerde en immunogene eiwitten bij verschillende soorten Leishmania was het ontwerpen van een algemeen peptidevaccin dat breedspectrum-kruisimmuniteit zou verlenen tegen beide vormen van leishmaniasis (VL en CL) die vaak mensen treffen. .

Wat doet cistanchekruid – Anti-ontstekingsremmend

materialen en methodes

Selectie en terugwinning van antigene eiwitsequenties van Leishmania

De volledige aminozuursequenties van twaalf Leishmania-specifieke antigene eiwitten werden opgehaald uit de Uniprot (Universal Protein Resource) database (https://www.unipr ot.org/uniprot/) in FASTA-formaat (geraadpleegd op 21.{{16} }3.2022). Zoals eerder vermeld, werden al deze eiwitten gerapporteerd als immunogene, sterk geconserveerde en potentiële vaccinkandidaten, zoals gevonden in eerdere immunologische onderzoeken met diermodellen of computationele in silico-voorspellingsmethoden. De antigeniciteit van de geselecteerde eiwitten werd berekend door gebruik te maken van de ANTIGENpro-server (//scratch.proteomics.ics.uci.edu/) die de antigeniciteit van een invoereiwitsequentie berekent door gebruik te maken van een op SVM gebaseerde tweetrapsclassificator die tienvoudig is gevalideerd kruisvalidatiebenadering [25]. De eiwitten werden vervolgens onderworpen aan signaalpeptideanalyse met behulp van de SignalP 4.1-server (SignalP-4.1-Services-DTU Health Tech) om onderscheid te maken tussen klassieke secretoire en niet-secretoire (transmembraan) eiwitten. Deze methode omvat een voorspelling van splitsingsplaatsen en een signaalpeptide/niet-signaalpeptide-voorspelling gebaseerd op een combinatie van verschillende kunstmatige neurale netwerken [26]. Vervolgens werden lokalisatievoorspellingen voor alle eiwitten uitgevoerd met behulp van DeepLoc (DeepLoc – 1.0 – Services – DTU Health Tech), een sjabloonvrij algoritme dat diepe neurale netwerken gebruikt om subcellulaire lokalisatie van eiwitten te voorspellen, waarbij alleen gebruik wordt gemaakt van sequentie-informatie, waardoor een goede nauwkeurigheid wordt bereikt [27]. Alle functionele eiwitsequenties, zoals verkregen van de SignalP 4.1-server, werden vervolgens onderworpen aan het voorspellen van de aanwezigheid van antigene determinanten (epitopen) die zullen worden herkend door B- en T-celreceptoren. Dit werd gedaan om ervoor te zorgen dat het ontworpen vaccinconstruct alleen immunodominante T-cel- en B-cel-epitopen bevat en dus in staat zou zijn een efficiënte immuunrespons te bewerkstelligen waarbij zowel humorale als celgemedieerde routes van immuunmechanismen betrokken zijn.

Cytotoxische T-lymfocyt (CTL) epitoopvoorspelling

Voorspelling van de cytotoxische T-lymfocyt (CTL)-epitoop is een essentieel aspect bij het ontwerpen van een ideaal peptide [28]. Een vrij toegankelijke webserver, namelijk NetCTL1.2 (//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL), werd gebruikt om de CTL-epitopen voor alle geselecteerde eiwitten te voorspellen. De methode integreert de voorspelling van peptide-MHC klasse I-binding, proteasomale C-terminale splitsing en TAP-transportefficiëntie [29], allemaal essentiële kenmerken die een sequentie van CTL-bindend epitoop zou moeten bezitten. De server maakt voorspellingen mogelijk van CTL-epitopen die beperkt zijn tot 12 MHC klasse I-supertypes, waarvan alleen het A1-supertype werd gebruikt voor de huidige studie. MHC klasse I-binding en proteasomale splitsing worden uitgevoerd met behulp van kunstmatige neurale netwerken. De TAP-transportefficiëntie wordt voorspeld met behulp van een gewichtsmatrix [29]. Sequenties met hogere bindingsscores worden als krachtige CTL-epitopen beschouwd. Naast NetCTL 1.2 werd ook een andere, publiekelijk beschikbare webservergebaseerde benadering gebruikt, namelijk SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), voor de voorspelling van CTL-epitopen van alle geselecteerde Leishmania-eiwitten. De voorspelling is gebaseerd op gepubliceerde motieven en houdt rekening met de aminozuren in de anker- en hulpankerposities en andere frequente aminozuren [30]. Uit de lijst met MHC-typen op deze server zijn HLA-A*01, HLA-A*02:01 en HLA-A*03 gekozen voor de voorspelling. De epitoopzoekopdracht werd gespecificeerd voor nonameersequenties voor een uniforme vergelijking met de resultaten van de NetCTL 1.2-server. Alleen de gemeenschappelijke epitopen van elk eiwit (indien aanwezig), die door zowel de NetCTL 1.2- als de SYFPEITHI-servers waren voorspeld met compatibele hogere scores, werden geselecteerd voor het uiteindelijke vaccinconstruct.

Helper T-lymfocyt (HTL) epitoopvoorspelling

Helper-T-lymfocyten zijn de belangrijkste immuuncellen, omdat ze nodig zijn bij alle soorten adaptieve immuunreacties. Voorspelling van HTL-epitopen (voornamelijk van het Th-1-type) wordt daarom een ​​essentieel element voor het ontwerpen van een effectief peptidevaccin. In het huidige onderzoek werd de MHC-II-bindingsanalysetool in de IEDB-server (Immuno Epitope Datan base and Analysis) (http://tools.iedb.org/mhcii/) gebruikt voor de voorspelling van 15-meer HTL epitopen voor een set van drie menselijke allelen, namelijk HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 en HLA-DRB1*01:03. Menselijke HLA-allelen werden gekozen voor een meer realistische schatting van de MHC-II-bindingsaffiniteit van de epitopen toen het vaccin tegen menselijke leishmaniasis werd ontworpen. De voorspelde output wordt gegeven in eenheden van IC50nM voor de combinatorische bibliotheek en SMM-uitlijning. Daarom duidt een lager getal op een hogere affiniteit. Bij deze benadering werd door de IEDB aanbevolen voorspellingsmethode gebruikt, waarbij een lage aangepaste rang indicatief is voor geschikte MHC-II-bindmiddelen en daarom kan worden gedefinieerd als krachtige HTL-epitopen.

Identificatie en selectie van cytokine-inducerende HT-epitopen

Cytokinen zijn van enorm belang voor het goed functioneren van het immuunsysteem. Een batterij cytokines zoals IL-2, IL-4, IL-6 en interferon kunnen zowel CTL-gemedieerde als humorale immuunreacties induceren [31]. Daarom verdienen de HTL-epitopen die cytokineproductie kunnen teweegbrengen de voorkeur voor het ontwerpen van een immuunprofylactisch vaccin. Met deze visie werd de IFNepitope-server (//crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/) gebruikt voor de identificatie van HTL-epitopen met cytokine-inducerende eigenschappen. IFNepitope is een online voorspellingsserver die tot doel heeft de peptiden te voorspellen uit eiwitsequenties die IFN-gamma kunnen induceren dat vrijkomt uit CD4+ T-cellen. De webserver is ontwikkeld op basis van een dataset die IFN-gamma-inducerende en niet-inducerende MHC klasse II-bindmiddelen omvat [32]. De door de IEDB-server voorspelde HTL-epitopen met hogere MHC-II-bindingsaffiniteiten (lagere aangepaste rangen) werden door de IFNepitope-server verstrekt als invoer om te controleren op hun cytokineproducerende vermogen. De aldus geïdentificeerde epitopen werden vervolgens onderworpen aan het volgende analyseniveau door de IL4pred-server (IFNepitope(iiitd.edu.in) en ook door de IL10Pred-server (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php) om ervoor te zorgen dat de geselecteerde HTL-epitopen net zo goed de uitscheiding van respectievelijk IL-4 en IL-10 zouden oproepen. Ze houden ook rekening met positionele conservering van aminozuurresiduen en aminozuursamenstelling van de peptiden voor een nauwkeurigere voorspelling. [33, 34]. De MHC-II-bindende HTL-epitopen waarvan werd voorspeld dat ze positief zouden zijn door alle drie de servers, werden geselecteerd voor opname in het uiteindelijke vaccinconstruct. Deze strategie werd toegepast om de werkzaamheid van het vaccin te verbeteren, aangezien het zou kunnen aanzetten tot een intense reactie waarbij een grote verscheidenheid aan cytokines betrokken is (IFN-gamma, IL-4 en IL-10), wat leidt tot versnelde en langdurige immuniteit.

Analyse van epitoopbehoud

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (standaard).

Ontwerp van een vaccinsequentie met meerdere epitopen

Gebaseerd op de immuno-informatische analyse werd een primaire sequentie van het subeenheidvaccin geconstrueerd door het incorporeren van de geselecteerde CTL- en HTL-epitoopsequenties. Deze epitopen werden met elkaar verbonden door respectievelijk AAY- en GPGPG-linkers [28, 31]. Linkers worden ingevoegd voor een goede scheiding van de individuele epitopen die nodig zijn voor het efficiënt functioneren van het vaccinconstruct [28, 36]. Ten tweede is de toevoeging van een geschikt adjuvans cruciaal in een subeenheidvaccin om de immuunrespons te versterken [31]. De keuze van een geschikt adjuvans is van cruciaal belang bij het ontwerpen van vaccins voor proeven op mensen. IL-12 geproduceerd door verschillende immuuncellen is essentieel bij het ontwikkelen van celgemedieerde immuniteit tegen leishmaniasis, en het potentieel van IL-12 als adjuvans in vaccins tegen leishmaniasis is gerapporteerd in muizenmodellen [3, 37, 38]. Dit IL-12 werd geselecteerd als adjuvans voor het ontwerpen van het vaccin, en de sequentie ervan werd opgenomen in het N-uiteinde van het vaccinconstruct met behulp van de EAAK-linker [28, 31]. De sequentie van de menselijke IL-12 alfaketen werd opgehaald uit de Uniprot-database (www.uniprot.org; Toegangsnummer P29459). Tenslotte werd het peptidevaccinconstruct verkregen met adjuvans, linker, CTL-epitopen en HTL-epitopen (met intra-epitopische AAY- en GPGPG-linkers) in een sequentie die beweegt van N-terminaal naar C-terminaal.

Conformationele en lineaire B-celepitoopvoorspelling

Humorale immuniteit omvat de synthese en uitscheiding van specifieke antilichamen door geactiveerde B-cellen, wat de aanwezigheid vereist van antigene determinanten die worden herkend door B-celreceptoren die aanwezig zijn op het oppervlak van B-lymfocyten. Een ideaal immuunbeschermend peptidevaccin zou dergelijke componenten moeten hebben om een ​​interactie aan te gaan met de B-cellen en daardoor te stimuleren. Daarom werden twee servers, namelijk ABCpred en BepiPred 2.0, toegepast voor de nauwkeurige voorspelling van B-celepitopen in de primaire sequentie van het ontworpen vaccin. ABCpred-server (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html) is een op een kunstmatig neuraal netwerk (ANN) gebaseerde aanpak die B-celepitopen in een bepaalde antigeensequentie voorspelt met behulp van vaste lengteparameters. De trainingsgegevensset die bij deze methode wordt gebruikt, bevat B-celepitopen uit de B-celepitoopdatabase (BCIPEP). De server kan epitopen met een nauwkeurigheid van 65,93% voorspellen met behulp van een terugkerend neuraal netwerk [39]. De primaire sequentie van het uiteindelijke vaccinconstruct werd als invoer aangeleverd in een eenvoudig formaat, en de standaardparameters van de ABCpred-server, waaronder een drempelwaarde van 0.51 met een vensterlengte van 16 aminozuurresiduen, werden gebruikt voor de voorspelling. BepiPred 2.0 server (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech) voorspelt daarentegen sequentiële B-celepitopen op basis van een invoerreeks door een willekeurig bosalgoritme dat is getraind op epitopen en niet-epitoopaminozuren bepaald uit kristalstructuren gevolgd door een sequentiële voorspellingsafvlakking [40]. De primaire sequentie van het vaccin werd als invoer in FASTA-formaat aangeleverd. De toepassing van twee verschillende servers die B-celepitopen voorspellen op basis van twee verschillende algoritmen maakt de voorspelling realistischer. De meeste antigene determinanten die door de B-celreceptor en antilichamen worden herkend, zijn discontinu, wat betekent dat ze aminozuurresiduen bevatten die zich op afstand in de primaire structuur van het immunogeen bevinden, maar tijdens het vouwen van het eiwit naast elkaar worden gebracht [41]. Voorspelling van dergelijke discontinue B-celepitopen in de gevalideerde tertiaire structuur van het vaccin werd uitgevoerd door gebruik te maken van de ElliPro-server (//tools.iedb.org/ellip ro/) opgenomen in het IEDB-portaal. ElliPro is een vrij toegankelijke webtool die de aangepaste Thronton-methode implementeert en rekening houdt met het massamiddelpunt van elk residu in plaats van met de C-atomen. Door dit te doen relateert elk van de epitopen aan een toegekende score, gedefinieerd als PI (uitsteekselindex), gemiddeld over epitoopresiduen. Discontinue epitopen worden bepaald op basis van hun respectieve PI-waarden en geclusterd op basis van de afstand tussen de massacentra van het residu (R). Grotere waarden van R correleren met het voorspellen van significantere discontinue epitopen [42]. Tegelijkertijd kunnen lineaire B-celepitopen in het input-eiwitmodel ook worden voorspeld en gevisualiseerd met behulp van ElliPro. Detectie van zowel lineaire als discontinue B-celepitopen in het verfijnde 3D-model van het vaccin zorgt voor een succesvolle strategie voor het ontwerpen van vaccins.

Profilering van antigeniciteit, allergeniciteit en toxiciteit van het vaccinconstruct

Antigeniciteit is een essentieel criterium voor een immuunprofylactisch vaccin. Om ervoor te zorgen dat het ontworpen vaccinconstruct een langdurige immuunrespons zou opwekken door interactie met de B- en T-celreceptoren, werd de antigeniciteit ervan geëvalueerd met behulp van ANTIGENpro- en VaxiJen 2.0-servers. ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) server classificeert correct 82% van de bekende beschermende antigenen wanneer getraind met alleen de eiwitmicroarray-datasets. De nauwkeurigheid van de gecombineerde dataset wordt geschat op 76% door tienvoudige kruisvalidatie-experimenten die een aanzienlijk betere herkenning van antigene peptiden mogelijk maken. Het draait op een tweetrapsarchitectuur, inclusief een op SVM gebaseerde tweedetrapsclassificator. Voor een nieuwe invoereiwitsequentie is de waarschijnlijkheid berekend door de SVM-voorspeller van de tweede fase de uiteindelijke ANTIGENpro-voorspellingsscore [25]. VaxiJen2.0 (http://www.dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) is een andere publiek toegankelijke webserver die de antigeniciteit van een eiwitsequentie evalueert door middel van een uitlijningsvrije benadering die is gebaseerd op op auto-cross-covariantie (ACC)-transformatie van eiwitsequenties in uniforme vectoren met belangrijkste aminozuureigenschappen en maakt antigeenclassificatie mogelijk uitsluitend gebaseerd op verschillende fysisch-chemische eigenschappen van het eiwit zonder te verwijzen naar sequentie-uitlijning [43]. Ten tweede werd, om elke mogelijkheid uit te sluiten dat het vaccinconstruct een allergische reactie bij een individu zou kunnen veroorzaken, de AlgPred-server (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) gebruikt om bepaal de allergeniciteit ervan. De servertool biedt een verscheidenheid aan benaderingen, waaronder het in kaart brengen van IgE-epitopen, MEME/MAST-motief, SVM-methode gebaseerd op dipeptidesamenstelling en BLAST ARP's, die allemaal worden benut voor een nauwkeurige voorspelling. De drempelwaarde is ingesteld op 0.4 (standaard) voor een hogere voorspellingsprecisie. Daarnaast werd ook AllerTop v.2.{{20}} (https://www.dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), een vrij toegankelijke, op een webserver gebaseerde tool, toegepast om de niet-allergische aard van het vaccinconstruct te bevestigen. Deze methode is gebaseerd op de auto-covariantie (ACC) transformatie van eiwitsequenties in uniforme vectoren van gelijke lengte. Het is toegepast op kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties (QSAR)-studies van peptiden met verschillende lengtes, en de eiwitten worden geclassificeerd door het k-dichtstbijzijnde buuralgoritme [44]. Eventuele toxiciteit werd voorspeld door gebruik te maken van de ToxinPred-server (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). Dit voorspellingsinstrument werkt op basis van zowel machine learning-techniek als een kwantitatieve methode die is getraind op een dataset van verschillende toxische en niet-toxische peptiden verkregen van SwissProt en TrEMBL [45]. Toxiciteitsprofilering is van cruciaal belang om de veiligheid van het vaccin en andere dergelijke immunotherapeutische peptiden die bedoeld zijn voor een proef op mensen te beoordelen. De analyse werd uitgevoerd door de SVM (TrEMBL)+motiefgebaseerde benadering te kiezen bij een E-waardedrempel van 10.0 voor de motiefgebaseerde methode en een SVM-drempel van 0,1.

Evaluatie van fysisch-chemische eigenschappen

Het beschrijven van de fysische en chemische kenmerken van een chimeer peptide wordt van cruciaal belang omdat het, wanneer het als vaccin wordt toegediend, een goede immuunrespons zou moeten kunnen induceren. De ProtParam-server die beschikbaar was bij het ExPASY-portaal (Expert Protein Analysis System) (https://web.expasy.org/programme/) werd gebruikt om verschillende fysisch-chemische parameters van het primaire vaccinconstruct te berekenen, waaronder kenmerken als molecuulgewicht, theoretische pI, instabiliteitsindex, alifatische index, in vivo en in vitro halfwaardetijd, groot gemiddelde van hydrofobiciteit (GRAVY) en andere.

Secundaire structuurvoorspelling van het vaccinpeptide

Secundaire structurele elementen van het ontworpen vaccinconstruct werden voorspeld door toepassing van de PSIPRED-server (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) en RaptorX-eigenschapserver (//raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ voorspellen/), beide vrij toegankelijke online servers voor eiwitstructuuranalyse. De primaire sequentie van het vaccinpeptide werd als invoer verschaft. PSIPRED voorspelt de secundaire structuur van de invoereiwitsequentie door gebruik te maken van twee feed-forward neurale netwerken die functioneren op basis van positiespecifieke scorematrices (PSSM) gegenereerd door PSI-BLAST [46]. Het omvat de identificatie van sequenties die homoloog zijn aan ons vaccinconstruct door PSI-BLAST, gevolgd door het genereren van PSSM. PSIPRED 3.2 en hogere versies behaalden een gemiddelde Q3-score van 81,6%, zoals geëvalueerd door een strenge drievoudige kruisvalidatiemethode die deze aanpak aanzienlijk nauwkeurig en accuraat maakt. De RaptorX-webserver maakt gebruik van een zeer recente machine learning-techniek genaamd DeepCNF (diepe convolutionele neurale velden) voor het gelijktijdig voorspellen van verschillende kenmerken, zoals secundaire structuur, toegankelijkheid van oplosmiddelen en ongeordende gebieden. DeepCNF is een geïntegreerde aanpak die zowel conditionele willekeurige velden (CRF's) als ondiepe neurale netwerken combineert, die complexe sequentie-structuurrelaties modelleert door middel van een diepe hiërarchische architectuur en een Q3-nauwkeurigheid van ongeveer 84% kan verkrijgen voor een 3-klasse secundaire structuur [47] .

Voorspelling van de tertiaire structuur

De tertiaire structuur van het uiteindelijke vaccinpeptide werd voorspeld met behulp van de online webserver I-TASSER (//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER is een hiërarchische benadering voor het modelleren van eiwitstructuren, gebaseerd op profiel-profiel threading uitlijning (PPA) en iteratieve structuurassemblagesimulaties, gevolgd door structuurverfijning op atomair niveau. Het werkt in drie fasen: structurele sjabloonidentificatie, iteratieve structuurassemblage en structuurgebaseerde functieannotatie. De hoogst gerangschikte structuurmodellen met globale en lokale nauwkeurigheidsschattingen worden geretourneerd met hun representatieve C-scores en TM-scores, die gecorreleerd zijn met de kwaliteit van het voorspelde model. Het I-TASSER-programma vertegenwoordigt een van de meest succesvolle methoden die in CASP zijn gedemonstreerd voor geautomatiseerde voorspellingen van de eiwitstructuur en -functie [48, 49].

Verfijning van de tertiaire structuur van het vaccin

Conventionele computationele modellering van een eiwitstructuur alleen garandeert niet de authenticiteit en nauwkeurigheid van het voorspelde model, aangezien dergelijke modelleringsstrategieën grotendeels afhankelijk zijn van de mate van waarschijnlijkheid van de invoer (doel) met de beschikbare sjabloonstructuren. Het werd daarom noodzakelijk geacht de kwaliteit van het op templates gebaseerde model verder te verbeteren dan de nauwkeurigheid, en dit kon worden bereikt door de gehele eiwitstructuur te verfijnen. Met dit perspectief werd de driedimensionale modeluitvoer van de I-TASSER-server met de beste C-score onderworpen aan verdere verfijning door de GalaxyRefne-server (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} VERFIJNEN). Het is een door CASP10-geteste verfijningsaanpak waarbij eiwitzijketens eerst worden herbouwd, en vervolgens de zijketens opnieuw worden verpakt en de algehele structuurrelaxatie wordt uitgevoerd door middel van moleculaire dynamica-simulatie. Dit leidt tot nauwkeurige verbetering van zowel lokale als globale tertiaire structuren van doeleiwitten [50].

Voordelen van cistanche-supplementen – Anti-ontstekingsremmend

Validatie van de tertiaire structuur van vaccins

De verfijnde tertiaire structuur van het vaccin moest worden gevalideerd om potentiële fouten op te sporen die zouden kunnen optreden in het voorspelde 3D-model. Het verfijnde model verkregen van de GalaxyRefne-server werd geleverd als invoerstructuur in a.pdb-formaat. Bovendien is de Ramachandran-grafiek een andere zeer nuttige benadering voor het visualiseren van energetisch toegestane en niet-toegestane gebieden van phi (ϕ) en psi (ψ) tweevlakshoeken van de aminozuurzijketens die worden beschouwd als cruciale componenten voor de validatie van een eiwitstructuur. Daarom werd de MolProbity-server [Hoofdpagina – MolProbity (duke.edu)] gebruikt die een Ramachandran-plot voor het gegeven model van het vaccin genereerde op basis van Python-gebaseerde MolProbity-stijl Phenix-validatie [51]. We hebben verder de ERRAT-server [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA. edu)] gebruikt die de statistieken van niet-gebonden interacties tussen verschillende atomen in het model analyseert en de waarde van de foutfunctie uitzet tegen een {{ 6}}resten glijden [52]. Voor dit doel werd gebruik gemaakt van de ProSA-webserver (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), een interactief webgebaseerd platform gebaseerd op het standaard ProSA-programma [53]. Deze stap werd uitgevoerd om een ​​meer geavanceerde en nauwkeurige validatie van de gemodelleerde structuur te verkrijgen.

Disulfide-engineering van het vaccinpeptide

Disulfidebindingen dragen bij aan de stabiliteit van eiwitten door de conformationele entropie te verlagen en ook door de vrije energie van de gedenatureerde toestand te vergroten. De introductie van nieuwe disulfidebindingen wordt beschouwd als een cruciaal biotechnologisch hulpmiddel om de thermostabiliteit van natieve, gevouwen eiwitten te verbeteren. De Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12-server werd gebruikt om de algehele structurele stabiliteit van het ontworpen vaccin te verbeteren door disulfidekoppelingen te introduceren. Deze methode maakt gebruik van oorspronkelijke geometrie en berekent een energiewaarde voor elk potentieel disulfide, waardoor een manier wordt geboden om de kandidaat-disulfidebindingen te rangschikken. De disulfidebindingen die maximale stabiliteit bieden, waren de kandidaten met een hoge chi3-waarde, bindingsenergie en B-factor [54]. De flexibele gebieden van het peptide werden geselecteerd op basis van de eerder genoemde parameters, en overeenkomstige stabiliserende mutaties werden gecreëerd door het vormen van disulfidebindingen tussen de gekozen residuparen.

Moleculaire koppeling van vaccinconstruct aan immuunreceptoren (menselijke TLR’s-2, 4, 5, 8 en muis-TLR-9)

Toll-like receptoren (TLR) zijn belangrijke kenmerken van cellulaire immuunreacties die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) herkennen en aangeboren immuunreacties tegen infecties oproepen. Vervolgens werd de directe activering van TLR-2 met Leishmania-componenten gerapporteerd [55]. In andere gerelateerde experimentele onderzoeken resulteerde het ontbreken van TLR-4 in verhoogde parasitaire groei en vertraagde genezing van huidlaesies veroorzaakt door L. major-infecties, wat de plausibele rol van TLR-4 bij het induceren van immuniteit tegen Leishmania [56] aangeeft. ]. Aan de andere kant bleken TLR-2, 4 en 9 betrokken te zijn bij een immunopathologisch spectrum van CL veroorzaakt door L. braziliensis en L. amazonensis [57]. TLR-9 werd ook geëvalueerd als een sleutelrol bij de activering van dendritische cellen in de pathogenese van VL bij mensen [58]. In de meeste onderzoeken die op dit gebied zijn uitgevoerd, is aangetoond dat sommige van de van Leishmania afgeleide componenten TLR-2, 4 en 9 activeren. Deze waarnemingen benadrukken het feit dat verschillende TLR's betrokken zijn bij het opwekken van beschermende immuniteit tegen Leishmania. Daarom werd een interactie tussen de TLR's en het ontworpen vaccinconstruct noodzakelijk geacht voor het opwekken van effectieve immuniteit tegen Leishmania-infecties. Dit werd gecontroleerd door moleculaire koppeling van het multi-epitopische vaccinpeptide uit te voeren met menselijke TLR's-2, 4, 5, 8 en muis-TLR-9 met behulp van de PatchDock-server [PatchDock Server (tau.ac.il )]. Het PatchDock-algoritme kent drie hoofdfasen, namelijk representatie van moleculaire vormen, matching van oppervlaktepatches en filteren en scoren. Het is een op geometrie gebaseerd moleculair dockingalgoritme dat voornamelijk werkt op de complementariteit van de moleculaire vorm tussen de receptor en het ligand. De complementaire patches worden op elkaar afgestemd en er worden kandidaat-transformaties gegenereerd. Elk van deze transformaties wordt verder gerangschikt door een scorefunctie toe te wijzen die rekening houdt met zowel atomaire desolvatie-energie als geometrische ft [59, 60]. In ons onderzoek werden menselijke TLR-2 (PDB-id: 6NIG), TLR-4 (PDB-id: 4G8A), TLR-5 (PDB-id: 3J0A), en TLR-8 (PDB id: 4QC0), en muis-TLR-9 (PDB id: 3WPF) werden geselecteerd als receptoren, en hun afzonderlijke PDB-bestanden werden opgehaald uit Protein DataBank (www .rcsb.org). Het verfijnde 3D-model van het vaccinpeptide werd gebruikt als ligand voor alle dockingsimulaties. De PatchDock-server is ingesteld op standaardparameters (clustering RMSD: 4.0). We hebben het beste dockingmodel verder geanalyseerd met behulp van de Cluspro-server op basis van een mogelijk algoritme voor bindingrotatie, en obligaties werden geëvalueerd met behulp van PyMOL-software [61].

Codonoptimalisatie, voorspelling van de mRNA-structuur en in silico-klonering voor expressie van vaccineiwit

Optimalisatie van het codon is vereist om de maximale expressie van vreemde genen in het gastheerorganisme te bereiken wanneer het gebruik van een codon door de gastheer aanzienlijk verschilt van dat van de natieve gastheer waaruit de oorspronkelijke sequenties voor het uiteindelijke vaccinconstruct waren verwijderd. JCat (Java Codon Adaptation Tool), publiekelijk beschikbaar op (//www.jcat.de/), werd gebruikt voor omgekeerde vertaling en codonoptimalisatie door een primaire sequentie van het uiteindelijke vaccinconstruct als input te verschaffen. Het codongebruik werd geoptimaliseerd voor het meest gesequenced prokaryotische organisme, E. coli K12 [6]. Er werden drie extra opties van de tool geselecteerd om rho-onafhankelijke transcriptieterminators, prokaryote ribosoombindingsplaatsen en ongewenste restrictiesplitsingsplaatsen te vermijden. De codonadaptatie-index (CAI) en GC-inhoud, zoals berekend door de JCat-tool, geven aan hoe goed de optimalisatie was. Een betere optimalisatie zorgt voor een hogere expressie van het vaccineiwit. Verder werden restrictieplaatsen voor de enzymen XhoI en NdeI opgenomen in de geoptimaliseerde cDNA-sequentie die door de JCat-tool werd geleverd om het klonen te vergemakkelijken. De gemodificeerde sequentie (met restrictieplaatsen) werd vervolgens in de E. coli pET 28-a(+) plasmidevector ingevoegd met behulp van de restrictiekloneringsmodule van het SnapGene-hulpmiddel [6, 31, 62, 63]. SnapGene-software is beschikbaar op internet op (https://www.snapgene.com/). Daarnaast hebben we ook de mfold-webserver (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) gebruikt voor de voorspelling van de secundaire structuur van het mRNA gecodeerd door de genen van het chimere peptide. De omgekeerd vertaalde, geoptimaliseerde reeks verkregen uit de JCat-tool werd als invoer geleverd. Het mfold-programma is gebaseerd op een kernalgoritme dat minimale vrije energie, ∆ G, en minimale vrije energie voorspelt voor vouwingen die een bepaald basenpaar bevatten. Er worden ook verschillende vouwbeperkingen toegepast voor de nauwkeurige voorspelling van vouwenergieën. De vouwenergie voor het vouwen van RNA is vastgesteld op 37 graden, terwijl de ionische omstandigheden zijn vastgesteld op [Na+]=1 M en [Mg++]=0 [64].

Op C-immsim gebaseerde immuunsimulatie

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) is een servergebaseerd hulpmiddel voor het voorspellen van immuunresponsen dat gebruik maakt van agent-gebaseerde klassen, en de voorspelling ervan is afhankelijk van neurale netwerken. Het kan zowel humorale als celgemedieerde immuunreacties voorspellen. C-immsim maakt gebruik van het Celda Seiden-model, het bit-string polyklonale roostermodel en de Simpson-index om de voorspelling van actieve, rustende en geheugencellen en hun levensduur te karakteriseren. Het helpt om het cytokineprofiel van een bepaalde reactie te voorspellen om ontstekingsreacties te evalueren [65].

Cistanche-extractpoeder

Moleculair dynamische simulatie

De moleculair dynamische simulatie werd uitgevoerd om de stabiliteit van ons beste complex, dat wil zeggen TLR, met het voorgestelde vaccin te evalueren met behulp van iMOD (iMod Server home page (csic.es) server. Deze webgebaseerde server maakt gebruik van verbeterde normale modusanalyse (NMA) voor de karakterisering van verschillende dynamische eigenschappen van biomoleculen, zoals eiwitflexibiliteit en stabiliteit, door middel van een intra-atomair krachtveld. In deze huidige studie analyseerden we de misvormingen van de hoofdketen, B-factor, eigenwaarden, covariantiefactor en elastisch netwerkmodel als standaard NMA-parameters voor de evaluatie van eiwit-eiwitcomplexen verkregen door in silico-benaderingen [66-69].

Resultaten

Selectie en terugwinning van antigene eiwitsequenties van Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), wat hun grotere potentie voor het ontwerpen van vaccins weerspiegelt (Tabel 1). De eiwitten werden onderscheiden als secretoir en niet-secretoir op basis van de voorspelling van signaalpeptide-splitsingsplaatsen door de SignalP 1.4-server. Twee van de geselecteerde Leishmania-eiwitten, namelijk. L. mexicana cysteïneproteïnase A (Uniprot id: P25775) en L. amazoensis oppervlakteglycoproteïne GP-46/M2 (Uniprot id: P21978) bleken signaalpeptiden te bevatten en daarom voorspeld als secretoire eiwitten. Van de overige van de tien Leishmania-antigenen werd geen signaalpeptide gevonden dat hun niet-secretoire aard aangeeft. Lokalisatieanalyse voorspelde dat het eiwit cysteïneproteïnase A van L. mexicana (Uniprot id: P25775) gelokaliseerd zou worden in lysosoom/vacuole, eiwitten leishmanolysine C1 en proteofosfoglycan van L. mexicana (respectievelijk Uniprot ids: P43150 en Q9TW13) als membraaneiwitten. LACK beschermend antigeen van L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) in de kern en hitteschok-gerelateerd eiwit 1 van L. major (Uniprot id: P12076) om te worden gelokaliseerd in de mitochondriën. Van alle andere eiwitten werd voorspeld dat ze cytoplasmatisch waren (Tabel 1). Daarnaast werd de aminozuursequentie van de alfaketen van menselijk IL-12 ook verkregen uit de Uniprot-database (Uniprot id: P29459) om te worden gebruikt als adjuvans in het uiteindelijke vaccinconstruct.

Voorspelling van CTL- en HTL-epitopen

Van alle onderzochte eiwitten werd een totaal aantal van 59 algemene niet-Amerikaanse CTL-epitopen gezamenlijk geïdentificeerd door NetCTL 1.2- en SYFPEITHI-servers. Aan elk van de voorspelde CTL-epitopen werd een bepaalde score toegewezen, berekend door de respectieve servers. Slechts 26 van deze algemene 9-meer CTL-motieven werden geselecteerd vanwege hun hogere scores (wat wijst op een hogere MHC I-bindingsaffiniteit). Deze zesentwintig CTL-epitopen die algemeen werden geïdentificeerd door beide servers met compatibele hogere scores, werden opgenomen in het uiteindelijke vaccinconstruct (aanvullende tabel S1). Op dezelfde manier voorspelde de IEDB MHCII-bindingsanalysetool 15-meer HTL-epitopen van alle geselecteerde eiwitten tegen een set van drie menselijke HLA-allelen (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 en HLADRB1* 01:03). De voorspelde HTL-epitopen met de laagste aangepaste rangorde voor elk van deze allelen zijn gedocumenteerd zoals in aanvullende tabel S2. Uit deze verzameling werd een totaal aantal van negen sequenties gekozen op basis van hun lage aangepaste rangorde (Tabel 2), waardoor deze HTL-epitopen de krachtigste MHC-II-binders zijn voor elk van de drie HLA-allelen. De geselecteerde HTL-epitopen werden vervolgens onderworpen aan verdere computationele analyse om hun cytokineproducerende capaciteiten te voorspellen.

Tabel 1 Twaalf potentiële antigene peptiden van verschillende soorten Leishmania zijn geëxploiteerd voor de constructie van vaccins en geselecteerd op basis van hun hoge antigeenscore zoals voorspeld door de ANTIGENpro-server

Screening op HTL-epitopen met cytokine-inducerende eigenschappen

Alle negen gekozen HTL-epitopen (Tabel 2) werden geëvalueerd op hun vermogen om interferon te produceren, door gebruik te maken van een IFNepitope-server. De server voorspelde (IFN- vs. nonIFN, met behulp van SVM en op motieven gebaseerde hybride analyse) slechts drie van dergelijke peptiden, zoals FRRLYKTLGQLVYKK uit parafagellar staafeiwit 2C van L. major, DNGAYLGMEPSSVAA uit proteofosfoglycaan van L. mexicana, en RLHFFMMGFAPLTSR uit de tubuline-bètaketen van L. mexicana als "positief" met scores lager dan 1.0 (Tabel 3). Deze drie peptiden werden verder gecontroleerd op hun IL-4- en IL-10--producerende capaciteiten met behulp van respectievelijk de IL4pred-server en de IL10pred-server. Beide servers maken gebruik van een SVM-classificator en houden bij de voorspelling rekening met verschillende SVM-invoerparameters, zoals aminozuursamenstelling, dipeptidesamenstelling, aminozuurneiging en fysisch-chemische eigenschappen [32, 33]. De respectieve servers voorspelden dat deze drie 15-meer IFN- -producerende epitopen ook inductoren waren voor IL-4 en IL-10 (aanvullende tabel S3). Daarom werden deze drie MHC-II-bindende 15-meer HTL-epitopen uiteindelijk geselecteerd voor de constructie van het vaccin, rekening houdend met hun vermogen om de productie van cytokines IFN-, IL-4 en IL{{24 }} waardoor een verhoogde immuunrespons wordt bemiddeld.

Analyse van epitoopbehoud

Er werd gebruik gemaakt van de IEDB-module "conservation across antigen" die beschikbaar is binnen de IEDB-server om de mate van conservering van de geselecteerde CTL- en HTL-epitopen te vinden die in het uiteindelijke vaccinconstruct zouden worden opgenomen. Elk van de zesentwintig CTL-epitopen en drie HTL-epitopen werd individueel gescreend tegen een specifieke set homologe eiwitsequenties verkregen door Uniprot BLAST. De BLAST-resultaten lieten een hoge mate van conservering zien van de geselecteerde eiwitten in verschillende soorten Leishmania en ook in andere verwante parasitaire protozoa, voornamelijk Trypanosoma. Alle HTL-epitopen bleken in hoge mate geconserveerd te zijn (100%) over de reeks verwante Leishmania-eiwitten die in de analyse werden gebruikt, terwijl het bereik van conservering voor geselecteerde CTL-epitopen varieerde van 0 tot 100% (aanvullende tabel S4). De opname van dergelijke geconserveerde CTL- en HTL-epitopen in het uiteindelijke vaccinconstruct zou een breed spectrum kruisimmuniteit garanderen tegen meerdere soorten pathogene Leishmania die gewoonlijk mensen infecteren.

Tabel 2 Details van geselecteerde HTL-epitopen (15 meer) met hun broneiwitten, overeenkomstige bindingsallelen en aangepaste rangen voorspeld door het IEDB MHC-II-bindingsinstrument

Tabel 3 De IFNepitope-server voorspelde MHC II-inducerende epitopen die in staat zijn tot interferonproductie

Constructie van vaccinsequentie met meerdere epitopen

De primaire sequentie van het uit meerdere subeenheden bestaande peptidevaccin werd geconstrueerd door het samenvoegen van de sequenties van zesentwintig CTL-epitopen en drie HTL-epitopen, geselecteerd op basis van hun antigeniciteit, MHC-bindingsaffiniteit en cytokine-inducerend vermogen. De individuele CTL- en HTL-epitopen werden samengevoegd door gebruik te maken van respectievelijk AAY- en GPGPG-linkers, en de totale lengte van het resulterende vaccinpeptide was 369 aminozuren. Het adjuvans, de 219 aminozuren lange alfa-keten van menselijk IL-12 (Uniprot id: P29459), werd toegevoegd aan het N-uiteinde van het ontworpen peptide door middel van EAAK-linker. De toevoeging van IL-12 als natuurlijk adjuvans zou de effectiviteit van het vaccin vergroten door de immuunrespons te versnellen, zoals al gevalideerd in dierstudies [3, 37]. Bovendien werd ook een 6XHis-tag toegevoegd aan het C-uiteinde van het peptide om de identificatie en zuivering van het eiwit na de productie ervan door recombinant-DNA-technologie te vergemakkelijken. Na de toevoeging van linkers, adjuvans en histidine-tag bleek de lengte van het uiteindelijke vaccinpeptide 598 aminozuurresiduen te zijn (Fig. 1).

Voorspelling van lineair, continu en discontinu B-celepitoop

De aanwezigheid van antigene determinanten in de primaire sequentie van het ontworpen vaccin werd geïdentificeerd door twee verschillende servers te gebruiken, namelijk ABCpred en BepiPred 2.0, voor effectievere voorspelling. De ABCpred-server voorspelt B-celepitopen door gebruik te maken van een getraind terugkerend neuraal netwerk en vertegenwoordigt de kandidaatsequenties als 16-mer-peptiden gerangschikt op basis van hun bindingsscores (aanvullende tabel S5). Een hogere score van het peptide betekent een grotere waarschijnlijkheid dat het een epitoop is. Het ontworpen vaccinpeptide bleek zeven niet-overlappende 16-mer-peptiden te hebben met voorspelde scores van 0.90 en hoger bij een standaarddrempelwaarde van 0.51 , wat hun zeer hoge vermogen weerspiegelt om B-cellen te binden en te stimuleren. De andere server, BepiPred 2.0, voorspelt de waarschijnlijkheid dat elk aminozuurresidu in de invoersequentie deel uitmaakt van het B-celepitoop en geeft de uitvoer weer als een illustratie met een oranje kleurgradatie die de mate van waarschijnlijkheid. De voorspelde residuen die tot B-celepitopen behoren, zijn gemarkeerd als "E". De server identificeerde een groot aantal residuen als lineaire B-celepitopen met grote waarschijnlijkheid binnen een residutraject van 380–53{{20}} positie van het peptide (Fig. 2) wanneer de epitoopdrempel werd ingesteld op 0.5 (standaard). De identificatie van antigene determinanten voor B-celreceptoren door twee onafhankelijke servers bevestigde dus het feit dat het peptide, wanneer toegediend als vaccin, in staat zou zijn de productie van antilichamen door B-cellen te stimuleren om individuen tegen Leishmania-infecties te beschermen. Het Ellipro-pak (beschikbaar via het IEDB-portaal) voorspelde in totaal 323 aminozuurresiduen gelokaliseerd in acht discontinue B-celepitopen in de verfijnde tertiaire structuur van het peptidevaccin, met scores variërend van 0.509 tot 0,802. Onder hen bevatte de grootste conformationele epitoop 107 aminozuurresiduen met een voorspelde score van 0,772. Voor de analyse zijn de standaardparameters van de server gebruikt. Ellipro voorspelde ook twaalf lineaire B-celepitopen met een totaal aantal van 324 residuen binnen een scorebereik van 0,535-0,885 (aanvullende tabel S6 en aanvullende afbeelding M1).

Antigeniciteit, allergeniciteit en toxiciteitsprofilering van het vaccinconstruct

De antigeniciteit van de uiteindelijke vaccinsequentie (met adjuvans) werd geëvalueerd door ANTIGENpro- en VaxiJen 2.0-servers. De ANTIGENpro-server voorspelde dat dit een waarschijnlijk antigeen zou zijn met een antigeniciteitsscore van 0.745396. VaxiJen 2.0 server beoordeelde het vaccinpeptide als een waarschijnlijk antigeen met een score van 0.5325 bij een drempel van {{10}}.5 toen het doelorganisme werd geselecteerd als een parasiet (Tabel 4). Toen de oorspronkelijke vaccinsequentie zonder het adjuvans echter werd geanalyseerd door VaxiJen 2.0, werd dit ook voorspeld als een waarschijnlijk antigeen met een score van 0.5768 in parasietmodellen. De ANTIGENpro-voorspellingsscore voor de oorspronkelijke reeks was 0.714582. Daarom werd gevonden dat beide geconstrueerde vaccinsequenties (met en zonder adjuvans) antigeen van aard waren, wat het feit ondersteunt dat de peptidecomponenten van het vaccin op zichzelf antigeen waren, zelfs in afwezigheid van het toegevoegde adjuvans (Tabel 4). Wat de allergeniciteit betreft, werd door AlgPred vastgesteld dat de uiteindelijke vaccinsequentie niet-allergeen was met een voorspelde score van 0.4018 bij een drempel van 0.4. Bovendien bleek de eiwitsequentie geen experimenteel bewezen IgE-epitoop te bevatten, en werden er geen treffers gevonden voor BLAST-resultaten voor allergeen-representatieve peptiden (ARP's), wat wijst op de niet-allergene aard van het vaccin. De AllerTOP v.2.0-server definieerde het eiwit ook als een waarschijnlijk niet-allergeen. Toxiciteitsanalyse door de ToxinPred-server voorspelde dat het peptide niet-toxisch zou zijn wanneer de SVM (TrEMBL)+motief-gebaseerde benadering werd aangenomen bij een SVM-drempel van 0,1, en de E-waardegrens voor motief-gebaseerd werd ingesteld op 10,0. Daarom werd voorspeld dat de gegenereerde vaccinsequentie een waarschijnlijk antigeen, niet-allergeen en niet-toxisch zou zijn, hetgeen allemaal belangrijke criteria zijn voor een ideaal multi-subeenheid peptidevaccin.

Fig. 1 Schematische weergave van een ontworpen multi-epitoop peptidevaccin dat in totaal 598 aminozuursequenties bevat die een mogelijk vaccinconstruct vertegenwoordigen met N-terminaal natuurlijk adjuvans (groen) gekoppeld aan EAAK (paars) met 26 CTL (oranje) met behulp van AAY (blauw) linker en 3HTL (geel) zijn verbonden met GPGPG (rood) linker. Het eindigt met 6-Zijn tag op de C-terminal voor zuiveringsdoeleinden

Fig. 2 B-celepitoop voorspeld door Bepipred 2.0 server. Rekken op verschillende punten van 1 tot 590 aminozuursequenties werden voorspeld met een potentieel epitoop boven het standaarddrempelniveau. De eerste lijn gemarkeerd als E toont de voorspelde epitooplocatie

Evaluatie van fysisch-chemische parameters

De fysisch-chemische parameters van het uiteindelijke vaccinconstruct werden berekend door de Protparam-server op basis van de aminozuurresiduen die aanwezig zijn in de gegeven sequentie. Het molecuulgewicht (MW) van het ontworpen peptide werd berekend op 65,68 kDa, wat het geschikt maakt voor het induceren van een immunogene respons. De theoretische pI (iso-elektrisch punt) werd berekend als 5,98, wat aangeeft dat het peptide enigszins zuur van aard is. Het totale aantal positief geladen en negatief geladen residuen in het peptide was respectievelijk 48 en 55. De halfwaardetijd werd berekend als 30 uur in zoogdierreticulocyten in vitro, meer dan 20 uur in gist en meer dan 10 uur in E. coli in vivo. De persistentie van het eiwit gedurende 30 uur in zoogdiercellen (inclusief mensen) was voldoende voor het opwekken van een gewenste immuunrespons, aangezien het mechanisme verwerking en presentatie van het eiwit door de immuuncellen vereist. Er werd voorspeld dat de alifatische index (het relatieve volume ingenomen door de alifatische zijketens) 78,34 was, wat aangeeft dat het eiwit thermostabiel van aard is, aangezien de alifatische index kan worden beschouwd als een positieve factor die bijdraagt ​​aan de toename van de thermostabiliteit van bolvormige eiwitten. De instabiliteitsindex werd berekend op 47,10. Er werd voorspeld dat de voorspelde waarde van het vaccinconstruct -0,140 zou zijn; de negatieve waarde definieert het als hydrofiel van aard en zal een interactie aangaan met watermoleculen [28, 70-72]. Concluderend voorspelde de immuno-informatische analyse dat het ontworpen peptideconstruct antigeen, thermostabiel, persistent in zoogdiercellen en hydrofiel was. Al deze factoren hebben invloed op de effectiviteit van het construct als een waarschijnlijk kandidaat-vaccin.

Voorspelling van secundaire structuur

Voorspelling van de secundaire structuur voor het lange chimere peptide met 592 residuen door de PSIPRED-server onthult de aanwezigheid van 45,77% alfa-helix, 4,89% bèta-sheet en 49,32% spoelen, zoals weergegeven in de volgende figuur 3. Bovendien is de RaptorX-structuur De voorspellingsserver analyseerde de relevante toegankelijkheid van oplosmiddelen voor het peptide waarin werd voorspeld dat 36% van de residuen zou worden blootgesteld, 28% werd voorspeld als medium begraven en 35% van de residuen werd voorspeld als begraven, wat aangeeft dat het eiwit over het algemeen een redelijk contact zal hebben met water (oplosmiddel). Er werd door de RaptorX-server voorspeld dat slechts 32 residuen (5% van het peptide) zich in het ongeordende domein van het eiwit zouden bevinden.

Voorspelling van de tertiaire structuur

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 geeft een model aan met de juiste vouw. TM-score is een sequentielengte-onafhankelijke parameter voor het meten van de structurele gelijkenis van het voorspelde model met andere identieke eiwitten in dezelfde SCOP/CATH-vouwfamilie [47].

Tabel 4 Antigeniciteitsresultaten berekend vanaf ANTIGENpro-server en Vaxijen2.0-server met en zonder antigeen

Fig. 3 Secundaire structuurvoorspelling voor lineaire vaccinsequentie door PSIPRED-server

Fig. 4 Voorspelling en verfijning van de tertiaire structuur 3-D-modellering van de vaccinstructuur zoals voorspeld door de I-TASSER-server. b Verfijning van het ruwe 3-D-model door de GalaxyRefne-server

Verfijning en validatie van het 3D-vaccinmodel

Het ‘ruwe’ tertiaire model voor het peptidevaccin werd vervolgens verfijnd door het via de GalaxyReone-server te verwerken. GalaxyRefne leverde vijf modellen op, waarvan model 1 het beste bleek te zijn na evaluatie en vergelijking van de bijbehorende parameters zoals GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolWinbaarheid (2,398); clashscore (21,1); slechte rotameren (0.6); en de door Rama begunstigde regio (88.8) met de rest van de modellen (figuur 4b). De door de MolProbity-server gegenereerde Ramachandran-grafiek laat zien dat het verfijnde 3-D-model 88,8% residuen heeft in de favoriete regio, 98,6% residuen in de toegestane regio en slechts 0,013% uitschieters. Daarentegen bleek het aanvankelijke ruwe model 77,1%, 94,2% en 0,057% residuen te hebben in respectievelijk de favoriete, toegestane en uitschieters. Deze resultaten concluderen duidelijk dat de kwaliteit van het verfijnde tertiaire model aanzienlijk was verbeterd. De ERRATA-server werd ook benut voor extra validatie van het verfijnde model. De ERRATA-server analyseerde het model met een algemene kwaliteitsfactor van 43,542, wat feitelijk het percentage van het invoereiwitmodel vertegenwoordigt dat onder de afwijzingslimiet van 95% valt. Zo hebben we met succes een aanzienlijk verfijnde en gevalideerde tertiaire structuur voor het vaccinconstruct verkregen. De verfijnde tertiaire structuur van het vaccin, samen met de grafieken verkregen van de MolProbity-server en de ERRAT-server, wordt weergegeven in figuur 5. De ProSA-webserver had een Z-score van −1,08 laten zien (aanvullende afbeelding M2), waarin de negatieve waarde geeft aan dat het model buiten het bereik van de scores van vergelijkbare eiwitten met vergelijkbare groottes valt waarvan de structuren zijn bepaald door röntgendiffractie of door NMR [51].

Disulfide-engineering van het vaccinpeptide

De Disulfide by Design 2.12-server retourneerde 45 paren aminozuurresiduen die waarschijnlijke plaatsen zijn voor de vorming van disulfidebindingen. We hebben de vier meest cruciale kandidaat-residuparen geïdentificeerd die zich mogelijk in het flexibele lusgebied van het vaccineiwit bevinden op basis van hun hoge bindingsenergie en Chi3-waarden (aanvullende tabel S7). Deze residuen, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54), en TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), werden vervangen door cysteïne in het verfijnde tertiaire model van het uiteindelijke vaccineiwit, waardoor de thermische stabiliteit werd verbeterd van peptide (Fig. 6). De nauwkeurigheid van de B-factor is echter beperkt tot de verzwakking van neutronenverstrooiing of röntgenstraling door de thermische beweging van moleculen in eiwitkristallografie. Daarom hebben we voor dit computerondersteunde verfijnde vaccinmodel strikt gekozen voor hoge bindingsenergie en Chi3-waarden boven de B-factor [73, 74].

Analyse van koppelingsinteracties van het vaccinpeptide met de TLR's

De interacties van het chimere peptide met de immuunreceptoren (menselijke TLR's{{0}}, 4, 5, 8 en muis-TLR-9) werden bestudeerd door docking-analyse uit te voeren met behulp van de PatchDock-server waarbij de binding De affiniteiten van het vaccin (ligand) met verschillende TLR's (receptoren) werden geëvalueerd. Er werd rekening gehouden met de top tien modellen die door PatchDock voor elke docking werden gegenereerd, waarbij voor elk geval de best gerangschikte modellen met de hoogste dockingscores werden geselecteerd. De scores vertegenwoordigden de vorm en de elektrostatische complementaire liefdadigheidsinstellingen tussen de receptoren en liganden. De beste complementariteit werd gevonden in het geval van menselijke TLR-2 (PDB id: 6NIG) met een score van 18.714, oppervlakte 3963,10 en atomaire contactenergie (ACE) 217,99 (Fig. 7a) . Het vaccin vertoonde ook een efficiënte binding met TLR-5 (PDB id: 3J0A) en TLR-9 (PDB id: 3WPF) met een dockingscore van 18.258; oppervlakte 2879,80 en ACE van −666,94 en dockingscore 18.164; en oppervlakte 4090,70 en ACE van respectievelijk 495,74. Docking met andere TLR's vertoonde zwakkere bindingsaffiniteiten, zoals weerspiegeld door lagere dockingscores gegenereerd door PatchDock, 16.708 voor TLR-4 (PDB-id: 4G8A) en 17.800 voor TLR-8 (PDB-id: 4QC0). Ons vaccinconstruct was dus in staat zich te binden aan verschillende immuunreceptoren met variërende bindingsaffiniteiten. Dit zou zeer wenselijk zijn voor een effectief vaccin in termen van het induceren van een goede en verhoogde immuniteit om Leishmania-infecties te voorkomen. Verder werd de FireDock-webtool gebruikt voor het verfijnen en opnieuw scoren van het beste complex (TLR-2 vaccincomplex), dat hetzelfde verfijnde met een minimale mondiale energie van −19,01, Van Der Waals-associaties (−25,74), atoomcontact energie (−0,03), en bindende vrije energie (−24,26). Deze resultaten bevestigen het feit dat het vaccinpeptide het meest efficiënt interageert met menselijk TLR-2 en daardoor een redelijk stabiel complex vormt dat een duidelijke immuunrespons tegen Leishmania-parasieten zou kunnen veroorzaken. Daarnaast onderzoeken we verder de koppeling tussen TLR-2 en vaccin; Met behulp van de Cluspro-webserver wordt het topmodel (Fig. 7b) geselecteerd op basis van 5D roterende FFT en CAPRI (kritische beoordeling van voorspelde interacties), waarbij de gebalanceerde gewogen score −1192,5 de grootste clustergrootte van 42 leden heeft. Tabel 5 bevat een lijst van 10 op elkaar inwerkende aminozuurresiduen uit Fig. 7b die een stabiel receptor-ligandcomplex vormen.

Fig. 5 een Ramachandran-plot voor het GalaxyRefne-model. b ERRAT-server voorspelde kwaliteitsbeoordeling van de eiwitstructuur

Fig. 6 Disulfide door ontwerp 2.0 voorspelde vier (aangegeven met pijl) potentiële disulfidebindingsformaties om de thermische stabiliteit van het uiteindelijke vaccinconstruct te verbeteren

Codonoptimalisatie en in silico-klonering voor expressie van het vaccineiwit

In een poging om het probleem van codon bias te overwinnen, werd de JCat-tool gebruikt voor codonoptimalisatie, waarbij de ingevoerde aminozuursequentie van het vaccinpeptide werd geretourneerd in de vorm van een omgekeerd vertaalde cDNA-sequentie met een geoptimaliseerde CAI-waarde van 1. Deze waarde ligt binnen het geaccepteerde CAI-waardebereik van 0.8–1.0 [28], waardoor een hoge mate van expressie van het gen in het gastheerorganisme, E. coli K12, wordt gegarandeerd. Hoe hoger de waarde van CAI, hoe beter de expressiesnelheid van het vreemde gen zal zijn. Bovendien bleek het GC-gehalte van de verbeterde sequentie 51,85% te zijn, wat wijst op een goede codonoptimalisatie. Voor betere genexpressie is een GC-gehalte van 35-70% vereist [63]. De restrictieplaatsen voor de enzymen XhoI en NdeI werden gecreëerd aan de 5/- en 3/-uiteinden van de sequentie, gevolgd door de insertie van de gemodificeerde sequentie in de pET28 a(+)-vector. Het gekloonde insert, weergegeven in rode kleur, ligt tussen de gespecificeerde restrictieplaatsen in de vector. Een stuk van zes histidineresiduen bevindt zich ook aan beide uiteinden van de gekloonde sequentie om het zuiveringsproces na de productie van het recombinante vaccineiwit te vergemakkelijken [6, 31]. De grootte van het uiteindelijke plasmidevectorconstruct met het ingevoegde genfragment was ongeveer 7 kb (Fig. 8). De mfold-webserver voorspelde een totaal aantal van vijftig vouwende conformaties van het mRNA, waarvan de topstructuur werd gekozen vanwege de laagste energiescore (ΔG= −492,50). Er werd voorspeld dat deze specifieke gevouwen conformatie een enkele externe lus en vier stapels zou bevatten met minimale vrije energie, wat de stabiliteit van de conformatie aangeeft. De lus werd gevormd met 21 enkelstrengige basen en twee sluithelices. De energiepuntgrafiek berekende dat de optimale energie (δG) 494,4 kcal/mol was. De verschillende gekleurde stippen in het veld verwijzen naar de verschillende energieniveaus van een bepaald basenpaar dat aanwezig is in het mRNA, rekening houdend met de δG berekend door de server [64]. Volgens de grafiek liggen de vrije energieën van de meeste basenparen binnen de -487,5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tabel 5 PyMOL genereerde tien op elkaar inwerkende aminozuurresiduen van receptor en ligand uit figuur 7b, en het getal in de () geeft de respectieve positie van aminozuren in receptor en ligand aan

Immuun simulatie

In silico-immuunsimulatie met behulp van de C-immsim-webserver werd voorspeld dat het aantal antigene stoffen binnen twee dagen na een initiële injectiedosis opliep tot 6,9× 105/ml, en dat het antigeenniveau op de vierde dag daalde tot 0. Deze verhoging van de antigeentelling is gecorreleerd met een opmerkelijke toename van de concentratie van zowel IgM IgG-niveau als IgM-niveau alleen tijdens de vroege infectieperiode en het bereiken van het piekniveau ongeveer binnen 12 dagen na de infectiecyclus op een willekeurige schaal. Andere subtypen van het IgG1+IgG2-niveau en IgG1 nemen aanzienlijk toe als gevolg van de secundaire immuunrespons (Fig. 9a). Cytokineprofielen laten ontstekingsmediatoren zoals INF zien die niveaus bereiken tot 4 x 106 ng/ml op de 12e dag, terwijl andere cytokineniveaus vrij laag blijven (Fig. 9b). Celgemedieerde immunologische reacties gesuggereerd door de aanwezigheid van actieve en rustende cytotoxische T-lymfocyten nemen toe na 2-3 dagen na de initiële injectie, en de aanwezigheid van proliferatieve geheugenhelper-T-cellen was ook prominent aanwezig (Fig. 9c en d). De totale B-celpopulatie neemt ook binnen 2-3 dagen toe, samen met de vorming van geheugen-B-cellen na 1 week toediening van de primaire dosis (Fig. 9e).

Fig. 8 Leishmania-vaccinexpressiesysteem met behulp van pET28 a(+)-vector, het rode gebied geeft de ingevoegde nucleïnezuursequentie van het vaccin aan, geflankeerd door NdeI- en XhoI-restrictieplaatsen

Interpretatie van moleculair dynamische simulatie

De beste dockingscore behaald door het TLR2-vaccincomplex werd verder geanalyseerd door NMA-ondersteunde moleculair-dynamische simulatie. De vervormbaarheid van de hoofdketting wordt weergegeven door hoge scharnieren (Fig. 10a), wat een hoge vervormbaarheid betekent. B-factor (Fig. 10b) werd berekend door NMA, wat eiwitflexibiliteit betekent op basis van atomaire verplaatsingsparameters [73]. De eigenwaarde (Fig. 10c) geeft een indicatie van de benodigde energie om de structuur te vervormen. Het TLR-2-vaccincomplex vertoont een eigenwaarde van ongeveer 7,778× 10−7. Variantie (Fig. 10d) is omgekeerd gerelateerd aan de eigenwaarde. De covariantiematrix (Fig. 10e) illustreert of paren residuen gecorreleerd (rood), niet-gecorreleerd (wit) of anti-gecorreleerd (blauw) zijn. Het elastische netwerkmodel (Fig. 10f) berekent veren tussen overeenkomstige atoomparen, waarbij punten in de grafiek worden weergegeven door een kleurgradiënt die de stijfheid of flexibiliteit van de veer aangeeft, en de donkerdere kleur weerspiegelt een stijvere veer. De resultaten van moleculair dynamische simulatie suggereerden dus dat ons voorgestelde peptidevaccin stabiel is.

Discussie

Leishmaniasis wordt beschouwd als een van de meest verwaarloosde tropische ziekten die vooral mensen treft die in door armoede geteisterde gebieden van ontwikkelingslanden, waaronder India, leven [2]. Volgens rapporten van de WHO is India endemisch voor beide vormen van de ziekte, CL en VL. CL veroorzaakt door L. tropica en L. major komt voor in de noordwestelijke staten van India, waarbij Punjab en Rajasthan de brandpunten zijn (https://www.who.int/leishmaniasis/last/Leishmaniasis_India/en/ ). Bovendien is leishmaniasis, nu de epidemie van het menselijk immunodeficiëntievirus (HIV) over de hele wereld steeds vaker voorkomt, naar voren gekomen als een opportunistische ziekteverwekker bij AIDS-patiënten, waardoor de situatie nog verschrikkelijker wordt [22, 38]. In de huidige studie wilden we een nieuw polyvalent algemeen vaccin voor leishmaniasis ontwerpen dat heterologe bescherming zou kunnen bieden tegen veel voorkomende pathogene parasietsoorten. We selecteerden twaalf Leishmania-specifieke eiwitten die vijf pathogene stammen van de parasiet omvatten die VL- en CL-infecties bij mensen veroorzaken. Deze eiwitten waren al beoordeeld op hun rol in virulentie en immunogeniciteit en hun potentieel als vaccinkandidaten in verschillende immunologische onderzoeken[1, 8–10, 75]. Daarom zou een vaccinconstruct dat in silico is ontworpen door het incorporeren van dergelijke goed gekarakteriseerde en sterk geconserveerde immunogene eiwitten van verschillende pathogene soorten van Leishmania kruisimmuniteit kunnen bieden tegen alle vormen van menselijke leishmaniasis (voornamelijk VL en CL) en zou daarom kunnen worden gebruikt voor een algemeen vaccinatieprogramma om Leishmania-infecties bij mensen te voorkomen. De geselecteerde eiwitten werden primair gescreend op de aanwezigheid van potentiële CTL- en HTL-epitopen. Detectie van T-celepitopen is belangrijk omdat T-cellen alleen antigenen kunnen herkennen wanneer ze worden verwerkt via de endogene of exogene route, gecomplexeerd met MHC klasse I- of MHC klasse II-moleculen, en vervolgens worden gepresenteerd aan de T-celreceptoren door de antigeenpresenterende cellen. APC's). MHC-I is specifiek voor CD8+CTL's, terwijl MHC-II specifiek bindt aan CD4+HTL-receptoren. Identificatie van CTL-epitopen werd strikt uitgevoerd door gelijktijdig gebruik te maken van twee onafhankelijke servers. Alleen de door beide servers voorspelde epitopen met significant hogere MHC-bindingsaffiniteiten werden uiteindelijk in het vaccinpeptide opgenomen. Geïdentificeerde HTL-epitopen werden verder geëvalueerd op hun cytokine-inducerende capaciteiten door gebruik te maken van drie webservers. Degenen die de productie van een grote verscheidenheid aan cytokinen konden stimuleren, namelijk IFN-, IL{{20}} en IL-10, werden geselecteerd voor het ontwerpen van het chimere peptidevaccin om ervoor te zorgen dat het zou de productie van al deze parasietspecifieke cytokinen in de gastheer op gang brengen. Dit is van het grootste belang omdat Kedzierski en collega's hadden voorgesteld dat de uitscheiding van IL-10 net zo belangrijk is als de uitscheiding van IFN - om te bepalen of een vaccin een beschermende immuunrespons kan opwekken en dat er geen goede immuniteit wordt geïnduceerd als IL -10 niveaus zijn niet proportioneel verhoogd [8, 75]. De exclusieve CTL- en HTL-epitopen werden vervolgens gefuseerd door gebruik te maken van AAY- en GPGPG-linkers om het chimere peptide te construeren. Er is eerder gerapporteerd dat AAY- en GPGPG-linkers bruikbaar zijn voor het ontwerpen van vaccins met meerdere epitopen, omdat ze minimale immunogeniciteit van de verbindingen mogelijk maken en de verwerking en presentatie van geselecteerde epitopen door MHC-II vergemakkelijken [6, 28, 71]. De adjuvans-alfaketen van menselijk IL-12 werd via de EAAK-linker aan het N-uiteinde van het resulterende peptide gekoppeld. IL-12 werd gekozen als adjuvans omdat het een van de meest effectieve adjuvantia is voor het Leishmania-vaccin in diermodellen, zoals gedocumenteerd in eerdere immunogene onderzoeken [3, 37, 71]. Omdat het vaccin bedoeld is voor menselijke toediening, wordt verwacht dat het opnemen van menselijk IL-12 als natuurlijk adjuvans in plaats van een synthetische TLR-agonist de immuniteit zal versterken zonder nadelige bijwerkingen te veroorzaken. De rol van IL-12 als algemeen adjuvans voor vaccins wordt ook onderstreept vanwege de potentie ervan bij het versterken van zowel eiwit- als polysacharide-vaccin-antilichaamreacties en het induceren van adequate lokale ontsteking die IgG-exsudatie mogelijk maakt, wat leidt tot een verhoogde immuunrespons [72]. EAAK-linker werd toegevoegd om een ​​hogere expressiesnelheid te bereiken en om de biologische functie van het fusiepeptide te bevorderen door de interactie tussen de vaccindomeinen te beperken [76, 77]. Immuno-informatische analyse toonde aan dat ons vaccinconstruct veel lineaire B-celepitopen heeft die zeer wenselijk zijn voor een vaccin dat is gemaakt voor immunoprofylactisch gebruik. Opnieuw hebben we twee verschillende tools gebruikt voor nauwkeurigere voorspellingen. Beide servers voorspelden voldoende B-celepitopen in de vaccinsequentie. Er werd voorspeld dat het ontworpen vaccin niet-allergeen, niet-toxisch en voldoende immunogeen zou zijn om een ​​goede immuunreactie op te wekken. Daaropvolgende fysisch-chemische analyse onthulde dat het vaccinpeptide enigszins zuur was (pI 5,98) met een aanzienlijk hogere alifatische index (78,34), wat duidt op de thermostabiele aard ervan. Een negatieve GRAVY-waarde (-0,14) geeft aan dat het peptide hydrofiel is, wat verder bijdraagt ​​aan de potentie ervan als vaccin. De secundaire structurele elementen van het vaccin werden bepaald door de PSIPRED v 4.0-server, een van de meest nauwkeurige en meest gebruikte rekenmethoden voor het voorspellen van de secundaire structuur van eiwitten. Bovendien werd de 3D-structuur voor het ontworpen peptide ook voorspeld met behulp van de I-TASSER-server die gedetailleerde informatie opleverde over de coördinaten van de belangrijke residuen van het eiwit, wat van het allergrootste belang is om de dynamiek, bioactiviteit en interactie van het vaccin te bestuderen. met andere liganden. De initiële tertiaire structuur werd verfijnd en gevalideerd door gebruik te maken van validatietools voor de eiwitstructuur om potentiële fouten in de zijketen of ruggengraat van het voorspelde model te lokaliseren en te corrigeren. Ramachandran-plotanalyse toonde aan dat meer dan 90% van de residuen van het verfijnde model binnen het toegestane gebied vallen met een klein percentage uitschieters, terwijl de ERRAT-server een kwaliteitsfactor van 43.542 liet zien, die allemaal impliciet zijn voor een bevredigende modelkwaliteit. Het gevalideerde 3D-model bleek door de ElliPro-server een voldoende aantal conformationele B-cel-epitopen te hebben, wat impliceert dat het een wenselijke B-celrespons zou kunnen genereren en de productie van specifieke antilichamen in de gastheer zou kunnen stimuleren. B-celactivatie is ook cruciaal in het immunologische geheugen en verantwoordelijk voor langdurige immuniteit bij gevaccineerde individuen. De interactie van het vaccin met de immuunreceptoren (TLR’s) werd ook geëvalueerd door dockinganalyses uit te voeren. Het vaccinpeptide bleek de hoogste affiniteit te hebben voor TLR-2, gevolgd door TLR-5, hoewel het in mindere mate met andere TLR's kon binden. De interactie met TLR's is essentieel voor het opwekken van beschermende immuniteit, aangezien eerdere onderzoeken met diermodellen documenteerden dat verschillende soorten Leishmania of hun antigene componenten interageren met verschillende TLR's, wat leidt tot een intense immuunrespons bij uitgedaagde gastheren. Om te voldoen aan de vereisten voor een bevredigende expressie van het recombinante vaccineiwit in het E. coli (K12) gastheersysteem, werd codonoptimalisatie uitgevoerd door toepassing van de JCat-tool die de CAI- en de GC-inhoud van de sequentie aanpaste, waardoor deze geschikt werd voor expressie in E coli. In silico-klonering werd ook uitgevoerd met behulp van de op plasmiden gebaseerde expressievector pET28a(+) om de haalbaarheid van de sequentie voor klonering en overexpressie aan te tonen om verhoogde productie van recombinant vaccineiwit te bereiken. Er werd een voorspelling gedaan van de secundaire structuur van het mRNA dat wordt gecodeerd door de chimere gensequentie om de stabiliteit aan te tonen van de gevouwen conformatie van het mRNA die het efficiënte translatieproces in de bacteriële gastheer zal beïnvloeden. Stabiliserende mutaties werden gecreëerd door nieuwe disulfidebindingen in het vaccineiwit toe te voegen, omdat dit zou bijdragen aan de sterkte van het natieve eiwit, waardoor het vatbaar werd voor aanvullende biochemische, immunologische en biotechnologische onderzoeken.

Fig. 9 C-immsim servergebaseerde immuunsimulatie. a Totale antigeen- en respectieve antilichaamgeneratie, b cytokineproductieprofiel, c en d generatie van helper-T-cellen en totaal (actieve en rustende) cytotoxische T-lymfocytentelling, e B-celrespons na toediening van het vaccin

Fig. 10 Moleculair dynamische simulatie. a De vervormbaarheid van de hoofdketen aangegeven door scharnieren, b NMA genereerde B-factor die eiwitstabiliteit toont, c eigenwaarde om de structuur van het dockingcomplex te vervormen, d individueel (paars)% van de variantie en cumulatief (groen) van de structuur, e covariantiematrix gecorreleerd (rood), niet-gecorreleerd (wit) of anti-gecorreleerd (blauw) tussen paren atomen, f-elastisch netwerkmodel dat verbonden veren tussen paren van het atoom toont, donkergrijs geeft stijve veren aan en vice versa

voordelen van cistanche-supplementen: verhoging van de immuniteit

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Conclusie

In het huidige werk hebben we een omgekeerde vaccinologiebenadering benut voor het in silico ontwerpen van een polyvalent multi-subunit peptidevaccin tegen menselijke leishmaniasis (zowel visceraal als cutaan) dat mogelijk heterologe bescherming zou kunnen bieden tegen gewone Leishmania-parasieten die mensen infecteren en, kan dus worden beschouwd als een breed spectrum van aard. Hetzelfde zou kunnen worden gebruikt voor een algemeen vaccinatieprogramma om de ziekte onder controle te houden en uit te roeien als een aanvullende strategie naast de momenteel beschikbare chemotherapeutische middelen. Daarnaast hebben we IL-12 gebruikt als natuurlijk adjuvans in plaats van enig niet-gehumaniseerd synthetisch peptide. Het gebruik van IL-12 als adjuvans zal de immunogeniciteit van het vaccin verhogen zonder nadelige bijwerkingen in het gastlichaam te veroorzaken. Op voorwaarde dat het vaccinpeptide is samengesteld uit een verscheidenheid aan sterk geconserveerde en potentieel immunogene peptiden verkregen uit vijf soorten pathogene Leishmania, is het nuttig om een ​​kruisimmuniteit op te wekken bij gevaccineerde individuen, waardoor het ook therapeutische en profylactische voordelen heeft. Uit verschillende strenge immuno-informatica-analyses, waarbij gebruik werd gemaakt van verschillende computerhulpmiddelen, is gebleken dat het voorgestelde vaccin immunogeen, stabiel en reproduceerbaar is als een recombinant eiwit en veilig is voor proeven op mensen. Niettemin moet er nog experimentele validatie worden uitgevoerd om een ​​goede opwekking van beschermende en langdurige immuniteit te garanderen en toxiciteit uit te sluiten.

Referenties

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM et al. (2018) Peptidevaccins voor leishmaniasis. Voor Immunol 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Sociale en economische last van menselijke leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Status van vaccinonderzoek en ontwikkeling van vaccins voor leishmaniasis. Vaccin 34(26):2992–2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI en Dube A (2014) Viscerale leishmaniasis: vooruitgang in de ontwikkeling van vaccins via klassieke en moleculaire benaderingen. Voorste Immunol 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Onderzoek naar secretoire eiwitten van Leishmania om B- en T-cel multi-epitoop subeenheidvaccin te ontwerpen met behulp van een immuno-informatica-aanpak. Sci Rep 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) KSAC, het eerste gedefinieerde polyproteïnevaccinkandidaat voor viscerale leishmaniasis. Clin-vaccin Immunol 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Leishmaniasisvaccin: waar zijn we vandaag? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Vaccinkandidaten voor leishmaniasis: een overzicht. Int Immunopharmacol 11(10):1464–1488. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Vaccins van de tweede generatie tegen leishmaniasis. Trends Parasitol 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M et al (2018) Antigeniciteit van door Leishmania geactiveerd c-kinase-antigeen (LACK) in mononucleair menselijk perifeer bloed cellen, en het beschermende effect van prime-boost-vaccinatie met pCI-neo-LACK plus verzwakte vaccinia-virussen die LACK tot expressie brengen bij hamsters. Voor Immunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Leishmania major LACK-antigeen is vereist voor efficiënte parasitering van gewervelde dieren. J Exp Med 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Kinetoplastid-membraaneiwit -11 als vaccinkandidaat en virulentiefactor bij Leishmania. Voor Immunol 6:524. https://doi.org/10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Gerichte gendeletie in Leishmania major identificeert leishmanolysine (GP63) als een virulentiefactor. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL et al (1993) Recombinante vacciniavirussen die GP46/M-2 tot expressie brengen, beschermen tegen Leishmania-infectie. Infecteer Immun 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Met hitteschokeiwit verrijkte promastigoten van Leishmania major die Th2-immuunrespons induceren bij BALB / c-muizen. Iran Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Onderzoek naar de exportroute van Leishmania hydrofiel geacyleerd oppervlakteproteïne B (HASPB) met behulp van live-celbeeldvormingsmethoden. Methoden Mol Biol 1459: 191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Een overzicht van kinetoplastide parafagellar staaf. J Parasit Dis 39(4):589–595. https:// doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: cysteïneproteasen zijn essentieel voor groei en pathogeniciteit. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Rol van Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cysteïneprotease in de overleving van reisparasieten: onderzoeken door genverstoring en antisense mRNA-remming. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) De rol van leishmania-proteofosfoglycanen bij de overdracht van zandvliegen en infectie van de zoogdiergastheer. Voorzijde Microbiol 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Identificatie van nieuwe Leishmania donovani-antigenen die helpen bij het definiëren van correlaten van vaccin-gemedieerde bescherming bij viscerale leishmaniasis. PLoS One 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) In silico-studie van Leishmania donovani - tubuline en remmers. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579