Remming van amyloïde bèta-aggregatie en afzetting van waterig extract van Cistanche Tubulosa

1. Inleiding

Dementie is een van de meest voorkomende chronische verouderingsziekten. In 2015 schatte het World Alzheimer Report dat ongeveer 46,8 miljoen mensen aan dementie leden, en naar verwachting zal dit aantal in 2030 74,7 miljoen bedragen en in 2050 131,5 miljoen. De mondiale dementiepopulatie zal jaar na jaar toenemen en in de toekomst uit de hand lopen. . De mondiale gezondheidszorguitgaven voor de behandeling van dementie bedroegen in 2010 bijna 604 miljard dollar en in 2030 wordt verwacht dat dit bedrag 1000 miljard dollar zal bedragen. Dementiepatiënten lopen een groter risico op overlijden door een ongeval en hebben daarom meer medische zorg nodig. Dit is een zware last voor de mantelzorgers van dementiepatiënten. De impact van dementie op zorgverleners, het gezin en de samenleving kan grote fysieke, psychologische, levens- en economische stress veroorzaken. Er zijn twee belangrijke vormen van dementie: de ziekte van Alzheimer (AD) en vasculaire dementie. AD is de meest voorkomende dementie en is een onomkeerbare en progressieve neurodegeneratieve aandoening. AD was in 2015 de zesde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VOORKOMEN VAN AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Recente onderzoeken ondersteunen dat de neurontoxiciteit die wordt geïnduceerd door de aggregatie van amyloïdepeptide (A) (plaques) en eiwit-tau (klitten) nauw verwant is aan AD-pathogenese. De ophoping van A en eiwit-tau in de hersenen kan leiden tot neuronenbeschadiging en geheugenverlies. Onoplosbare A-oligomeren aggregeren in extracellulaire plaques en er werd gerapporteerd dat ze leiden tot synaptische dysfunctie, neurontoxiciteit en celdood. Helaas is er tot nu toe geen effectieve behandeling beschikbaar om A en eiwit-tau te verwijderen, de vorming of oligomerisatie van A te remmen en de onomkeerbare neuronschade op te schorten of te genezen. De huidige therapeutische middelen, zoals galantamine en donepezil, die acetylcholinesteraseremmers zijn, kunnen het geheugenverlies slechts tijdelijk verlichten door het neurotransmitterniveau te verhogen. In 2012 waren er geen kandidaat-geneesmiddelen die het A-effect konden verminderen in grote klinische onderzoeken bij AD-patiënten. Daarom is onderzoek naar een nieuwe behandeling om de prevalentie van de ziekte van Alzheimer te onderdrukken dringend nodig. Metaalionen werden onlangs beschouwd als een sleutelfactor die nauw verband houdt met A-aggregatie. Metaalchelatoren die als potentiële leidende verbindingen worden beschouwd, bieden een geheel nieuwe strategie voor de anti-AD-aanpak.

De gedroogde stengel van Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, wordt op grote schaal geoogst in de woestijn van Xhinjang, China. Het is een belangrijk traditioneel Chinees medicijn dat behoort tot de tonische Chinese geneeskunde die is geïndexeerd in de China Pharmacopeia en al duizenden jaren wordt gebruikt voor de behandeling van lichamelijke zwakte, nierdeficiëntie, onvruchtbaarheid, vergeetachtigheid, impotentie en seniele constipatie.Waterig extract van C. tubulosa (CTE)capsules zijn in China goedgekeurd als botanisch medicijn voor vasculaire dementie. Volgens een klinisch onderzoek onder 18 patiënten bij wie milde tot matige AD werd vastgesteld, gaven CTE-capsules patiënten een stabielere geheugentoestand vergeleken met acetylcholinesteraseremmers. In onze vorige studie verminderde de CTE de afzetting van amyloïdepeptide (A) en verbeterde het geheugenverlies bij ratten die lijken op de ziekte van Alzheimer. Fenylethanoïdeglycosiden, echinacoside (1), acteoside (2) en isoacteoside (3) worden beschouwd als de belangrijkste componenten van CTE. Verbinding 1 heeft neuroprotectieve activiteit tegen de toxiciteit van 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), 1-methyl{{13 }}fenylpyridiniumion (MPP+) en 6-Hydroxydopamine (6-OHDA). Ons vorige rapport toonde aan dat 1 de oligomerisatie en toxiciteit van A onderdrukte in een in vitro onderzoek, en de afzetting van A remde, het verminderde geheugen en de cognitieve disfunctie bij A-geïnduceerde ratten verbeterde. Verbindingen 2 en 3 verhoogden de A-afbraak en verminderden de Oligomerisatie in vitro. Verbinding 3 verminderde de A-afzetting bij A-geïnduceerde ratten. Op basis van deze onderzoeken heeft C. tubulosa al bewezen dat het potentieel heeft om AD te behandelen. CTE is nauw verwant aan de aggregatie en afzetting van anti-A. Om het CTE-mechanisme beter te begrijpen, hebben we een handige en efficiënte methode nodig om de actieve component en de inhoud in hersenweefselmonsters te identificeren. De meeste onderzoeken zijn ontworpen voor de kwantitatieve bepaling vanechinacoside, acteoside en isoacteoside in kruidenof voedingsmiddelen met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), maar slechts twee onderzoeken hadden betrekking op de bepaling in serum of weefsels. Er is echter geen rapport over de gelijktijdige analyse van 1–3 in hersenweefsel na orale toediening van CTE. Bovendien is het uit recente onderzoeken nog steeds onduidelijk of de actieve componenten van CTE of hun metabolieten met succes de bloed-hersenbarrière passeerden en inwerkten op hersenneuronen. Daarom biedt dit onderzoek een geavanceerde en gevoelige methode met overtuigend bewijs dat het onderliggende mechanisme van CTE tegen A-aggregatie en afzetting duidelijk illustreert.

2. Resultaten

2.1. Isolatie en identificatie van drie belangrijke verbindingen (1–3)

Gedroogde stengels van C. tubulosa werden bij kamertemperatuur geëxtraheerd met 75% EtOH. Het gecondenseerde 75% EtOH-extract werd onderworpen aan hars- en C18-kolomchromatografie om drie belangrijke verbindingen op te leveren: echinacoside (1),acteoside (2) en isoacteoside(3). Hun structuren werden opgehelderd door analyse van de NMR-spectroscopie (Nuclear Magnetic Resonance) en ESI-MS (Electrospray-ionisatiemassa) en door vergelijking met literatuurgegevens (Figuur 1, Aanvullende Materialen Figuren S3-S11).

2.2. De fenylethanoïdeglycosiden (1–3) inhoudstest van CTE

De testmethode werd gevalideerd voor de analyse van fenylethanoïdeglycosiden. Verbindingen 1–3 (5,0 mg) werden nauwkeurig afgewogen en gemengd met 50% methanol (40 ml). De mengsels werden gedurende 5 minuten gesoniceerd. De standaardoplossing van drie fenylethanoïdeglycosiden (1–3) werd gemengd als de standaard stockoplossing (100 ug/ml). De standaard stockoplossing werd gebruikt om respectievelijk vijf verschillende concentraties (5, 10, 25, 50 en 100 ug/ml) van de aangegeven oplossingen te bereiden door te verdunnen met seriële volumes van 50% methanol. De fenylethanoïdeglycosiden (1–3)-curven werden vastgesteld met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) van 5–100 ug/ml en waren respectievelijk lineair (1, r2= 0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2= 0.9998). De precisie binnen en tussen de dagen [% RSD (relatieve standaardafwijking) was van 0,1 tot 1,8%] en de nauwkeurigheid (95,6–104,2%) was door UPLC aanvaardbaar voor 1–3. UPLC kwantificeerde de 1, 2 en 3 van de CTE-inhoud op respectievelijk 254, 38 en 41 mg/g (Figuur S2).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR DE BEHANDELING VAN AD-PATIËNTEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. UPLC/MS/MS-validatie

De fenylethanoïdeglycosiden (1–3) werden gemengd en verrijkt met homogenaat van rattenhersenweefsel en geanalyseerd met behulp van Ultra performance vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometer (UPLC / MS / MS) met vastefase-extractie. De onderste detectielimiet (LLOQ) van 1–3 was 0,2 ng/ml. Het herstel van de fenylethanoïdeglycosiden piekte bij hersenweefselhomogenaat (10 ng/ml) op respectievelijk 91,39% voor 1, 89,54% voor 2 en 96,81% voor 3 (Figuur 2).

2.4. Analyse van AD-achtige hersenweefsels van ratten

Na 14 dagen orale CTE-toediening (200 mg/kg/dag) werden AD-achtige hersenweefsels van ratten verzameld en in twee delen verdeeld, hippocampus en striatum, en beide gehomogeniseerd. Omdat de hippocampus- en striatumhomogenaten van elke rat te schaars waren om te worden geladen in vastefase-extractie en om buitensporige experimentele fouten te vermijden, werden de hippocampus- en striatumhomogenaten van vier individuele ratten gemengd in een geanalyseerd monster voor UPLC/MS/MS met behulp van de vaste stof. fase-extractiemethode (Figuur 3A, B). De fenylethanoïdeglycosiden (1-3) werden waargenomen in de hippocampus (Figuur 3A) en striatum (Figuur 3B). Er was geen significante piek in blanco hersenweefsels (Figuur 3C). In de hippocampus was het echinacosidegehalte 11,97 ± 0.34 ng/ml, het acteosidegehalte 1,25 ± 0.16 ng/ml en het isoacteosidegehalte 1,38 ± 0.08 ng / ml. In het striatum was het echinacosidegehalte 22,60 ± 1,69 ng/ml, het acteosidegehalte 2,03 ± 0,61 ng/ml en het isoacteosidegehalte 4,90 ± 0,64 ng/ml. Zoals weergegeven in figuur 4 zou de CTE de bloed-hersenbarrière passeren volgens de significante detecteerbare hoeveelheden 1-3 in de hippocampus en het striatum. De inhoud van 1 is veel hoger dan 2 en 3 in CTE volgens UPLC-analyse (Figuur S2). Daarom is het redelijk om waar te nemen dat 1 de hoogste is in hersenweefsel na orale CTE-toediening.

2.5. De fenylethanoïdeglycosiden (1–3) metaalchelerende activiteit

In de literatuur werd de bepaling van de vrije verbindingen en hun metaalcomplexen uitgevoerd met behulp van HPLC. De maatstaf voor chelatieactiviteit werd in dit onderzoek door UPLC geanalyseerd. De 50 µg/ml oplossingen van elk van de fenylethanoïdeglycosiden (1-3) werden toegevoegd aan een 10 µg/ml oplossing van koper (Cu), calcium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), ijzer (Fe ) of rattenserum. Elke verbinding met elke metaaloplossing of serum werd geanalyseerd met UPLC. De fenylethanoïdeglycosiden (1-3) vertoonden metaalchelerende activiteit met ijzer en serum (Figuur 5, Aanvullende materialen Figuur S1).

2.6. Analyse van echinacoside (1) in rattenserum in vivo

Om de verdeling van echinacoside in rattenserum te begrijpen, werd het serum verzameld vanaf de initiële tijd tot 720 minuten na orale toediening van echinacoside (1) (100 mg/kg) en geanalyseerd met UPLC. Figuur 6 toont de concentratie versus tijdprofielen van echinacoside in rattenserum.

3. Discussie

Dementie, vooral AD, is een onomkeerbare verouderings- en chronische ziekte die tot een Gordiaanse kluwen van vragen leidt. Deze onoverkomelijke ziekte leidt tot ernstige economische problemen met een enorme en toenemende financiële last. Wereldwijd hebben AD-onderzoekers veel moeite gedaan om dit te onderzoekennieuwe medicijnen tegen ADmaar faalde in verschillende grote klinische onderzoeken gericht op A in 2012. Behalve dat het zich rechtstreeks op A richtte, wordt de homeostase van metaalionen in de hersenen beschouwd als de belangrijkste reden die verband houdt met A-aggregatie en afzetting die leidt tot AD-vorming. Daarom spelen metaalionen een essentiële rol in de pathogenese van AD, en de metaalchelatiehypothese is een belangrijke onderzoeksrichting geworden.

Volgens onze eerdere onderzoeken isCTE vertoonde potentiële anti-dementieactiviteit. Zelfs in klinische onderzoeken bij mensen zou de score op de Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale (ADAS-cog) na 1 jaar behandeling met CTE-capsules voor matige Alzheimer-patiënten geen significante verslechtering vertonen vergeleken met vóór de behandeling. CTE hield de ADAS-cog-score van AD-patiënten stabiel, maar andere voorgeschreven medicijnen niet. De enige keuze aan receptgeneesmiddelen waarvoor een vergunning is verleendAD-behandelingHet zijn acetylcholinesteraseremmers (AChEI’s) zoals donepezil en galanthamine die de AD-symptomen op korte termijn verbeteren, maar verslechtering treedt op na 1 jaar behandeling. Op basis van klinische onderzoeken heeft CTE de mogelijkheid om een ​​potentiële behandeling te zijn voor de ontwikkeling van anti-AD-middelen. Op basis van onze eerdere rapporten zouden echinacoside (1), acteoside (2) en isoacteoside (3) neuronen beschermen tegen schade door A, de oligomerisatie van A in vitro verminderen en de cognitieve disfunctie veroorzaakt door A in vivo aanzienlijk verbeteren. Uit het in vitro onderzoek bleek dat de actieve doses van 1–3 maximaal 5{{10}} µg/ml waren. Eerdere studies waren echter van oordeel dat de orale biologische beschikbaarheid van 1 en 2 zeer laag was (0,83% voor 1 en 0,12% voor 2) bij ratten. Verbinding 1 kon niet eens worden geïdentificeerd in menselijk serum na orale toediening van echinacea-tabletten. Uit huidige onderzoeken blijkt dat 1-3 een slechte membraanpermeabiliteit en absorptie in darmcellen had en dat de meeste van de 1 in maag-darmkanalen zouden worden gemetaboliseerd. Het gehalte aan verbinding 2 in rattenserum was slechts ongeveer 4,5 µg/ml na 15 minuten intraveneuze injectie met een dosis van 10 mg/kg acteoside. Deze studie toont echter aan dat 1-3 zou worden gedetecteerd in de hippocampus en het striatum van hersenweefsel van ratten na orale toediening van CTE (figuren 3 en 4). Bovendien toonde Figuur 6 aan dat het gehalte aan verbinding 1 in rattenserum ongeveer vijfmaal toenam van 15 minuten tot 720 minuten na orale toediening van verbinding 1 (100 mg/kg). We dachten dat fenylethanoïdeglycosiden van CTE de bloed-hersenbarrière zouden passeren en dat er chelatiewerking zou optreden tussen CTE en het metaal. Chelatie is een omkeerbare chemische reactie. IJzer is een essentieel element in het serum en de hersenen [10,40]. Figuur 5 laat zien dat drie fenylethanoïdeglycosiden metaalchelerende activiteit zouden hebben met ijzer en serum. IJzer en serum veranderen het piekretentietijdgebied van drie fenylethanoïdeglycosiden. IJzerchelatie kan de cruciale reden zijn die leidt tot de verkeerde identificatie van de zeer lage biologische beschikbaarheid van fenylethanoïdeglycosiden. Daarom moet bij bloedserum- en hersenanalyse van de drie CTE-fenylethanoïdeglycosiden rekening worden gehouden met de metaalchelerende activiteit om de werkelijke biologische beschikbaarheid en farmacokinetiek te achterhalen. Bovendien gaven de resultaten aan dat drie fenylethanoïdeglycosiden (1-3) de bloed-hersenbarrière zouden passeren en via de lichaamscirculatie in hersenweefsel terecht zouden komen. Deze studie ontwikkelde een zeer snelle en gevoelige methode voor 1–3-analyse met behulp van UPLC/MS/MS en leverde krachtig bewijs op om te bewijzen dat fenylethanoïdeglycosiden (1–3) de belangrijkste bioactieve bestanddelen van CTE zijn.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET PREVEN VAN DE ZIEKTE VAN ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materialen en methoden

4.1. Plantaardig materiaal

Stengels van C. tubulosa werden in mei 2016 verzameld in Hangzhou, China. De plant werd geïdentificeerd door Dr. Lin HC Voucher-exemplaren (nr. 20016CT) die zijn gedeponeerd bij Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China.

4.2. Isolatie en zuivering

De gedroogde C. tubulosa-stengel werd tot poeder vermalen en vervolgens vijf keer geëxtraheerd met 75% EtOH. Na verdamping van het oplosmiddel onder verlaagde druk werd het ruwe extract onderworpen aan macroporeuze hars AB-8 kolomchromatografie met H2O/EtOH gradiënt oplosmiddelsystemen van 20% EtOH tot 100% EtOH. Volgens de dunnelaagchromatografie werden vier fracties (Fr.1-Fr.4) verzameld voor verdere scheiding. Fr. 2 werd onderworpen aan preparatieve krachtige vloeistofchromatografie (HPLC) op een COSMOSIL® 5C18-AR-II-kolom (250 mm x 20 mm binnendiameter, 5 µm) met behulp van 18% acetonitril als het mobiele fasesysteem. De stroomsnelheid was 15 ml/min. Drie grote interessepieken werden selectief verzameld. De fracties die de beoogde verbindingen bevatten, werden verder tot droog gecondenseerd en produceerden respectievelijk 1, 2 en 3.

4.3. Experimentele analyse

1H- en 13C-NMR-spectra werden verkregen met behulp van Bruker Avance DRX 500 MHz spectrometers (Billerica, MA, VS) met tetramethylsilaan (TMS) als de interne standaard. Preparatieve HPLC werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde fasekolom (Cosmosil C18-AR-II-kolom, 250 mm x 20 mm ID; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) op een Shimadzu LC-6AD-serie apparaat met Prominence HPLC UV-Vis-detectoren (Kyoto, Japan).

Echinacoside (1): wit poeder; ESI−MS m/z: 785 [M − H]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30 ), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{ {80}}}}.9 Hz, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40 ), 5,17(1H, d, J=1.5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-800 ), 6,58 (1H, dd, J=8.1,2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8.2 Hz, H-500 ), 6,94 (1H, dd, J=8.3, 2,0 Hz, H-600 ), 7,05 (1H, d, J=2.0 Hz, H-200 ), δ 7,59 (1H, d, J=15.9 Hz, H-700 ); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}} ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20 ), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30 ) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10 ), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200 ), 115,3 (C{{ 189}} ), 116,3 (C-500 ), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}} ), 127,6 (C-100 ), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300 ), 168,5 (C-900 ) (Figuur S3–S5).

Acteoside (2): wit poeder; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94 (3H, d, J =5.9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7.8 Hz, H-100 ), 4,70 (1H, t , J=9.{{160}} Hz, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, s, H{{ 31}} ), 6,18 (1H, d, J=15.9 Hz, H-80 ), 6,48 (1H, dd, J=7.9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7.1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2.0 Hz, H{{57} }), 6,75 (1H, d, J=7.9 Hz, H-50 ), 6,97 (1H, d, J=8.1 Hz, H-60 ) , 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70 ); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{95} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{{110} } ), 71,7 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{170} } ) (figuren S6-S8). Isoacteoside (3): wit poeder; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 1,07 (3H, d, J=6.1 Hz, H-6000), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10.0 Hz, H-100 ), 5,10 (1H, s, H-1000 ), 6,27 (1H, d, J=15 0,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8.0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 0,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J=8.1 Hz, H-50 ), 6,94 (1H, d, J=8.2 Hz, H-60 ), 7,04 (1H, s, H-20 ), 7,46 ( 1H, d, J=15.8 Hz, H-70 ); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400 ), 70,6 (C-3000 ), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000 ), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9 (C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,6 (C-90 ) (figuren S9-S11).

4.4. Bereiding van waterig extract van C. Tubulosa (CTE)

Het poeder van de stam van C. tubulosa werd tweemaal geëxtraheerd door 1,5 uur koken onder terugvloeiing met water, en de extractoplossing werd gefiltreerd. Het gefilterde waterige extract (CTE) werd vóór gebruik bij 4 ◦C bewaard.

4.5. Diermodel en experimenteel schema

Het AD-achtige rattenmodel en het experimentele schema dat in dit onderzoek werd gebruikt, waren zoals voorgeschreven in ons vorige onderzoek [19]. Na infusie van A 1-42 (300 pmol/dag) in het hersenventrikel gedurende ten minste twee weken of langer, kregen de AD-achtige ratten de volgende dag CTE (200 mg/ml) via orale toediening. Na 14 dagen toediening werden ratten opgeofferd om de hersenweefsels te verzamelen. Om buitensporige experimentele fouten te voorkomen, werden monsters van vier individuele ratten gecombineerd tot één monster. Er waren drie monsters voor elke groep.

4.6. Chemicaliën en reagentia

Methanol (HPLC-kwaliteit) werd gekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Mierenzuur (98% voor analyse, ACS) werd gekocht bij Panreac (Barcelona, ​​Spanje). Acetonitril (HPLC-kwaliteit) werd gekocht bij JT Baker (Phillipsburg, NJ, VS). Zuiver water werd bereid met behulp van het ELGA-systeem (Woodridge, VK). Hesperidine werd gekocht bij Chromadex en gebruikt als interne standaard (IS) voor UPLC-analyse.

4.7. UPLC/MS/MS-apparaat

Waters Acquity TQD ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC)/MS/MS-systeem (Milford, MA, VS) werd gebruikt voor UPLC/MS/MS-analyse. De chromatografische experimenten werden uitgevoerd op een Acquity UPLC BEH C18-kolom (2,1 x 100 mm, 1,7 µm, Waters) onder gradiëntelutie bij een stroomsnelheid van 0,4 ml/min. De mobiele fase bestond uit mierenzuur-water (1: 1000, v/v) (A) en mierenzuur-acetonitril (1: 1000, v/v) (B). Het tijdprogramma was als volgt: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) gewijzigd in A–B (62:38, v/v); 5–7 min, AB (62:38, v/v); 7-7.1 min, AB (62:38, v/v) gewijzigd in A–B (92: 8, v/v); 7,1–9 min, (92: 8, v/v). Het injectievolume was 5 µl in het UPLC/MS/MS-systeem met een negatieve elektrospray-ionisatie (ESI)-ionenbron. De totale ionenchromatogrammen (TIC) voor 1–3 werden uitgevoerd met behulp van de modus voor meervoudige reactiemonitoring (MRM). De massaparameters zijn geoptimaliseerd om de helderste signalen met hoge intensiteit te verkrijgen. De beste keuze van parameters werd beschreven als 3000 V capillaire spanning, 20 V kegelspanning, 125 ◦C brontemperatuur, 400 ◦C desolvatietemperatuur, 50 l/u kegelgasstroom, 900 L/u desolvatiegasstroom en 38 eV botsing energie. Gegevens werden verwerkt door de MassLynx 4.1 (Milford, MA, VS) software.

4.8. Monstervoorbereiding

Hersenweefsel van ratten gebruikte 50% methanol voor homogenisatie (1 g weefsel voor 5 ml methanol). Het homogenaat werd 10 minuten gecentrifugeerd bij 10,000 rpm bij 4 ◦C. Het supernatant (50 µl) met 10 µl IS (100 µg/ml) voegde zuiver water toe aan 1 ml. Het mengsel werd zorgvuldig op de Oasis HLB-patroon (hydrofiel-lipofiel gebalanceerd) (Waters, Milford, MA, VS) geladen, die al was geëlueerd met 1 ml methanol en vervolgens onder vacuümomstandigheden met 1 ml water in evenwicht was gebracht. Nadat 1 ml 10% methanol was gebruikt voor het wassen van de patroon, werd 1 ml methanol gebruikt om te elueren om het geanalyseerde monster te verkrijgen dat werd overgebracht naar een andere 1,5 ml Eppendorf-buis met 10 µl 1% ascorbinezuuroplossing en gedroogd door verdamping. Tenslotte werd het residu van het geanalyseerde monster voor analyse opgelost in 200 µl 50% methanol.

4.9. Voorbereiding van de kalibratiestandaardcurve

Verbindingen 1–3 werden gebruikt om kalibratiestandaarden te bereiden, respectievelijk toegevoegd aan hersenweefselhomogenaat en hesperidine als interne standaard om de uiteindelijke kalibratiestandaardconcentraties te verkrijgen die 1.0, 5.0, 1{{7 waren) }}.0, 50.0 en 100,0 ng/ml.

4.10. Geldigmaking

De kalibratiestandaardcurve werd verkregen met behulp van de lineariteitstest met vijf verschillende concentraties van 1–3, in de bereiken 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 en 100,0 ng/ml, respectievelijk, en werd als lineair beschouwd met een determinatiecoëfficiënt van meer dan 0,99 (R-kwadraat). De onderste detectielimiet (LLOQ), gedefinieerd als ± 20% van de concentratie van een testmonster, produceerde een signaalpiek in plaats van ruis. De geloofwaardigheid en nauwkeurigheid van de analysemethode werden geëvalueerd met behulp van een hersteltest bij 10 ng/ml van 1–3.

4.11. Analyse van metaalchelerende activiteit

UPLC werd gebruikt om het metaalchelerende effect te analyseren met behulp van de 50 µg/ml oplossing van CTE-fenylethanoïdeglycosiden 1-3 die 10 µg/ml van een metaaloplossing van koper, calcium, magnesium, zink, ijzer of rattenserum bevatte. Elke verbinding met elke metaaloplossing of serum werd geanalyseerd met UPLC. Het metaalchelerende effect zou de retentietijd voor 1–3 bij vloeistofchromatografie veranderen. Het percentage metaalchelerend effect werd berekend zoals hieronder en de gegevens vertegenwoordigden het gemiddelde ± SD (n=3).

5. Conclusies

Deze studie toonde aan dat 1–3 de actieve componenten zijn van CTE voor anti-AD-activiteit. IJzerchelatie is het nieuwe concept geworden voor het ontwerpen van een nieuwe generatie geneesmiddelen voor de behandeling van AD.CTE is een potentieel botanisch Chinees medicijn tegen ADgericht op door ijzerchelatie geïnduceerde A-aggregatie en afzetting. Bovendien hebben we verder bewezen dat 1–3 de hersenen zouden bereiken via het bloed: de bloed-hersenbarrière (BBB). Actieve componenten en de bevestiging van het onderliggende mechanisme van CTE zullen de kwaliteitscontrole en de biologische beschikbaarheid van productstudies in de toekomst enorm helpen. Tegelijkertijd zal de gepresenteerde geavanceerde en efficiënte analysemethode nuttig zijn bij het bepalen van 1-3 in planten, voedsel, bloed en hersenweefsel voor onderzoek naar chemische vingerafdrukken en farmacokinetiek.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR DE BEHANDELING VAN DE ZIEKTE VAN ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%