Onderzoek naar de toxiciteit van ifosfamide veroorzaakt een gemeenschappelijke stroomopwaartse regulator in lever en nier

Contactpersoon: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

Abstract:

Ifosfamide is een alkylerend middel, een synthetisch analoog van cyclofosfamide, dat wordt gebruikt om verschillende vaste kankers te behandelen. In deze studie werd de toxiciteit van ifosfamide geëvalueerd met behulp van intraperitoneale toediening van een enkele en meervoudige dosis bij ratten volgens de richtlijnen van Good Laboratory Practice, en een aanvullend microarray-experiment werd gevolgd om toxicologische bevindingen te ondersteunen. Een enkele dosis ifosfamide (50 mg/kg) veroorzaakte geen pathologische veranderingen. Ondertussen werd ernstige niertoxiciteit waargenomen in de 7 en 28 dagen achtereenvolgens toegediende groepen, met significante verhogingen van bloedureumstikstof en creatininespiegels. In de tox-lijstanalyse waren cholesterolsynthese-gerelateerde genen meestal aangetast in de lever en nierfalen-gerelateerde genen werden aangetast in denierna toediening van ifosfamide. Bovendien werd interferonregulerende factor 7 geselecteerd als de belangrijkste stroomopwaartse regulator die veranderde in zowel deleverennier, en bleek een interactie aan te gaan met andere doelwitgenen, zoals ubiquitine-specifiek peptidase 18, radicaal S-adenosylmethioninedomein met 2 en interferon-gestimuleerd gen 15, wat verder werd bevestigd door real-time RT-PCR-analyse. Concluderend, herbevestigde nier-vooringenomen ifosfamide-orgaantoxiciteit en identificeerde identiek veranderde genen in zowel deleverennier. Verdere uitgebreide toxicogenomische studies zijn nodig om de exacte relatie tussen ifosfamide-geïnduceerde genen en orgaantoxiciteit te onthullen.

trefwoorden:ifosfamide; hepatotoxiciteit; nefrotoxiciteit; intraperitoneale toxiciteit

Cistanche is goed voor lever en nieren

1. Inleiding

Ifosfamide is een alkylerend middel, een synthetisch analoog van cyclofosfamide, dat wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende solide kankers, waaronder sarcomen en lymfomen. Ifosfamide is een niet-celcyclusspecifiek middel tegen kanker dat de DNA-replicatie en RNA-productie verstoort [1]. Hoewel ifosfamide relatief goed wordt verdragen in vergelijking met andere toxische alkylerende middelen, is bekend dat het in verband wordt gebracht met tal van levensbedreigende bijwerkingen die het klinische gebruik ervan beperken [2]. De belangrijkste bijwerkingen van ifosfamide zijn onder meer ernstig nierletsel als gevolg van reactieve toxische soorten van ifosfamide, waaronder acutenier blessure, interstitiële nefritis, hemorragische cystitis en Fanconi-syndroom [3]. In klinieken werd ernstige toxiciteit van meerdere organen gemeld bij patiënten die vroege niertoxiciteit ondervonden en herhaalde hoge doses ifosfamide-geïnduceerd één orgaanfalen dat leidde tot daaropvolgend orgaanfalen [4,5].

De toxische metaboliet van ifosfamide, acroleïne en chlooracetaldehyde is een belangrijke verantwoordelijke factor voor de toxiciteit van ifosfamide-organen. Eerdere studies waren vooral gericht op de factoren die de omzetting van ifosfamide in toxische metabolieten beïnvloeden, met name cytochroom P450 (CYP) [6]. Relatief veel CYP3A4 en CYP3A5 in de nieren leidt tot toxische veranderingen in ifosfamide en induceert nefrotoxiciteit [7]. Acroleïne is een zeer reactief aldehyde dat de intracellulaire reactieve oxidatieve genenroute kan activeren en het celorganel kan beschadigen. Chlooracetaldehyde rapporteerde de onderdrukking van de complex I-activering in de mitochondriale ademhalingsketen die zou kunnen leiden tot intracellulaire glutathion (GSH) uitputting en celdood [8].

Een toxicologisch onderzoek met meerdere organen is nuttiger om de systemische effecten van geneesmiddelen te begrijpen dan zich te richten op specifieke organen voor toxiciteitsonderzoeken. De lever en de nieren zijn belangrijke organen die deelnemen aan het metabolisme en de uitscheiding van geneesmiddelen, en deze belangrijke organen zijn vatbaar voor bijwerkingen; orgaantoxiciteit volgt vaak. Bovendien kan integratieve toxicologische evaluatie verschillende pathologische bevindingen opleveren die kunnen helpen om door geneesmiddelen veroorzaakte toxiciteit in het systeem te begrijpen en te voorspellen.

Veel onderzoeken hebben genexpressieprofielen gebruikt om de mogelijke negatieve effecten van chemicaliën te voorspellen. De meeste eerdere onderzoeken waren echter gericht op het evalueren van de toxiciteit van één enkel doelorgaan, met slechts beperkte pathologische symptomen [9]. Bovendien zal het, in combinatie met op microarray gebaseerde genprofilering, een uitgebreid begrip op systeemniveau van toxiciteit opleveren dat mogelijke geneesmiddelgerelateerde toxiciteit kan voorkomen [10]. In dit opzicht zijn integratieve toxicologische benaderingen voor meerdere organen met genexpressieprofilering gebruikt in toxiciteitsvoorspellingsmodelstudies om toxiciteitsgegevens te overwinnen die zijn afgeleid van de evaluatie van de toxiciteit van een enkel orgaan, wat onvoldoende is om de toxische mechanismen van geneesmiddelen in het systeem te begrijpen [11].

In deze studie beschrijven we de toxiciteit van ifosfamide in denierenleverna acute en herhaalde blootstelling bij Sprague-Dawley (SD) ratten. Er werden ondersteunende genexpressieprofileringsassays uitgevoerd om het gemeenschappelijke doelgen te onthullen dat door ifosfamide in zowel de lever als de lever werd veranderd.nier, wat een inzicht suggereert in integratieve ifosfamide-toxiciteit.

2. Resultaten

2.1. Onderzoek naar toxiciteit bij een enkele dosis

Er werd geen toxiciteit waargenomen in de ifosfamide-groepen van 12,5, 25 en 50 mg/kg - geen overlijden, toxische symptomen, veranderingen in lichaamsgewicht of histopathologische bevindingen.

Ondertussen daalden in de hematologische studie de relatieve tellingen van reticulocyten (RET) en absolute tellingen van neutrofielen (NEUA) en lymfocyten (LYMA) op een dosisafhankelijke manier.

2.2. Onderzoek naar toxiciteit bij herhaalde dosering van een week

Het totale lichaamsgewicht nam af na 1 week toediening van ifosfamide en de gemiddelde waarden van het gewichtsverlies in de 100 mg/kg-groep waren hoger dan die in de 75 mg/kg-groep (tabel 1). Ondertussen nam het relatieve orgaangewicht geleidelijk toe in met ifosfamide behandelde groepen (tabel 2).

Een week van opeenvolgende ifosfamide IP-toediening onderdrukte de hematologie-index, inclusief RBC, HGB, HCT, MCV en PLT, op een dosisafhankelijke manier (tabel 3). Bovendien namen BUN en CREA 1,2 keer toe in de controlegroep in vergelijking met de ifosfamide-groep (tabel 4).Nierblessurewerd verder ondersteund door een histopathologisch onderzoek.

Er werden geen histopathologische tekenen waargenomen in de levers van muizen in de ifosfamide-groepen van 75 en 100 mg/kg (Figuur 1A). Ondertussen is denierenvan de 75 en 100 mg/kg ifosfamide-groepen bleek een minimale tot lichte graad van pathologische verandering te hebben, waaronder tubulaire degeneratie/dilatatie (1 matig in de 100 mg/kg-groep), eencellige necrose, urotheelhyperplasie en focale bloeding /congestie (tabel 5). Bovendien werd een duidelijke toename in KIM-1-expressie in het gebied van de niertubuli waargenomen in deniervan de 100 mg/kg-groep (Figuur 1B).

2.3. Onderzoek naar toxiciteit bij herhaalde toediening van vier weken

Mortaliteit werd waargenomen in de met 50 (5/10) en 70 (10/10) mg/kg behandelde groepen na respectievelijk 21 en 10 dagen opeenvolgende toediening. Bovendien, het verminderde lichaamsgewicht met verhoogd relatief orgaangewicht,lever, ennier, in alle met ifosfamide behandelde groepen, ondersteunt 4-week toxiciteit bij herhaalde dosering.

Hematologische en serum biochemische analyses werden uitgevoerd op de overlevende proefpersonen. Verschillende bloedparameters, waaronder RET, RBC, MONA, EOSA en LUCA, waren significant verlaagd na 4 weken toediening van ifosfamide.

Vergeleken met de controlegroep lieten biochemische analyses statistische verschillen zien na 4 weken toediening van ifosfamide. De niveaus van AST en CK waren bijvoorbeeld significant verhoogd en de A/G-ratio, GLU en GGT waren verlaagd (p < 0.01)="" in="" de="" met="" 50="" mg/kg="" behandelde="" groep,="" vergeleken="" met="" de="" controlegroep="">

2.4. Ifosfamide-geïnduceerde genexpressieanalyse

De ifosfamide-geïnduceerde DEG's werden geïdentificeerd in de lever ennierweefsels (Tabel 6). Voor de lever omvatten de differentieel tot expressie gebrachte genen 2672 genen bij 100 mg/kg LG/dag, 1283 genen werden opgereguleerd en 1389 genen werden neerwaarts gereguleerd. In de nieren werden 401 genen differentieel tot expressie gebracht bij 100 mg/kg LG/dag - 149 genen werden opgereguleerd en 252 genen werden neerwaarts gereguleerd. In zowel de lever als de nier was het aantal neerwaarts gereguleerde genen groter dan het aantal opwaarts gereguleerde genen. Dit zou erop kunnen wijzen dat behandeling met ifosfamide de genexpressie lijkt te remmen.

De resultaten van de biologische functieanalyse staan ​​vermeld in Tabel 7. De 1-weekse toediening van ifosfamide bleek genen te veranderen die verband houden met orgaanontwikkeling, voornamelijk in de lever. In denier, werd bevestigd dat de genen die verband houden met de lokalisatie van immuuncellen het meest werden beïnvloed.

In de canonieke route-analyse van DEG's waren veranderingen in cholesterolsynthese en antigeenpresentatieroute-gerelateerde genen duidelijk in deleverennierweefsels, respectievelijk (Figuur 2). Bovendien waren LXE / RXR en acute fase-responssignalering de gemeenschappelijke top-gereguleerde canonieke route in deleverennier, die respectievelijk betrokken waren bij lipidehomeostase en inflammatoire cytokinesignalering.

In de levertox-lijstanalyse werden de cholesterolsynthese-gerelateerde genen het meest beïnvloed, gevolgd door de positieve acute fase respons-eiwitten en het panel voor acuut nierfalen (Tabel 8). Verder bleek uit de nierlijstresultaten dat de nierfalen-gerelateerde genen over het algemeen werden beïnvloed door ifosfamide, inclusief omkeerbare biomarkers voor glomerulonefritis en acuut nierfalen.

Op basis van de IPA-kennisbank reguleert een gemeenschappelijke stroomopwaartse regulator de genexpressie in de lever en de nieren na behandeling met ifosfamide (Figuur 3). IRF7 was de belangrijkste regulator die veranderde in zowel de lever als de nieren en bleek een interactie aan te gaan met andere doelwitgenen zoals USP18, RSAD2 en ISG15. Bovendien bevestigde realtime RT-PCR-analyse de expressie van IRF7, USP18, RSAD2 en ISG15. Hoewel de mate van veranderingen in elk gen verschillend was tussen lever en nier, werd de expressie onderdrukt in zowel lever- als nierweefsels na 1 week toediening van ifosfamide. De RSAD2 en USP18 hebben meestal veranderde genen door ifosfamide-behandeling in respectievelijk de lever en de nier.

3. Discussie

In deze studie werd uitgebreide ifosfamide-toxiciteit in meerdere organen onderzocht met verschillende doses en blootstellingsvoorwaarden via de IP-route bij ratten onder de GLP-standaard. In klinieken kan ifosfamide een bimodale antitumorwerking uitoefenen met cytotoxische en immunomodulerende effecten in combinatie met adoptieve immunotherapie [12]. Van ifosfamide is bekend dat het voornamelijk via de nieren wordt geëlimineerd en ongeveer 80 procent van de dosis is in onveranderde vorm, nefrotoxiciteit is een algemeen bekende bijwerking van ifosfamide en metabolieten zoals chlooracetaldehyde en acroleïne zijn verantwoordelijk voor het klinische gebruik [13, 14].

In het huidige onderzoek was een 1-week onderzoek naar herhaalde toxiciteit geschikt voor het onderzoeken van orgaantoxiciteit afkomstig van ifosfamide. Eén week toediening van ifosfamide onderdrukte de bloedindex op een dosisafhankelijke manier, wat zou kunnen wijzen op de typische van ifosfamide afgeleide myelosuppressie. Naast nefrotoxiciteit hebben verschillende rapporten aangegeven dat myelosuppressie een van de belangrijkste dosisbeperkende toxiciteiten van ifosfamide is, en leukopenie is over het algemeen ernstiger dan trombocytopenie [15,16]. Nefrotoxiciteit van ifosfamide kan leiden tot het Fanconi-syndroom, waarbij sprake is van een verslechtering van de proximale tubulusfunctie met onomkeerbare schade tot gevolg, en de toxische metaboliet acroleïne veroorzaakt urotoxiciteit met hemorragische cystitis [17]. Dit is in overeenstemming met de resultaten van het huidige onderzoek. In de histopathologische studie werden de nieren en levers onderzocht om van ifosfamide afgeleide pathologische veranderingen te onderzoeken. In zowel de 75 als 100 mg/kg ifosfamide-toegediende groepen werden grote gebieden van tubulaire degeneratie en dilatatie gedetecteerd met urotheelhyperplasie in het nierbekkengebied. Bovendien ondersteunde de expressie van KIM-1, een molecuul voor schade aan de proximale niertubuli, de aanwezigheid van ifosfamide-gerelateerde nefrotoxiciteit. Ondertussen werd slechts minimale periportale vacuolatie in de lever waargenomen. Bovendien, hoewel de AST- en ALT-waarden op een dosisafhankelijke manier afnamen, lagen de veranderingen binnen het referentiebereik [18]. Diepere redenen voor verlaagde leverenzymniveaus zullen verder moeten worden bestudeerd. Het is algemeen aanvaard dat ifosfamide een alkylerend middel is dat zelden wordt geassocieerd met hepatotoxiciteit, en er zijn slechts enkele gevallen gemeld die leverbeschadiging veroorzaken, vooral in combinatie met andere chemotherapeutische geneesmiddelen zoals doxorubicine [19].

Onlangs heeft opmerkelijke vooruitgang in genexpressiegegevens in de toxicologie met high-throughput-technologieën geleid tot het genereren van voldoende grote datasets in toxiciteitsstudies, en er zijn veel pogingen gedaan om het genprofiel toe te passen op de voorspelling van chemische toxiciteit [10,20]. In deze studie werd microarray-analyse uitgevoerd om de transcriptoomrespons te analyseren die werd geïnduceerd door toediening van ifosfamide, en DEG's met een vouwverandering groter dan of gelijk aan 1,5 werden geselecteerd als het doelgen en de biologische functie, canonieke route en Tox-lijstanalyse werden gebruikt om de functie van door ifosfamide geïnduceerde genen te begrijpen. Er werd een aanvullende analyse van de stroomopwaartse regulator uitgevoerd om de mogelijkheid van multi-orgaantoxiciteit in de lever en de nieren te evalueren.

In deze studie werden DEG's 1,5-voudig geselecteerd, en de gedownreguleerde genen waren iets dominanter dan de opgereguleerde genen in zowel de lever (52 procent) als de nier (62 procent). De resultaten van de biologische functieanalyse gaven aan dat ifosfamide de genen verandert, met biologische functies die verband houden met weefselontwikkeling die vaak worden waargenomen in zowel de lever als de nier.

Een eerdere studie van Snouber et al. [21] gemelde behandeling met ifosfamide bleek de door Nrf-2 gemedieerde oxidatieve responsroutes in de microfluïdische cultuur te verlagen [21]. In overeenstemming met de eerdere onderzoeken, werd de NRF2-gemedieerde oxidatieve stressreactieroute aanzienlijk gemoduleerd door topnetwerken, wat werd bevestigd door zowel de huidige canonieke route als de tox-lijstanalyse. De huidige veranderde door Nrf-2 gemedieerde stress-oxidatieve responsroutes kunnen nauw verwant zijn aan de toxische metaboliet van ifosfamide. Meerdere toxische metabolieten van ifosfamide kunnen reageren met GSH, een krachtige antioxidant, om conjugaten te vormen op verschillende plaatsen langs de route, en een afname van het GSH-niveau resulteert in verhoogde toxiciteit, wat wijst op de implicatie van oxidatieve stress bij ifosfamide-orgaantoxiciteit [8,22] ]. In dit opzicht werden mesna en N-acetylcysteïne gebruikt om ifosfamide-orgaantoxiciteit te verlichten. Mesna dient als een regionaal ontgiftingsmiddel door zich te binden aan de toxische metaboliet van ifosfamide, voornamelijk tegen acroleïne, door middel van een Michael-toevoeging om een ​​minder schadelijke stof te vormen [23]. Bovendien is gemeld dat N-acetylcysteïne antioxiderende activiteit heeft en de GSH-uitputting verbetert onder omstandigheden van oxidatieve stress [24]. Verdere studies zijn nodig om de exacte relatie tussen ifosfamide-antidotum en gereguleerde route onder nefrotoxische omstandigheden op te helderen. We kunnen speculeren dat de verbetering van de ifosfamide-toxiciteit door mesna of N-acetylcysteïne kan worden gevolgd door verbeterde door Nrf-2-gemedieerde oxidatieve stressreactieroutes.

In deze studie werden de ontstekingsgerelateerde signalen vaak opgereguleerd in zowel de lever als de nier, wat kan worden herkend door acute fase-signalering in canonieke route-analyse. Dit resultaat duidde op de implicatie van een ontstekingsreactie in de pathofysiologie van ifosfamide-orgaantoxiciteit in beide weefsels, wat verder werd ondersteund door de upstream-regulatoranalyse. In de stroomopwaartse regulatoranalyse werden IRF7- en interferon (IFN)-signaalgerelateerde genen, waaronder USP18, RSAD2 en ISG15, geselecteerd als algemene stroomopwaartse regulatoren in de lever en de nier. IRF7 is een lymfoïde-specifieke factor, die constitutief tot expressie wordt gebracht in het cytoplasma van de immuuncel, en ook kan worden geïnduceerd door type I interferon, virusinfectie en externe stimuli in verschillende cellen [25]. Een eerdere studie rapporteerde controversiële pro- of anti-oncogene eigenschappen van IRF7 in diverse tumorcellen, en de veranderingen in IRF7-expressie waren geassocieerd met DNA-schade [26-28].

Naast zijn belangrijke regulerende rol in het type I IFN voor antivirale functies, werd gemeld dat IRF7 ontstekingsreacties onderdrukt via de TLR4-signaleringsroute [29]. Bovendien, Stout-Delgado et al. [30] rapporteerde dat door veroudering geïnduceerde oxidatieve toename de IRF7-activiteit schaadt, terwijl vermindering van de stress door antioxidanten de IRF7-activiteit verbeterde. In deze studie onderdrukte toediening van ifosfamide de expressie van stroomopwaartse regulatoren en de expressiepatronen waren identiek in zowel de lever als de nier. De huidige veranderingen in IRF7-expressie kunnen verband houden met de ontstekingsreactie en cytotoxische alkylerende eigenschappen van ifosfamide, wat zou kunnen suggereren dat IRF7 een veelbelovend doelwit is voor ifosfamide-orgaantoxiciteit.

In deze studie vonden we een gen dat identiek werd geremd in zowel de lever als de nier na toediening van ifosfamide, maar de interpretatie van de toxicologische betekenis ervan was alleen gericht op de nier, wat de huidige ontdekking beperkt. Bovendien zouden verdere bevestigende onderzoeken met betrekking tot het effect van het in de handel verkrijgbare tegengif tegen ifosfamide op het momenteel gewijzigde gen de huidige bevindingen kunnen ondersteunen.

Concluderend werd in een herhaalde toxiciteitsstudie (1 week) van toediening van ifosfamide een vertekende nefrotoxiciteit gevonden in plaats van hepatotoxiciteit. Bovendien leveren de huidige resultaten bewijs voor door ifosfamide geïnduceerde hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteitsmechanismen waarbij IRF-7-remming betrokken is. Verdere toxicogenomische studies van immuungerelateerde organen zijn nodig om het systemische toxicologische mechanisme van ifosfamide op te helderen en om de relatie tussen gen- en orgaantoxiciteit te ondersteunen.

4. Materialen en methoden

4.1. Dierstudie

Acht weken oude mannetjesspecifieke pathogeenvrije Sprague-Dawley (SD) ratten (n=140) werden verkregen van Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). De dieren werden een week voor het experiment onderzocht en geacclimatiseerd aan laboratoriumomgevingsomstandigheden. Alle dieren werden gehuisvest in plastic kooien onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (temperatuur, 23 ± 3 C; vochtigheid, 55 ± 10 procent; en 12/12- uur licht/donker cyclus) met laboratoriumvoer en water ad libitum. De dierstudie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Korea Institute of Toxicology (Daejeon, Korea), en alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de testrichtlijnen voor veiligheidsevaluatie van geneesmiddelen van de Korea Food and Drug Administration. De dierstudie was verdeeld in drie secties: een enkelvoudige dosis (acute) en herhaalde dosis (1 week en 4 weken) toxiciteitsstudie met opeenvolgende toediening. Veertig ratten werden willekeurig toegewezen aan vier groepen (controle, t1,t2 en t3) met behulp van het Path/Tox-systeem (versie 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, VS) in elk toxiciteitsonderzoek.

4.2. Toxiciteitsexperiment

Het toxiciteitsonderzoek was verdeeld in drie secties: enkelvoudige dosis (acute) en twee herhaalde dosis (opeenvolgende dosis van 1 week of 4 weken) toxiciteitsonderzoeken. Voor elk toxiciteitsonderzoek werden ratten willekeurig toegewezen aan geschikte groepen (controle, dosis 1, dosis 2 en dosis 3 voor enkelvoudige en 4-wekelijkse toxiciteitsonderzoeken; controle, dosis 1 en dosis 2 voor 1- toxiciteitsonderzoek van een week) met behulp van het Path/Tox-systeem (versie 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, VS). In het toxiciteitsonderzoek werd ifosfamide toegediend via de intraperitoneale (IP) route en kreeg de controlegroep gedestilleerd water (DW). De dosis ifosfamide die in het toxiciteitsonderzoek werd gebruikt, was als volgt: onderzoek naar acute toxiciteit (12,5, 25 en 50 mg/kg), 1-week toxiciteitsonderzoek (75 en 100 mg/kg lg/dag) en {{19 }}week toxiciteitsonderzoek (25, 50 en 70 mg/kg lg/dag). De algemene klinische symptomen, het lichaamsgewicht en de mortaliteit van de dieren werden dagelijks geregistreerd tijdens de toediening en alle dieren werden 24 uur na de laatste toediening van ifosfamide geofferd. Bloedmonsters werden verzameld en in microcentrifugebuizen en EDTA-K2-buizen geplaatst voor respectievelijk serumbiochemie en hematologische analyse. Lever- en nierweefsels werden gefixeerd in formaldehyde en onderworpen aan histopathologische analyse. Aanvullende immunohistochemie, microarray-analyse en realtime RT-PCR werden uitgevoerd op de lever- en nierweefsels van het subacute toxiciteitsonderzoek (100 mg/kg lg/dag).

4.3. Hematologische en serum biochemische analyse

Standaard hematologische tests werden uitgevoerd met behulp van een ADVIA 120 hematologiesysteem (Bayer, Fernwald, Duitsland). De volgende indicatoren werden gebruikt: aantal witte bloedcellen (WBC), aantal rode bloedcellen (RBC), hematocriet (HCT), hemoglobineconcentratie, gemiddeld corpusculair volume (MCV), gemiddeld corpusculair hemoglobine (MCH), aantal bloedplaatjes (PLT), aantal lymfocyten (LYM), monocyten (MON), neutrofielen (NEU), basofielen (BAS), eosinofielen (EOS) en grote ongekleurde cellen (LUC) en reticulocyten (RET).

De biochemische test werd uitgevoerd met behulp van een automatische analysator (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japan) met gecentrifugeerd serum. De belangrijkste biochemische indicatoren waren alanineaminotransferase (ALT), aspartaataminotransferase (AST), alkalische fosfatase (ALP), bloed-urinestikstof (BUN), creatinine (CREA), glucose (GLU), totaal cholesterol (TCHO), albumine/globuline-verhouding (A/G), triglyceriden (TG), totaal bilirubine (TB), gamma-glutamyltransferase (GGT), fosfolipiden (PL), calcium, chloride, anorganisch natrium, fosfor en kalium.

4.4. Histopathologisch en immunohistochemisch onderzoek

In paraffine ingebedde weefsels werden gesneden met een dikte van 5- µm, gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) en microscopisch onderzocht.

Het nierweefsel werd onderworpen aan immunohistochemie. De van paraffine ontdane en gewassen secties werden voorgeïncubeerd met 10% geitenserum om niet-specifieke kleuring te blokkeren. De objectglaasjes werden vervolgens een nacht geïncubeerd met het primaire anti-KIM1-antilichaam (1:750; Santa Cruz, CA, VS). Na de verwijdering van primaire antilichamen werden de secties verwerkt met VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, VK) en werd de KIM1-expressie onderzocht onder een lichtmicroscoop.

4.5. Microarray-analyse en eiwit-eiwitinteractie (PPI) -analyse

De lever en nier van de 1-week (100 mg/kg) groep werden gehomogeniseerd en het totale RNA werd geëxtraheerd met een RNase-minikit (Qiagen). cDNA-synthese werd bereikt met behulp van een cDNA-synthesekit (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, VS) en onderworpen aan microarray- en PPI-analyses.

Microarray-analyse werd uitgevoerd met Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 met GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, VS), en de resultaten werden verwerkt met behulp van GeneSpring GX v13.0-analysesoftware (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS). De differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's), die meer dan 1.5-voudig veranderden na toediening van ifosfamide, werden geselecteerd met behulp van een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) met Tukey's post-hoctest. De biologische functies en canonieke routes van de geselecteerde DEG's werden geanalyseerd met behulp van de Ingenuity Pathway Analysis-software (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, VS), en een stroomopwaartse regulatoranalyse werd uitgevoerd om de stroomopwaartse regulatoren te identificeren die mogelijk verantwoordelijk zijn voor de DEG's die zijn afgeleid van ifosfamide-toxiciteit. Aanvullende eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerkanalyse van de DEG's werd uitgevoerd met behulp van STRING-software (versie 10), en de interactie werd bevestigd toen de gemiddelde betrouwbaarheidsscore hoger was dan 0,4. Eiwitinteractie is de geschatte waarschijnlijkheid dat er een voorspelde link bestaat tussen twee eiwitten in de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes-route.

4.6. Kwantitatief realtime RT-PCR-onderzoek

De expressie van gemeenschappelijke regulatorgenen in de microarray-studie werd bevestigd met behulp van kwantitatieve realtime RT-PCR. Genspecifieke primers werden verkregen van Bioneer (Daejeon, Korea). De primersequenties waren als volgt: interferonregulerende factor 7 (IRF7): vooruit, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 en omgekeerd, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubiquitine-specifieke peptidase 18 (USP18): vooruit, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 en omgekeerd 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; radicaal S-adenosylmethioninedomein dat 2(RSAD2) bevat: voorwaarts, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 en omgekeerd, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; interferon-gestimuleerd gen 15 (ISG15): vooruit, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3en omgekeerd, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Totaal RNA werd omgekeerd getranscribeerd naar cDNA met behulp van SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, VS) en oligo-dT-primers, volgens de instructies van de fabrikant. mRNA-expressieniveaus van stroomopwaartse regulerende genen werden geanalyseerd met behulp van het theStepOnePlus Real-Time PCR-systeem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, VS) met een SYBR Green-mastermix (Applied Biosystems), volgens het protocol van de fabrikant. De 18S ribosomale RNA-primer werd gebruikt als een interne controle en de resultaten werden uitgedrukt als een veelvoud van verandering ten opzichte van de normale controlegroep.

4.7. Statistische analyse

De gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van meerdere vergelijkingsmethoden. Toen de Bartlett-test geen significante afwijkingen van de variantiehomogeniteit liet zien, werd variantieanalyse (ANOVA) gebruikt om te bepalen of een van de groepsgemiddelden verschilde op het significantieniveau van p < {{0}}.05.="" bovendien="" werd="" de="" dunnett-test="" gebruikt="" om="" verschillen="" in="" gegevens="" tussen="" de="" controle-="" en="" behandelingsgroepen="" te="" bepalen="" wanneer="" de="" gegevens="" significant="" bleken="" te="" zijn="" uit="" de="" anova-test.="" bovendien,="" wanneer="" significante="" afwijkingen="" van="" de="" variantiehomogeniteit="" werden="" waargenomen="" uit="" de="" bartlett-test,="" werd="" een="" niet-parametrische="" vergelijkingstest,="" kruskal-wallis="" (h)="" -test,="" uitgevoerd="" om="" te="" bepalen="" of="" een="" van="" de="" groepsgemiddelden="" verschilde="" bij="" de="" p=""><0, 05.="" wanneer="" een="" significant="" verschil="" werd="" waargenomen="" in="" de="" kruskal-wallis="" (h)="" -test,="" werd="" de="" dunn's="" rank-subtest="" uitgevoerd="" om="" de="" specifieke="" paren="" van="" groepsgegevens="" te="" kwantificeren="" die="" significant="" verschilden="" van="" het="" gemiddelde.="" fisher's="" exact-test="" werd="" uitgevoerd="" om="" gegevensparen="" (inclusief="" prevalentie="" en="" percentage)="" te="" vergelijken.="" de="" waarschijnlijkheidsgraad="" werd="" vastgesteld="" op="" 1="" of="" 5="" procent.="" statistische="" analyses="" werden="" uitgevoerd="" door="" de="" gegevens="" van="" de="" verschillende="" behandelingsgroepen="" te="" vergelijken="" met="" die="" van="" de="" controlegroep="" met="" behulp="" van="" path/tox="" (versie="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Verklaring van beschikbaarheid van gegevens:

Gegevens zijn opgenomen in het artikel of de aanvullende materialen.

Belangenverstrengeling:

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Referenties

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Hoge dosis ifosfamide bij recidiverende en inoperabele patiënten met hooggradig osteosarcoom: een retrospectieve serie. Cellen 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Bijwerkingen van ifosfamide. Oncologie 2003, 65, 7-10. [Kruisref]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. De groeipijnen van ifosfamide. clin. Nier J. 2020, 13, 500-503. [Kruisref]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, ik.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3e; Antman, KH Hooggedoseerde ifosfamide / carboplatine / etoposide met autologe hematopoëtische stamcelondersteuning: veiligheid en toekomstige richtingen. Semin. Oncol. 1994, 21, 83-85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sequentiële cursus en prospectief beheer van door ifosfamide geïnduceerde toxiciteit voor meerdere organen. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525-528. [Kruisref]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrome P450 3A en 2B6 in de zich ontwikkelende nier: implicaties voor ifosfamide-nefrotoxiciteit. Kinderarts Nefrol. 2005, 20, 872-885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Doorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB-samenvatting: Ifosfamide-routes, farmacokinetiek en farmacodynamiek. Farmacogenet. genoom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein en chlooracetaldehyde: een onderzoek naar de cel- en celvrije biomarkers van toxiciteit. Chem. Biol. Interactie. 2013, 202, 259-266. [Kruisref]
9. Kim, J.; Shin, M. Een integratief model van voorspelling van door geneesmiddelen geïnduceerde toxiciteit door meerdere organen met behulp van genexpressiegegevens. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [Kruisref]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Modos, D.; Bender, A. Ontwikkelingen in toxicogenomics: het begrijpen en voorspellen van door verbindingen geïnduceerde toxiciteit op basis van genexpressiegegevens. Mol. Omics 2018, 14, 218-236. [Kruisref]
11. Een, YR; Kim, JY; Kim, YS Constructie van een voorspellend model voor het evalueren van toxiciteit bij meerdere organen. Mol. Cel Toxicol. 2016, 12, 1-6. [Kruisref]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamide en cyclofosfamide: effecten op immunosurveillance. Oncologie 2003, 65, 17-20. [Kruisref]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Door chlooracetaldehyde en acroleïne geïnduceerde dood van menselijke proximale tubuluscellen. Kinderarts Nefrol. 2006, 21, 60-67. [Kruisref]
14. Ensergueix, G.; Pallet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Ifosfamide-nefrotoxiciteit bij volwassen patiënten. clin. Nier J. 2020, 13, 660-665. [Kruisref]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. Een overzicht van de antineoplastische activiteit, farmacokinetische eigenschappen en therapeutische werkzaamheid bij kanker. Geneesmiddelen 1991, 42, 428-467. [Kruisref]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Planten, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Fase I studie over docetaxel en ifosfamide bij patiënten met gevorderde solide tumoren. Br. J. Kanker. 1998, 77, 153-158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Chronische ifosfamide-nefrotoxiciteit bij kinderen. Med. Pediatrisch Oncol. 2003, 41, 190-197. [Kruisref]
18. Scherp, P.; Vilano, JS De laboratoriumrat; CRC Press: Boca Raton, FL, VS, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Acute levertoxiciteit met ifosfamide bij de behandeling van sarcoom: een casusrapport. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Gebruik van transcriptomics bij het begrijpen van mechanismen van door geneesmiddelen geïnduceerde toxiciteit. Farmacogenomica 2010, 11, 573-585. [Kruisref]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Transcriptomische analyse van het effect van ifosfamide op MDCK-cellen gekweekt in microfluïdische biochips. Genomics 2012, 100, 27-34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutathionconjugatie van het cytostatische geneesmiddel ifosfamide en de rol van menselijke glutathion-S-transferasen. Chem. Onderzoek Toxicol. 1995, 8, 979-986. [Kruisref]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-mercaptoethaan-natriumsulfonaat) functioneert als een regulator van myeloperoxidase. Vrije Radicaal. Biol. Med. 2017, 110, 54-62. [Kruisref]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-acetylcysteïne verzwakt oxidatieve stress en glutathion-afhankelijke redox-onbalans veroorzaakt door behandeling met hoge glucose / hoog palmitinezuur in Rin-5F-cellen van de pancreas. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [Kruisref]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, een nieuwe regulerende factor voor interferon geassocieerd met latentie van het Epstein-Barr-virus. Mol. Cel Biol. 1997, 17, 5748-5757. [Kruisref]
26. Pagano, JS Virussen en lymfomen. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78-79. [Kruisref]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Gouba, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Verschillende rollen voor IFN-regulerende factor (IRF) -3 en IRF -7 bij de activering van antitumoreigenschappen van menselijke macrofagen. Kanker onderzoek. 2006, 66, 10576-10585. [Kruisref]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Activering, regeling, wijziging en functie. Genen Immuun. 2011, 12, 399-414. [Kruisref]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3 / IRF7 verzwakt ontstekingsreacties via een TLR4-signaleringsroute. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, WIJ; Tesar, BM; Goldstein, DR Veroudering schaadt de opregulatie van IFN-regulerende factor 7 in plasmacytoïde dendritische cellen tijdens TLR9-activering. J. Immunol. Onderzoek 2008, 181, 6747-6756. [Kruisref]