Invloed van in vitro menselijke spijsverteringssimulatie op de fenolische inhoud en biologische activiteiten van de waterige extracten van Turkse cistussoorten, deel 2

Neem contact oposcar.xiao@wecistanche.comvoor meer informatie

Op te sommen

Het waterige extract van C.salvifolius vertoonde een betere remmende werking op spijsverteringsenzymen dan de extracten van andere soorten. Bovendien onthulden IN-monsters van alle waterige extracten lagere enzymremmende activiteiten in vergelijking met ND-monsters.

2.4.AGE's remmende activiteit

Zoals weergegeven in Tabel 4, werd concentratieafhankelijke AGE-remmende activiteit waargenomen in alle waterige extracten. ND-monsters van CCA, CPA en CSA vertoonden een betere remmende activiteit dan de referentieverbinding quercetine in zowel 0,5- als 1 mg/ml-concentraties. Alleen C.saluifolius-extract vertoonde echter een betere remmende activiteit dan quercetine onder IN-monsters van de extracten. Biologisch beschikbare monsters van waterige extracten vertoonden lagere AGE-remmende activiteiten in vergelijking met niet-verteerde monsters. Volgens de resultaten bezat het ND-monster van waterig extract van C.salvifolius de hoogste AGE-remmende activiteit. Het IN-monster van waterig extract van C.monspeliensis vertoonde echter het zwakste AGE-remmingspotentieel in geteste concentraties.

Klik hier om meer te weten

3. Discussie

Vrije radicalen kunnen eiwitten, lipiden of DNA aanvallen om een ​​elektron te verkrijgen, wat kan leiden tot verschillende gezondheidsproblemen. Om deze reden is het essentieel om het antioxidantsysteem van het lichaam en de vrije radicalen die door oxidatie worden gevormd, in evenwicht te brengen. Bij verslechtering van dit evenwicht ontstaat oxidatieve stress [29]. Oxidatieve stress is een van de belangrijkste factoren die leiden tot verschillende chronische aandoeningen zoals kanker, diabetes, hart- en vaatziekten, de ziekte van Alzheimer, enz. Hoewel er in het menselijk lichaam zelf-antioxidantsystemen zijn om deoxidatiefschade aan weefsels en organen, kunnen deze afweersystemen hun efficiëntie verliezen door verschillende omstandigheden zoals overconsumptie van alcohol, roken, stress, chronisch drugsgebruik en straling, enz. [30]. Verschillende wetenschappelijke rapporten hebben aangetoond dat secundaire plantmetabolieten een belangrijke rol spelen bij het voorkomen van oxidatieve stress en de schadelijke effecten ervan [13,14,31]. de meeste onderzoeken. Het is echter algemeen bekend dat de secundaire metabolieten onderhevig zijn aan structurele transformaties als gevolg van verschillende pH-omstandigheden, enzymatische activiteit en lichaamstemperatuur in het maagdarmstelsel. Bovendien zijn de chemische kenmerken van de secundaire metabolieten zoals:moleculairgewicht, polariteit en mate van binding aan macromoleculen in de plantenmatrix zijn ook belangrijke factoren die hun biologische beschikbaarheid beïnvloeden [13]. Dienovereenkomstig is absorptie van de verbindingen of hun metabolieten in de bloedbaan na inname essentieel om hun systemische fysiologische effecten uit te oefenen. In vitro simulatiemodellen voor vertering kunnen bewijs leveren voor de beoordeling van de mogelijke biologische beschikbaarheidskenmerken van stoffen. Hoewel bevestiging in proeven bij mensen nodig is om enige functionele eigenschap te claimen, worden in vitro simulatiemodellen algemeen gebruikt als alternatieven voor in vivo onderzoeken of proeven bij mensen, die vaak ethisch discutabel, arbeidsintensief, duur en tijdrovend zijn [32].

Cistanche kan de immuniteit verbeteren

Verschillende onderzoekers hebben ook het antioxidantpotentieel onderzocht van extracten die zijn bereid uit verschillende organen van Cistus-soorten. Volgens het literatuuronderzoek is dit de eerste studie over Cistus-soorten met betrekking tot de biologische beschikbaarheid van fenolische stoffen en hun impact op de antioxidantactiviteit door gebruik te maken van een in vitro verteringssimulatiemodel. Karas et al. [33] suggereerde dat 10 procent van de polyfenolische componenten onverteerd in de plantenmatrix blijft en 90 procent ervan wordt verteerd in de maag- of darmfase (respectievelijk ongeveer 48 procent en 52 procent). Zoals eerder vermeld, werden alle fenolische hoeveelheden in waterige extracten negatief beïnvloed door de in vitro menselijke verteringssimulatieprocedure. Er werden dus significante verliezen gedetecteerd in de fenolische inhoud van de biologisch beschikbare monsters van alle extracten. Bovendien waren de totale proanthocyanidineconcentraties van IN-monsters in alle waterige extracten onder de detectielimiet. Verschillende onderzoeken hebben ook geleid tot de negatieve invloed van de verteringsprocedure op fenolische verbindingen in de plantenextracten en daarmee op gerelateerde biologische activiteiten. We hebben bijvoorbeeld het totale fenolgehalte van Salvia virgata Jacq gerapporteerd. werd ook nadelig beïnvloed door de verteringsprocedure in onze vorige studie. Bovendien hadden de hoeveelheden van de belangrijkste metabolieten van het extract, namelijk rutine en rozemarijnzuur, de neiging af te nemen [13]. Daarentegen hebben verschillende studies tegenstrijdige resultaten gerapporteerd. In het onderzoek van Celeb et al. [34], ze observeerden de toename van de totale hoeveelheden fenolzuur, flavonoïde en fenolische hoeveelheden in de biologisch beschikbare monsters van methanolisch extract van Hypericum perfoliatum L. In feite hadden de belangrijkste metabolieten, quercitrine, chlorogeen en galluszuur, een biotoegankelijkheidsverhouding van meer dan 100 procent. Deze studies toonden aan dat de effecten van de verteringsprocedure kunnen variëren afhankelijk van plantaardig materiaal. Om deze verschillen te verduidelijken, is het essentieel om het werkingsmechanisme van het verteringssysteem op fenolische stoffen te beschouwen. Serra et al. [35] suggereerde dat fenolische verbindingen voornamelijk worden aangetroffen in glycosiden, polymeren en estervormen in de plantenmatrix en worden gehydrolyseerd in het spijsverteringsstelsel vóór absorptie. Verschillende factoren kunnen de structurele transformaties van de fenolische verbindingen in het maagdarmkanaal beïnvloeden. Verbindingen met hogere molecuulgewichten, zoals proanthocyanidinen of procyanidinen, moeten bijvoorbeeld worden gehydrolyseerd voordat ze in de darm worden opgenomen. De structuur van de plantenmatrix is ​​ook een prominente factor in de biologische beschikbaarheid van fenolen; fenolische verbindingen kunnen binden aan macromoleculen in de plantenmatrix, zoals vezels, eiwitten en lipidemoleculen. Zo kunnen alleen de vrijgemaakte fenolische componenten uit de matrix absorbeerbaar worden uit het maagdarmkanaal. Bovendien behoren verschillende pH-waarden en enzymatische acties van de darmmicrobiota tot de andere cruciale factoren die de transformatie in de chemische structuur van fenolische verbindingen beïnvloeden [36]. In het licht van deze gegevens kunnen we veronderstellen dat verschillende resultaten verkregen uit vergelijkbare soorten experimentele onderzoeken te wijten kunnen zijn aan de complexiteit van het spijsverteringssysteem en de samenstelling van de plantenmatrix. Zoals weergegeven in Tabel 3, vertoonden de biologisch beschikbare monsters van Cistus-extracten een zwakkere antioxidantactiviteit dan de niet-verteerde en post-maag-tegenhangers vanwege hun lagere fenolgehalte.

Bovendien vertoonden beide extracten van C. saluifolius een betere antioxidantactiviteit in DPPH-, CUPRAC-, FRAP- en TOAC-assays in vergelijking met andere soorten. Bovendien vertoonden beide extracten van C.paroiflorus een hogere DMPD-radicalenvangactiviteit dan de extracten van andere soorten. Zoals aangegeven in Tabel 1 waren de totale fenol-, flavonoïden- en fenolzuurgehaltes van C. salviifolius hoger dan in de andere monsters. Het hogere antioxidantpotentieel van de C. saloiifolius-extracten kan dus verband houden met de fenolische inhoud ervan.

Bovendien kunnen de vermindering van antioxidantpotentieel, remmende activiteiten op koolhydraatgerelateerde enzymen en AGE's van de biologisch beschikbare monsters verband houden met de afname van markerflavonoïde glycosiden. Cistus-extracten bevatten echter ook andere fenolische stoffen, zoals aangegeven in figuur 1. Daarom is een gedetailleerde chromatografische analyse van de extracten vereist om de invloed van de spijsvertering op de biologische activiteit te volgen.

Het remmende potentieel van plantenextracten op spijsverteringsenzymen heeft recentelijk meer aandacht gekregen vanwege de bezorgdheid over de veiligheid van synthetische remmers. Daarom werd het remmende effect van plantenextracten in verschillende onderzoeken bepaald, en dit effect werd over het algemeen geassocieerd met fenolische stoffen zoals flavonoïden, fenolzuren, proanthocyanidinen, enz. Sun et al. [37] suggereerde dat polyfenolische verbindingen hun remmende effecten vertonen door te binden aan de bovengenoemde enzymen met behulp van hydrofobe krachten en niet-covalente bindingen. Daarom is remming van -amylase- en -glucosidase-enzymactiviteit door polyfenolen gerelateerd aan hun moleculaire structuren. Hoewel dit interactiemechanisme is bestudeerd met behulp van verschillende technieken, zoals inhibitiekinetiek, moleculaire docking fluorescentie-quenching, enz., is er nog geen bepaalde conclusie getrokken [38]. Talrijke onderzoeken hebben echter gemeld dat remming van spijsverteringsenzymen van de plantenextracten rechtstreeks verband houdt met hun fenolgehalte. Soortgelijke onderzoeken naar de enzymremmende activiteiten van Cistus-soorten zijn ook eerder gerapporteerd. Sayah et al. [39] onderzocht de -amylase- en a-glucosidase-remmende activiteiten van de 80 procent methanolische en waterige extracten van C. monspeliensis en C. saluifolius. Hun resultaten waren in overeenstemming met de huidige studie, waaruit bleek dat waterig extract van C. salvijfolius een hogere -glucosidase IC50 ug/mL∶0}.95±0.14） en o vertoonde. -amylase（IC50 ug/mL∶217.1±0.15）remmende activiteit dan het C.monspeliensis waterige extract （IC50 ug/mL∶14.58±1.26） en （ICsn ug/mL:886.10±0.10), respectievelijk. De remmingssnelheden van beide waterige extracten op deze enzymen waren hoger dan de referentieverbinding acarbose (ICso ug/mL:18,01±2.00). Net als bij ons onderzoek vonden ze een correlatie met de enzymremmingssnelheden en de totale fenolische en flavonoïde hoeveelheden. Zowel het totale fenolgehalte als het totale flavonoïdegehalte van het waterige extract van C. salvijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE en 140.00 ± 1,15 RE, respectievelijk) waren hoger dan het waterige extract van C.monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE en 78.00±1.15 RE respectievelijk). Orhan et al. [40] onderzocht ook het remmende vermogen van het spijsverteringsenzym van 80 procent waterige en ethanolische extracten van de bladeren van C.laurifolius. Volgens hun resultaten vertoonde 80 procent ethanolisch extract (71,7 procent ± 0,6) een sterke amylaseremmende activiteit in vergelijking met waterig extract (39,3 procent ± 2,2) bij een concentratie van 1 mg / ml. Ze suggereerden dat fenolische verbindingen, vooral flavonoïden, de insulinesecretie direct beïnvloeden door bètacelapoptose te voorkomen en de antidiabetische activiteit te ondersteunen. Deze hypothese, gecorreleerd met onze resultaten, geeft aan dat het ND-monster van waterige extracten van C. salviifolius het hoogste totale flavonoïde- en fenolgehalte en de grootste o-amylase- en o-glucosidase-remmende activiteiten uitoefende. Zoals aangegeven in Tabel 4 vertoonde het waterige extract van C. salviifolius betere remmende activiteiten op spijsverteringsenzymen dan de andere extracten.

Bovendien bevatten IN-monsters van de waterige extracten lagere hoeveelheden fenol en flavonoïde dan ND-monsters en onthulden dus lagere enzymremmende activiteiten in het huidige werk. Hoewel de fenolische inhoud van de extracten negatief werd beïnvloed door de verteringsprocedure, vertoonden ze nog steeds een significante remmende activiteit van het spijsverteringsenzym. In verschillende onderzoeken werden flavonoïde glycosiden gerapporteerd als de belangrijkste metabolieten van plantenextracten met sterkea-amylaseen -glucosidase-remmend potentieel [41-43]Hoewel het remmende mechanisme van fenolische verbindingen op de spijsverteringsenzymen nog niet is onthuld, zijn er structuur-activiteitsrelatiestudies uitgevoerd op sommige fenolische componenten zoals flavonoïden, fenolzuren, proanthocyanidinen en tannines Structuur-activiteitsrelatiestudies over flavonoïden toonden aan dat C2=C3 dubbele binding van C-ring het verteringsenzymremmingsvermogen van dergelijke verbindingen versterkt. Omdat deze binding de elektronendichtheid verhoogt, wordt de sterkte van de interactie tussen de flavonoïde en het enzym verhoogd [44]. Bovendien vergemakkelijken hydroxylgroepen op C-5 en C-7 het o-amylase-remmende vermogen van flavonoïden. Er werd ook gesuggereerd dat hydroxylering van het skelet van flavonoïden een positief effect heeft op hun a-amylase en-glucosidase-enzymremmende potenties[45]. Zoals eerder aangegeven, waren alle markerflavonoïden in de huidige studie flavonolglycosiden die deze hierboven beschreven structurele vereisten droegen. Na een in vitro verteringsprocedure namen hun gerelateerde activiteiten echter significant af in biologisch beschikbare monsters van de waterige extracten.

Over het algemeen is het remmende vermogen van de plantenextracten op AGE's gerelateerd aan verschillende factoren, namelijk hun fenolgehalte, antioxidantpotentieel, metaalchelerende eigenschappen, eiwitinteracties en AGE-receptorblokkerende activiteiten [13]. Zoals weergegeven in Tabel 4 vertoonden biologisch beschikbare monsters van de waterige extracten lagere AGE-remmende activiteiten in vergelijking met ND-monsters, aangezien de in vitro verteringsprocedure het fenolgehalte van de extracten nadelig beïnvloedde. Volgens de huidige onderzoeksresultaten bezat het ND-monster van waterig extract van C.salvifolius de hoogste AGE-remmende activiteit evenals het totale fenol- en flavonoïdegehalte. Ter vergelijking: IN-monster van waterig extract van C.monspeliensis vertoonde het zwakste AGE-remmingspotentieel, wat kan worden toegeschreven aan het laagste totale flavonoïde- en fenolgehalte. Omdat flavonoïden een wijdverbreide distributie hebben in plantenextracten, fruit, groenten en dranken, hebben verschillende onderzoeken het remmingspotentieel van flavonoïden op AGE-formaties geïntensiveerd. Dezelfde flavonoïden die in deze studie als markerfenolen werden toegewezen, werden ook in andere studies vermeld als markerverbindingen[46-48].

Net als bij remming van spijsverteringsenzymen, werden AGE-remmende activiteiten van flavonoïden gestimuleerd door de dubbele C2=C3-binding en hydroxylering van A- en C-ringen. De aanhechting van suiker aan het flavonoïde skelet leidt echter tot verminderde remmende activiteit [49]. Aan de andere kant, Cervantes-Lauren et al. [50] suggereerde dat flavon-3-van glycosiden een groter AGE-remmingspotentieel hadden dan de andere flavonoïde glycosiden. Deze hypothese kan een verklaring zijn voor de verminderde AGE-remming in biologisch beschikbare monsters. Quercitrine en hyperoside werden bijvoorbeeld niet gedetecteerd in biologisch beschikbare monsters van het waterige extract van C.monspeliensis, wat de reden is voor de lagere activiteit van IN-monsters van C.monspeliensis in vergelijking met de extracten van andere soorten. Hoewel quercitrine niet werd gedetecteerd in het waterige extract van C. saloifolius, kunnen significant hogere hoeveelheden hyperoside en salidroside de oorzaak zijn van de hoge AGE-remmingsactiviteit. Over het algemeen werd een positieve correlatie waargenomen tussen de markerflavonoïde-inhoud van de monsters en hun remmende potentieel op AGE's.

4. Materiaal en methoden

4.1.Chemische stoffen

Alle referenties, enzymen en chemicaliën die in de experimenten werden gebruikt, werden gekocht bij Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). In de experimenten werden materialen van analytische kwaliteit gebruikt.

4.2. Plantenmonsters

Luchtdelen van C.creticus en C.saloifolius werden verzameld vanaf de campus van Yeditepe University (Kayisdagi, Istanbul) in de laatste week van april 2018. Bovengrondse delen van C.mon-speliensis en C.paroiflorus werden verzameld in de buurt van AlacatI Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir in de tweede week van mei 2018. Bovengrondse delen van C. laurifolius werden verzameld op de weg Kemer-Doganhisar, Konya, in de eerste week van juni 2018. Prof. Dr. Erdem Yesilada heeft plantaardig materiaal geverifieerd. Vouchermonsters voor C.creticus (YEF18013), C.lauri-folios (YEF18017), C.monspeliensis (YEF18015), C.paroifforus (YEF18016) en C.salvifolus (YEF18014) werden bewaard in het Herbarium van de afdeling Farmacognosie, Faculteit Farmacie, Yeditepe University, Istanbul, Turkije.

4.3. Extractieprocedure

Er werd gekozen voor waterige extractie omdat het in de traditionele geneeskunde vaak wordt gebruikt als bereidingstechniek. De grof aan de lucht gedroogde en verpoederde bovengrondse delen vanCistanchesoorten (100 g) werden geëxtraheerd met heet gedestilleerd water (80 graden, 1,5 l) door een schudapparaat gedurende 15 minuten te gebruiken. Vervolgens werden waterige extracten door een filtreerpapier gefiltreerd en onder verminderde druk drooggedampt. Nadat de lyofilisatieprocedure was voltooid, werden extracten opgelost in gedestilleerd water voor verdere verwerking (niet-verteerd monster: ND) (de opbrengst van extracten: 13,04 procent voor C.creticus, 15,7 procent voor C.laurifolius, 12,8 procent voor C.monspeliensis ,14,94 procent voor C.parviflorus,14,74 procent voor C.salvifolius).

4.4.In vitro simulatiemethode voor menselijke spijsvertering

Het simulatiemodel voor menselijke spijsvertering werd in vitro toegepast op Cistus-monsters, volgens de methode die eerder door Celeb et al. werd beschreven. [34]. Eerst werden 1 g NaCl en 1,6 g pepsine opgelost in 500 ml gedestilleerd water om een ​​gesimuleerde maagvloeistofoplossing te verkrijgen (SGG). Later werd de pH van de SGF-oplossing met HCl (5 M) op 2 gebracht; 17,5 ml van deze oplossing werd gemengd met 2,5 ml plantenmonsters en dit mengsel werd gedurende 2 uur in het schudwaterbad van 37 graden gebracht om imiteren de peristaltische bewegingen van het spijsverteringssysteem. Na 2 uur werden de monsters in een ijsbad geplaatst om de enzymatische reacties te inactiveren; 2 ml van de monsters werd apart gehouden als een "post-gastrisch" (P) monster voor verdere experimenten. Een cellulosedialysemembraan geladen met een juiste hoeveelheid NaHCO3 (1 M, pH 7) bevond zich in de koude monsteroplossingen; dus gastro-intestinale absorptie werd nagebootst. Vervolgens werd 4,5 ml galzuur/pancreatineoplossing met de oplossingen gecombineerd en het mengsel werd nog 2 uur bij 37°C geïncubeerd. Ten slotte werd de vloeistof in het dialysemembraan verkregen als het "biologisch beschikbare" monster (IN). Nadat de procedure was afgelopen, werden alle monsters bewaard op -20 graden voor verdere experimenten. 4.5.In vitro schatting van fenolprofiel

4.5.1.Totale fenolinhoudstest

Spectrofotometrische bepaling van het totale fenolgehalte van de monsters werd uitgevoerd in een 96-putjesplaatsjabloon volgens de methode die eerder is beschreven door Barak et al.【32】; 75 L NagCO3（20 procent in H2O） werd toegevoegd aan 20 L vers bereide monster- en referentieoplossingen. Vervolgens werd 100 L Folin-Ciocalteu-reagens met het mengsel gecombineerd. Na een incubatieperiode van 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker, werd de absorptie gemeten bij 690 nm. Galluszuur werd gebruikt als referentieoplossing bij verschillende concentraties om een ​​ijkcurve vast te stellen en het totale fenolgehalte werd uitgedrukt als galluszuurequivalenten (GAE).

4.5.2.Totale flavonoïde inhoudsanalyse

Spectrofotometrische bepaling van het totale flavonoïdegehalte van de monsters werd uitgevoerd in een 96-well plate-sjabloon in overeenstemming met de eerder uitgelegde methode door Bardakci et al. [51]; 150 L 75 procent ethanol, 10 uL aluminiumchloride en 10 L 1M natriumacetaattrihydraat werden afzonderlijk gecombineerd met 50 μL monster- en referentieoplossingen. Vervolgens werden deze mengsels gedurende 30 minuten bij donkere kamertemperatuur geïncubeerd. Na de incubatieperiode werd de absorptie berekend bij 405 nm.Quercetinewerd gebruikt als een referentieoplossing in verschillende concentraties om een ​​kalibratiecurve vast te stellen en het totale flavonoïdegehalte werd weergegeven als quercetine-equivalenten (QE). 4.5.3.Totaal fenolzuurgehalte-assay

Het totale fenolzuurgehalte van de monsters werd spectrofotometrisch gemeten volgens de procedure die eerder werd beschreven door Barak et al. [52]. Ten eerste werden de juiste hoeveelheden natriumnitriet en natriummolybdaat opgelost in gedestilleerd water om het Arnow-reagens te verkrijgen. Vervolgens werd 1 ml van de monsters gecombineerd met 1 ml Arnow-reagens, 1 ml 0,1 M HCl en 1 ml 1 M NaOH, afzonderlijk. Daarna werd het volume van het mengsel met gedestilleerd water op 10 ml gebracht en werd de absorptie onmiddellijk afgelezen bij 490 nm. Cafeïnezuur werd gebruikt als referentieoplossing bij verschillende concentraties om een ​​ijkcurve te krijgen, en het totale fenolzuurgehalte werd gegeven als cafeïnezuurequivalenten (CAE).

4.5.4.Totale proanthocyanidine-gehaltetest

Spectrofotometrische bepaling van het totale proanthocyanidinegehalte van de monsters werd uitgevoerd in een 96-putjesplaatsjabloon volgens de methode van Barak et al. [1]Kortom, 25 L van de monsteroplossingen werd gemengd met respectievelijk 150 L 4 procent vanilline en 75 L HCl-oplossingen (32 procent). Na 15 min incubatietijd bij donkere kamertemperatuur werd de absorptie bijgesteld tot 492 nm. Catechinehydraat werd gebruikt als referentieoplossing bij verschillende concentraties om een ​​ijkcurve te verkrijgen. Methanol werd als controleoplossing gebruikt. Het totale proanthocyanidinegehalte van de monsters werd aangegeven als catechine-equivalenten (CE).

4.6. Vrije radicalen wegvangende activiteitstesten 4.6.1.DPPH Radicale wegvangende activiteitstest

DPPH radicale wegvangende activiteit van de monsters werd bepaald in een 96-well plate template volgens de methode die is aangepast door Celeb et al. [53]. Eerst werd 150 uM DPPH-oplossing vers bereid. Vervolgens werd 200 L DPPH-oplossing gemengd met 25 L monsteroplossingen. Vervolgens werd dit mengsel gedurende 50 minuten bij donkere kamertemperatuur geïncubeerd. De absorptie werd berekend bij 540 nm. Gebutyleerd hydroxytolueen (BHT) werd in verschillende concentraties als referentieoplossing gebruikt. Methanol werd gebruikt als controleoplossing. De activiteit van monsters werd gepresenteerd als EC50, overeenkomend met de concentratie die 50 procent activiteit vertoonde.

4.6.2.DMPD Radical Scavenging Activity Assay

DMPD plus (N,N-dimethyl-p-fenyleendiamine) radicaalvangende activiteit van de monsters werd uitgevoerd in een 96-putjesplaatsjabloon volgens de methode die eerder is beschreven door Inan et al. [13]. Ten eerste, 10{{10}} mM DMPD plus-oplossing, 0,05 M FeCl; 6H20-oplossing en 0,01 M acetaatbuffer werden vers bereid. Vervolgens 1 ml DMPD-oplossing, 100 ml acetaatbuffer en 0,2 ml FeCl; 6H2O-oplossing werd gemengd en later werd 15 L monsteroplossingen gecombineerd met 210 μL van dit mengsel. Na de incubatieperiode bij donkere kamertemperatuur gedurende 50 minuten werd de absorptie gemeten bij 492 nm. Trolox werd gebruikt als referentieoplossing in verschillende concentraties om een ​​ijkcurve te verkrijgen. Concentraties van de monsteroplossingen waren 1 mg/ml. DMPD radicale wegvangende activiteiten van de monsters werden vermeld als Trolox-equivalenten (TE). 4.7.Metaalverlagende activiteitstesten

4.7.1.Ijzerreducerende antioxidantkrachttest (FRAP)

Bepaling van de FRAP-activiteit van de monsters werd bereikt in een sjabloon met 96 putjes volgens de procedure die eerder werd gerapporteerd door Bardakci et al. [54]. Aan het begin van het experiment werd FRAP-reagens gevormd door acetaatbuffer, ferri-tripyridyltriazine en FeCl te mengen; 6H2O-oplossingen. Daarna werd het FRAP-reagens 30min in de 37 graden oven geplaatst. Vervolgens werd 10 L van de monsteroplossingen gecombineerd met respectievelijk 30 uL gedestilleerd water en 260 L FRAP-reagens. Na incubatietijd bij 37°C gedurende 30 min. werd de absorptie ingesteld op 593 nm. Een standaardcurve werd gebouwd door verschillende molariteiten van ferrosulfaat (0,25-2 mM) oplossing te gebruiken om de resultaten te evalueren. BHT werd in verschillende concentraties als referentieoplossing gebruikt. FRAP-activiteiten van de monsters werden gepresenteerd als mM FeS04 in 1 g droog extract.

4.7.2.Cupric-reducerende antioxidantcapaciteitstest (CUPRAC)

De CUPRAC-activiteit van de monsters werd bepaald in een 96-well plate-sjabloon volgens de methode die is aangepast door Celeb et al. 【31】; 85 L CuSO4 （10 mM）, neocupraine en ammoniumacetaatoplossingen en 51 uL gedestilleerd water werden afzonderlijk toegevoegd aan 43 uL monsteroplossingen. Na een incubatieperiode (20 min) bij 50 graden in een waterbad, werd de absorptie gemeten bij 450 nm. Ascorbinezuur werd gebruikt als referentieoplossing in verschillende concentraties om een ​​ijkcurve te verkrijgen. De CUPRAC-activiteiten van de monsters werden gepresenteerd als ascorbinezuurequivalenten (AAE). 4.8. Total Antioxidant Activity Assay (TOAC) De bepaling van de totale antioxidantactiviteit van de monsters werd uitgevoerd in een 96-putjesplaatsjabloon volgens de procedure van Celeb et al. [55]. Eerst werd een bepaalde hoeveelheid monobasisch natriumfosfaat, ammoniummolybdaattetrahydraat en zwavelzuur gemengd om de TOAC-oplossing te verkrijgen. Vervolgens werd 300 L TOAC-oplossing toegevoegd aan 30 L monsteroplossingen. Na de incubatieperiode bij 95 graden in een waterbad gedurende 90 min, werd de absorptie bepaald bij 690 nm. Ascorbinezuur werd gebruikt als referentieoplossing in verschillende concentraties om een ​​ijkcurve te verkrijgen. TOAC-activiteiten van de monsters werden weergegeven als ascorbinezuurequivalenten (AAE). 4.9. Schatting van de biologische beschikbaarheidsindex

De biologische beschikbaarheidsindex (BAvI) werd berekend volgens de theoretische vergelijking beschreven door Inan et al. [13]: BAVI=CIN/CND De "biologische beschikbaarheidsindex" (BAvI) werd beschreven als de verhouding van het aantal fenolen in het biologisch beschikbare monster (IN) tot dat in het niet-verteerde monster (ND). 4.10. Kwantificering van markerflavonoïden door HPTLC

De kwantitatieve bepaling van salidroside-, hyperoside- en quercitrineconcentraties in alle simulatiemonsters (ND, PG, IN) van de waterige extracten van Cistus-soorten werd uitgevoerd door middel van hoogwaardige dunnelaagchromatografie (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Zwitserland) volgens de methode gevalideerd door Guzelmeric et al. [16]. Hyperoside, salidroside en quercitrine werden bereid in concentraties van 25,50 en 100 ug/ml, en de concentraties van vers bereide monsteroplossingen werden aangepast tot 10 mg/ml. Deze oplossingen werden aangebracht op normale fase silicagelplaten met glazen achterkant (20 cm x 10 cm, Merck, Darmstadt, Duitsland） met bepaalde volumes （1-5 L standaardoplossingen en 5 uL monsteroplossingen） met behulp van 100 μL spuiten （ Hamilton, Bonaduz, Zwitserland）. De applicatieprocedure werd uitgevoerd met een Linomat 5 monsterapplicator. Het ontwikkelingsproces werd uitgevoerd in een Automated Development Chamber (ADC 2) en ethylacetaat: dichloormethaan. azijnzuur. mierenzuur: water (10:25:10 :10:10:10me) werd geselecteerd als mobiele fase. Vervolgens werden de platen gederivatiseerd met Natural Product Reagent (NPR) (1 g difenylboorzuur 2-aminoethylesterine 200 ml ethylacetaat) in de immersie-inrichting (CAMAG).hyperosideen quercitrine werden spectrofotometrisch geanalyseerd bij 260 nm, de hoeveelheid salidroside werd gemeten bij 330 nm door een UV-scanner. Rf-waarden van de standaarden werden bepaald als hyperoside （≈0.35）, quercitrine （≈0.45）, tiliroside （≈0.65）. De correlatiecoëfficiënten（r2） bleken ×0.98 te zijn voor de kwantificering van de markerflavonoïden.

4.11.Remmende activiteit op diabetesgerelateerde enzymen

4.11.1. -Glucosidase remmende activiteit

-glucosidase-remmende activiteiten van de niet-verteerde en biologisch beschikbare monsters verkregen uit de waterige extracten van Cistus-soorten werden onderzocht volgens de methode die eerder werd uitgelegd door Balan et al. [56]. Ten eerste werden de juiste hoeveelheden mononatriumfosfaat en dinatriumfosfaat gemengd met het verkrijgen van 100mM fosfaatbuffer (pH7). o--glucosidase-enzym werd opgelost in fosfaatbuffer om de a-glucosidase-oplossing （0.2U/mL） te verkrijgen. Vervolgens werden 170 L fosfaatbuffer, 20 μL van de -glucosidase-oplossing en 20 L monsteroplossingen gecombineerd en gedurende 15 minuten in een oven van 37 graden geïncubeerd. Daarna werd 20 μL 2,5 mM p-nitrofenyl- -D-glucopyranoside-oplossing in 100 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0) aan het mengsel toegevoegd en werd nog een incubatieperiode uitgevoerd bij 37 graad gedurende 15 min. Vervolgens werd 80 L 0,2 M natriumcarbonaatoplossing aan het mengsel toegevoegd om de reactie te beëindigen. Absorptie werd gemeten bij 405 nm. Quercetine-oplossing in verschillende concentraties werd als referentie gebruikt. De resultaten werden geschat als het percentage remmende activiteit in concentraties van 1 mg/ml en 0,5 mg/ml van ND- en IN-monsters van de waterige extracten van Cistus-soorten. 4.11.2. -Amylaseremmende activiteit o-amylaseremmende activiteit van niet-verteerde en biologisch beschikbare monsters verkregen uit de waterige extracten van Cistus-soorten werd bepaald door de procedure te volgen die eerder is beschreven door Balan et al. [56]. Spectrofotometrische bepaling van a-amylase-remmende activiteiten van de monsters werd uitgevoerd door DNS-reagens (3,5-dinitrosalicylzuur) te gebruiken. Zoals vermeld in de methode, wordt maltose gevormd door de omzetting van het zetmeel en verandert de gele kleur van alkalische DNS in de oranjerode kleur door maltose geproduceerd uit zetmeel. Zo werd 96 mM DNS-oplossing bereid uit het mengsel van natriumkaliumtartraatoplossing (opgelost in 2 M NaOH) en een bepaalde hoeveelheid DNS (opgelost in gedestilleerd water). Vervolgens werd 20 mM natriumfosfaatbuffer met 6,7 mM NaCl (co-factor van u-amylase-enzym) bereid bij 20 graden (pH:6,9). het a-Amylase-enzym （1U/mL） en zetmeel （10 mg/mL） werden in deze buffer opgelost. Daarna werden 50 L natriumfosfaatbuffer en 10 μL a-amylase-enzymoplossing gemengd met 20 μL van de monsteroplossingen. Dit mengsel werd gedurende 45 minuten bij 37°C geïncubeerd. Na de incubatieperiode werd 20 L van de zetmeeloplossing aan het mengsel toegevoegd. Een andere incubatieperiode werd gestart bij 37 graden gedurende 45 minuten. Dezelfde procedure werd toegepast op de monsters zonder toevoeging van een w-amylase-enzymoplossing genaamd "monsterachtergrond". De controlegroep werd met dezelfde procedure bestudeerd in afwezigheid van monsteroplossingen. Absorptie werd gemeten bij 540 nm. Acarbose werd in verschillende concentraties als referentieoplossing gebruikt. De resultaten werden gepresenteerd als een percentage remmende activiteit in concentraties van 1 mg/ml en 0,5 mg/ml van ND- en IN-monsters van waterige extracten van Cistus-soorten. 4.11.3.AGE-remmende activiteit AGE-remmende activiteit van niet-verteerde en biologisch beschikbare monsters van waterige extracten van Cistus-soorten werd bepaald volgens de methode beschreven door Starow-icz et al. [57]. Vóór elk proces werden concentraties van 1 mg/mL en 0,5 mg/mL van ND- en IN-monsters vers bereid. Vervolgens werd 1 ml 10 mg/ml concentratie van runderserumalbumine (BSA)-oplossing toegevoegd aan 1 ml ND- en IN-monsteroplossingen. Controlemonsters werden bereid zonder toevoeging van ND- en IN-monsteroplossingen en de blanco monsters werden bereid zonder toevoeging van 0,5 M glucose. Vervolgens werden alle voorbereide monsters 40 uur geïncubeerd in een schudwaterbad bij 55 graden. Nadat de incubatieperiode was afgelopen, werd Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX multimode microplaatlezer gebruikt in het 370 nm excitatie/440 nm emissiebereik om de fluorescentie-intensiteit te berekenen. Quercetine werd in verschillende concentraties als referentieoplossing gebruikt.

4.12.Statistische analyse

Alle experimenten werden drie verschillende keren onafhankelijk uitgevoerd. Het GraphPad Prism-softwareprogramma (6.1-versie) werd gebruikt om de parametrische of niet-parametrische verdeling van de gegevens te bepalen. Eenrichtings-ANOVA Tukey's analysesectie met meerdere vergelijkingen werd gebruikt om TPC-, TFC-, TPAC-, TSC-, TPACC-, FRAP-, CUPRAC-, TOAC-, DPPH- en DMPD-assays te evalueren. Aan de andere kant werden de resultaten van o-amylase-, -glucosidase- en AGE-remmingsexperimenten onderzocht door middel van bidirectionele ANOVA Sidak's meervoudige vergelijkingsanalyse. Significante resultaten werden getoond met p<0.05. 5.="">

In de huidige studie werden de waterige extracten van alle Cistus-soorten die zijn opgenomen in de Turkse flora onderzocht op hun fenolische profielen en in vitro antioxidant- en antidiabetische mogelijkheden. Aangezien afkooksel of infusie de gebruikelijke vorm is in traditionele medicijnen, is het gebruik van waterige extracten voor de beoordeling van de activiteit in experimentele onderzoeken bijzonder belangrijk. Aan de andere kant worden hydrofiele bestanddelen in het waterige extract na inname onderworpen aan een reeks metabolische transformaties in het maagdarmstelsel. Daarom moeten voor een correcte evaluatie van de activiteit van traditionele formuleringen ook de activiteiten van de biologisch beschikbare metabolieten worden onderzocht.

Dit is de eerste studie die de gevolgen van de in vitro simulatiemethode voor menselijke spijsvertering op Turkse Cistus-soorten onderzoekt. Bovendien werd in deze studie voor het eerst het remmingspotentieel van Turkse Cistus-soorten op AGE's bestudeerd. Verder kregen salidroside, hyperoside en quercitrine markerflavonoïdenen veranderingen in hun concentraties werden gevolgd in de in vitro verteringsprocedure. Hoewel het fenolgehalte en de antidiabetische en antioxiderende activiteiten van de extracten negatief werden beïnvloed door gastro-intestinale spijsverteringsprocedures, vertoonden ze nog steeds een significante biologische activiteit. Volgens de resultaten werd C.saloifolius-extract gedetecteerd als de meest krachtige plant in termen van fenolgehalte en antioxiderende en antidiabetische activiteiten. Kortom, bovengrondse delen van Turkse Cistus-soorten hebben een rijk fenolgehalte en potentiële antioxiderende en antidiabetische activiteiten. Hoewel de in vitro verteringssimulatiemethode werd gebruikt om de biologische beschikbaarheid te evalueren, kan deze de metabolische routes die in het organisme voorkomen mogelijk niet volledig nabootsen. Daarom zijn verdere in vivo en klinische onderzoeken nodig om de biologische beschikbaarheid van de fenolische verbindingen en hun bijdrage aan de gerapporteerde farmacologische effecten in detail te beoordelen.

Dit artikel is afkomstig uit Molecules 2021, 26, 5322