JAK-remmer blokkeert door COVID-19-cytokine-geïnduceerde JAK-STAT-APOL1-signalering in glomerulaire cellen en podocytopathie in menselijke nierorganoïden Ⅱ

Onze resultaten verschuiven het huidige paradigma van interferon-geïnduceerdAPOL1-nefropathie. Diverse voorbeelden binnenwelke hoge interferontoestanden instortende glomerulopathie veroorzaakten bij dragers van een hoog risicoAPOL1genotypeleidde tot een paradigma waarin interferonen werden bevoorrecht als de belangrijkste triggers voor de tweede treffer van APOL1-gemedieerdglomerulopathie (31, 36, 37). Dit paradigma werd verder versterkt door het feit dat interferon alfa, bèta,en gamma-geïnduceerdAPOL1expressie in gekweekte podocyt- en endotheelcellijnen (22). Echter,Dit archetype wordt uitgedaagd door de waarneming dat interferonen niet altijd in het serum aanwezig zijnpatiënten meeCOVID-19 infectieen COVAN, terwijl andere cytokinen waaronder IL-6, IL-1 , en IL-18worden verhoogd (4, 17, 18). In de huidige studie hebben we aangetoond dat zelfs bij afwezigheid van interferonendeze niet-interferon-cytokinen induceerden individueel en collectief robuustAPOL1expressie in de menspodocyten en GEC's, terwijl ook een voorheen niet gewaardeerd synergisme wordt benadrukt. Door te demonstrerendat JAK-STAT-signalering de centrale mediator is van deze gecombineerde cytokine-effecten, zo blijkt uit onze resultateneen plausibele verklaring voor de werking van de COVID-19 cytokinestormAPOL1expressie en de highincidentie van collapserende glomerulopathie gezien bij patiënten met een risicovariantAPOL1EnCOVID-19infectie. Deze bevindingen kunnen gevolgen hebben voor anderenAPOL1-gemedieerde nefropathieën.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Voor meer informatie kunt u contact met ons opnemen via:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Telefoon/Whatsapp: +86 15292862950

Terwijl onze resultaten dat aantonenDoor COVID-19-geïnduceerde cytokineszijn voldoende om te inducerenAPOL1uitdrukkingen het verlies ervan veroorzakenmicro-organoïde podocyten in de nierensluiten ze niet de mogelijkheid uit dat SARs-CoV-2 kan ook rechtstreeks niercellen infecteren, zoals onlangs werd gemeld (38, 39). SAR's-CoV-2in menselijk nierweefsel is alleen aangetoond in autopsiespecimens waarbij de confounding aanwezig wasbijdrage van weefselautolyse kon niet worden uitgesloten (3, 4, 15, 16). De meeste meldingen komen uit nierbioptenvan de patiënten met COVAN is er niet in geslaagd het SARs-CoV-2-virus te detecteren ondanks het gebruik van gevoelige methoden (3, 4),waaronder twee van de negen gevallen in de huidige studie die werden getest door immunohistochemie en insitu-hybridisatie.

Door cytokine-geïnduceerde podocytopathie aan te tonen, week ons niermicro-organoïdemodel af van deonlangs gepubliceerdnier organoïdemodel van APOL1-gemedieerde nierziekte door Liu et al.gegenereerde nierorganoïden uit CRISPR-bewerkte iPSC's van een niet-Afrikaanse donor waarin G0APOL1allelen werden bewerkt tot G1-allelen, maar met een G0 genetische achtergrond. Terwijl interferon-gamma-geïnduceerdAPOL1expressie in hun organoïden veroorzaakte het geen cytotoxiciteit (40). Het gebrek aan cytotoxiciteit in hunnier organoïdemodel zou de minder toxische genetische achtergrond waarop G1-mutaties berusten, kunnen verklarenwerden over elkaar heen gelegd. Het is bekend dat de cytotoxiciteit vanAPOL1haplotype wordt beïnvloed door zijn geneticaachtergrond (41). Denier micro-organoïdein de huidige studie werd gegenereerd op basis van onbewerkte iPSC'svan een Afro-Amerikaanse drager van het G1G2-genotype. Het behoud van het inheemse genetische haplotype kan dat wel zijnhebben bijgedragen aan de APOL1-geassocieerde cytotoxiciteit die wordt waargenomen in onzenier micro-organoïden.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Bovendien rapporteren we hier, in tegenstelling tot de opgereguleerde APOL1-eiwitexpressie, een recente studievond er geen verschil inAPOL1mRNA-niveau in de nierbiopsie van één patiënt met COVAN vergeleken metgezonde controles (26). Deze onenigheid in onze resultaten kan worden verklaard door de voorbijgaande aard vanAPOL1mRNA ten opzichte van eiwit, vooral wanneer biopsieën enkele weken na de initiële biopsieën werden verkregendiagnose van een COVID-19-infectie toen de acute effecten van COVID-19- een cytokinestorm veroorzaakten en dehet overeenkomstige mRNA-expressieprofiel kan zijn verdwenen. Het is denkbaar dat hoe verder men isvan de door COVID-19-geïnduceerde cytokinestorm, hoe zwakker de acute fase-reactanten stroomafwaarts van decytokinereceptor wordt, inclusief gefosforyleerde STAT-eiwitten enAPOL1mRNA. Onze resultatensuggereren dat het geïnduceerde APOL1-eiwit daarna blijft bestaanAPOL1mRNA en gefosforyleerde STAT's.

Deze studie heeft drie belangrijke klinische implicaties. Ten eerste onderstrepen ze de noodzaak om Black or te genotyperenBij Spaanse individuen is een instortende glomerulopathie vastgesteld in de context van actieve of recente COVID-19infectie. Echter, alsnierbiopsieniet haalbaar of mogelijk is,APOL1genotypering van Black ofMet Spaanstalige COVID-19-geïnfecteerde personen met nieuwe of verslechterende proteïnurie en AKI is het waarschijnlijk dathoge opbrengst. Ten tweede omdat meerdere door COVID-19-geïnduceerde cytokines de JAK-STAT redundant activerentraject teweeg te brengenAPOL1expressie, een therapeutische strategie gebaseerd op selectieve verwijdering ofHet is onwaarschijnlijk dat remming van een bepaald cytokine effectief is bij het voorkomen of behandelen van COVAN. Momenteel,baricitinib is alleen goedgekeurd voor gebruik onder een toestemming voor gebruik in noodgevallen voor de behandeling van COVID-19extra zuurstof nodig. Daarom is het potentieel ervan als behandeling voor COVAN serieusoverweging, vooral voor zwarte en Latijns-Amerikaanse dragers met een hoog risicoAPOL1genotypen die dat hebbenCOVID-19 infectie. Ten slotte is dit gebaseerd op het bewijs dat een tekort aan interferon gepaard gaat met ernstigeCOVID-19-infectie, werd voorgesteld interferon toe te dienen als therapie voor COVID-19. Bij deop het moment van schrijven zijn er volgens ClinicalTrials.gov zesendertig klinische onderzoeken met interferon als therapie bijCOVID-19 zijn lopende of voltooid. In tegenstelling tot de grondgedachte achter deze klinische onderzoeken, hebben onzeresulteert in voorzichtigheid tegen de toediening van interferonen als behandeling voor COVID-19-infectie bij dragers vanhoog risicoAPOL1genotype omdat interferonen de expressie van pathogenen zouden kunnen opregulerenAPOL1indenier en precipiteert COVAN.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Onze studie heeft enkele beperkingen. Onze COVAN-casusreeks van negen door biopsie bewezen instortingenGevallen van glomerulopathie vormen een relatief kleine steekproefomvang en hebben de associatie mogelijk onderschattussen hoog-risico genotype en COVAN of onderhevig geweest aan sampling bias. De logistieke uitdaging vanhet verkrijgen van nierbiopten van patiënten met een actieve COVID-19-infectie in de acute zorg beperkt defrequentienierbioptenin deze populatie. Dezelfde factor is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het feit datDe meeste biopsieën in dit onderzoek werden enkele weken tot maanden na de initiële diagnose uitgevoerdCOVID-19 infectie. Analyse van nierbiopten die dichter bij de infectieuze trigger zijn verkregen, kan uitkomst biedenaanvullende inzichten in vroege cellulaire fenotypes. Bovendien identificeert het huidige onderzoek niet wieen wanneer COVAN moet worden behandeld met JAK-remmers. Antwoorden op deze vragen en de vaststelling van dede werkzaamheid van JAK-remming als behandeling voor COVAN zal de focus zijn van toekomstige onderzoeken.Dit werk benadrukt de associatie van een hoog risicoAPOL1genotype en de rol van JAK-STAT-APOL1signalering in de ontwikkeling van COVAN. Naarmate ons begrip van de COVID-19-pandemie zich ontwikkelt,Er is een dringende noodzaak om het bewustzijn van artsen en de volksgezondheid over de niercomplicaties te vergrotenvan COVID-19. Er is ook dringend behoefte aan COVAN-therapie. Onze studie biedt nieuwe gegevens over JAKremmers als sterke therapeutische kandidaten voor APOL1-geassocieerde COVAN.

Methoden

Antilichamen en reagentia.

Er werden primaire antilichamen tegen de volgende eiwitten gebruikt: APOL1 konijnanti-menselijk [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (eindconcentratie 0,05 ug/ml);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (eindconcentratie 0,95 ug/ml) volgens recent rapport (42)];APOL1 muis anti-humaan [Genentech, 4.17A5; Immunofluorescentie [IF] 1:2000 (eindconcentratie2,13 µg/ml)]; GAPDH muis anti-humaan (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); Vinculinmuis anti-mens (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 muis anti-menselijk (Santa CruzBiotechnologie, sc373787; WB 1:300); WT1 konijn anti-humaan (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1muis anti-mens (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); STAT2 konijn anti-mens(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 muis anti-humaan (CST, 9139; WB 1:1000); GefosforyleerdSTAT1 (Y701) konijn anti-humaan (CST, 9167; WB 1:1000); Gefosforyleerd-STAT2 (Y690) konijnen-antimenselijk (CST, 88410; WB 1:1000); Gefosforyleerd-STAT3 (Y705) konijn-anti-humaan (CST, 9145; WB1:2000); PODXL geit anti-humaan (R&D, AF1658; IF 1:500), E-Cadherine konijn anti-humaan (celSignalering, 3195S; IF 1:200), NEPH1 muis anti-menselijk (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). Ondergeschiktantilichamen omvatten geit-anti-konijn-IgG, HRP-gekoppeld antilichaam (CST, 7074s; WB 1:1000); paard antimuizen-IgG, HRP-gekoppeld antilichaam (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 geconjugeerde ezel antimuis (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 geconjugeerde ezel antigeit (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) en Alexa Fluor 405 geconjugeerde ezelanti-konijn (Thermo Scientific, A48258; 1:000). Voor qRT-PCR, TaqMan-genexpressietestsomvatte APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) en PECAM-1 (Hs00169777_m1).Nierimmunohistochemische kleuring voor APOL1, synaptopodine en CD31. Beginnend met formaline gefixeerdin paraffine ingebedde objectglaasjes van nierbiopten, antigeen-extractie werd uitgevoerd met (EDTA-oplossing bij pH 8.0)gedurende 56 minuten op 100 graden. Primaire antilichamen tegen APOL1 (5.17D12, Genentech), synaptopodine (ProgenBiotechnik, 61094) en CD31 (Cell Signaling, 3528s) werden toegepast in een verhouding van 1:4000 (eindconcentratie 0,95ug/ml), 1:100 en 1:1600, respectievelijk gedurende 60 minuten bij 36 graden. Gebruiksklaar HQ-geconjugeerdsecundaire anti-konijnmultimeren (760-4815) werden gedurende 12 minuten bij 36 graden geïncubeerd. Dit werd gevolgddoor de toevoeging van anti-HQ HRP gedurende 12 minuten. DAB (760-159) werd 5 minuten bij kamer geïncubeerdtemperatuur. De weefselsectie werd gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur tegengekleurd met hematoxyline (760-2021).Blauwingsreagens (760-2037) werd gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur toegevoegd.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY

Cytokinebehandeling van gekweekte cellen.

Primaire menselijke glomerulaire endotheelcellen, primaire podocytensubcultuur van menselijke donornier, en van organoïden afgeleide podocyten werden behandeld met 50 ng / ml,Concentratie van 20 ng/ml of 10 ng/ml van de volgende cytokines: Recombinant menselijk CXCL9(Biolegend, 578102); Recombinant menselijk CXCL10 (Biolegend, 573502); Recombinante mensCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); Interferon (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbèta (Peprotech, 300-02BC); IFN-gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alfa (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Een gestandaardiseerde cytokineconcentratie van 50 ng/ml werd vooraf bepaald op basis van een precedentbehandelingen met menselijke cellen ter evaluatie van cytokine-shocksyndromen bij COVID-19-infectie (17). Opvolgenexperimenten gebruikten concentraties van 20 ng/ml en 10 ng/ml. Daaropvolgende behandelingen, inclusief organoïdeen van organoïden afgeleide podocytexperimenten werden uitgevoerd met behulp van 10 ng/ml. JAK 1/2 remmer,baricitinib (INCB028050) (Selleckchem, S2851), werd gebruikt bij een eindconcentratie van 10 uM in alleexperimenten.

Primaire menselijke glomerulaire endotheelcelcultuur. De bevrorenvoorraad primaire mensen met een laag risico (G0G0).glomerulaire endotheelcellen werden gekocht bij Celprogen (36066-05), ontdooid en gekweekt in menselijkeglomerulaire endotheliale primaire celcultuur compleet medium met serum, antibioticavrij (Celprogen,M36066-05SA) op platen gecoat met eigen extracellulaire matrix (Celprogen, E36066-05-PD10 enE36066-05-12Nou) in de bevochtigde omgeving bij 37 graden en 5% CO2. Cellen werden gepasseerd met behulp van 1XTrypsine EDTA (Celprogen, T1509-014). Cellen werden gebruikt voor experimenten tussen passages 2 tot en met 4.Cellen werden gevalideerd door qRT-PCR, wat een verrijking in PECAM1-genexpressie aantoont (endotheelcelcellen).marker, ook bekend als CD31).

Glomerulaire isolatie van menselijke donornieren en podocytensubcultuur.Menselijke donornier wasverkregen via de National Disease Research Interchange (NDRI). Het donor-APOL1-genotype wasG0G1. Glomerulaire isolatie werd uitgevoerd met behulp van de zeefmethode, aangepast aan eerdere publicatie (43,44). Kort gezegd, terwijl we op ijs in een steriele kap werkten, werd de nier eerst ontkapseld en halverwege sagittaal doormidden gesneden. De medulla werd weggesneden, waarbij de cortex achterbleef. De cortex werd vervolgens fijngehakten achtereenvolgens door roestvrijstalen zeefgaas (maten 425 µm, 250 µm) gevoerd en verzameld opbovenkant van een derde zeef (150 µm) terwijl u regelmatig wast met voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)met 1% BSA (zonder calcium en magnesium) (Endecotts, Zeven 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Glomeruli werden verzameld, gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in 5 ml PBS. 10 µl van het monsterwerden gekleurd met NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) en gevisualiseerd door lichtmicroscopie. Glomeruli werden vervolgens geïncubeerd in verteringsbuffer[DMEM/F12, 1 mg/ml elk van (collagenase I, IV en V), DNAse I (50 U/ml of 50 µg/ml)] bij 37 graden voor1 uur om een enkele celsuspensie te verkrijgen (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 met 10% FBS (R&D-systemen,S10350H) werd toegevoegd om de vertering te stoppen en het monster werd bij 4 graden Celsius bij 450 g minuten gecentrifugeerd.Geïsoleerde podocyten werden in subcultuur gebracht in Advanced RPMI (Fischer Scientific, MT10040CV) met 10% FBSen 1% penicilline-streptomycine (Thermo Fisher Scientific, 15070063) op met vitronectine gecoate platen(StemCell Technologies, 07004) bij 37 graden en 5% CO2. In subcultuur gebrachte cellen waren na ongeveer 5 dagen zichtbaarwerden na 2 weken kweken behandeld.

Eiwitextractie en Western-blotting.Alle kweekplaten en monsters werden op 4 graden gehouden. Een monolaagcellen werd gelyseerd en geoogst met Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, 9803) met volledigemini-proteaseremmer en fosfataseremmer (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

De monsters werden elk 10 seconden gesoniceerd op niveau 4, gecentrifugeerd bij 12.000 rpm x 5 minuten, waarbij het supernatantwerd verzameld in een nieuwe Eppendorf-buis en de eiwitconcentratie werd bepaald door middel van BCA-eiwittest(Pierce, 23225). Eiwitlysaten werden verdund met 4x LaemmLi-monsterbuffer 2-mercaptoethanol(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) en gedurende 5 minuten verwarmd op 95-100 graad. Eiwitlysatenwerden vervolgens gescheiden met Criterion TGX vlekvrije gels (4-20%) en overgebracht met behulp van de Bio-Rad TransBlot Turbo-overdrachtssysteem. Overgebrachte membranen werden gedurende 1 uur geblokkeerd in 3% magere melk in Tris-gebufferdzoutoplossing en overnacht bij 4 graden geïncubeerd met specifieke primaire antilichamen. De volgende dag ernastandaard wassen werden de membranen geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundairantilichaam gedurende minimaal 1 uur bij kamertemperatuur voorafgaand aan beeldvorming met Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging Systemvolgens de instructies van de fabrikant.

RNA-extractie en qRT-PCR.RNA werd geïsoleerd uit de celmonolaag met behulp van RLT-lysebuffer enQiagen RNEasy Mini Kit (74106) volgens de instructies van de fabrikant. RNA werd getranscribeerd naar cDNA met behulp vanInvitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase-reagentia en protocol (Thermo Fisher, 18091050).qRT-PCR-reacties werden uitgevoerd met Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) en genexpressietests met behulp van het QuantStudio 6 Flex-systeem(Thermo Fisher Scientific) met behulp van ∆∆Ct methode met GAPDH als referentiegen.

Genotypering.DNA werd geëxtraheerd uit FFPE-weefselblokken met behulp van de QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen, 56404) volgens het protocol van de fabrikant. Genotypering werd uitgevoerd met behulp van Applied BiosystemsTaqman allelische discriminatietesten voor G1 SNP (p.Ser342Gly) en G2-polymorfisme(p.Asn388_Tyr389del) met QuantStudio 6 Flex-systeem. Deze test heeft 100% analytische specificiteit eneen analytische gevoeligheid (detectielimiet) van 1,0ng DNA voor de detectie vanAPOL1risicovarianten in DNAgeëxtraheerd uit perifere bloedmonocyten. Assays werden eerder gevalideerd door de resultaten te vergelijken metdirecte sequencing (Sanger-sequencing). Kwaliteitscontrolemaatregelen voor genotypering omvatten het gebruik vantechnische replicaties, 100% matching van positieve controles van elk genotype en negatieve controles.

Afleiding van iPSC-niermicro-organoïde van G1G2-patiënt.Niermicro-organoïden werden verkregen volgens degepubliceerd protocol (27), met enkele wijzigingen. In het kort: geïnduceerde menselijke pluripotente stamcellen (iPSC)werden gedissocieerd in afzonderlijke cellen met behulp van TrypLE Select en uitgezaaid op met vitronectine gecoate platenStemFlex-media (Thermo Fisher Scientific, A3349401) met 10 uM Rho-kinaseremmer (TocrisBiowetenschappen, 1254) bij een dichtheid van 11,000-14,000 cellen/cm2 en gekweekt in een bevochtigde omgeving op37 graden en 5% CO2. Cellen werden vervolgens overgebracht naar TeSR-E6-media (Stemcell Technologies, 05946).8 µM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) gedurende 4 dagen. Van dag 5 tot dag 7 werden de cellen behandeld met200 ng/ml FGF9, 1 µg/ml heparine en 1 µM CHIR99021. Op dag 7 werden de cellen gewassen met PBS engedissocieerd met TrypLE. Gedissocieerde cellen werden vervolgens gewassen met gewoon DMEM en gecentrifugeerd300xg gedurende 5 minuten. Celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in Stage 1-medium [TeSR-E6 dat 200 ng / ml bevatteFGF9, 1 µg/ml heparine, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA, 10 µM Rho-kinaseremmer (Tocris Bioscience)]en overgebracht naar een AggreWell 400-plaat met 24-wells (Stemcell, 34411) bij ongeveer 1,2 miljoencellen/putje. De plaat werd vervolgens 3 minuten bij 100 x g gecentrifugeerd en 48 uur bij 37 graden geïncubeerd.5% CO2 in een standaard celkweekincubator. Na 48 uur (dag7+2) waren de organoïden uit de AggreWellovergebracht naar een 6-well lage bevestigingsplaat met Stage2-media [TeSR-E6 met 200 ng/ml FGF9, 1µg/ml heparine, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA] op een orbitale schudder in de celincubator voor nog eens 72uur. Vanaf dag 7+5 werden alle organoïden vernieuwd met fase 3-media [TeSR-E6 bevattende0,1% PVA] op alternatieve dagen totdat het voor experimenten wordt gebruikt.

Podocytisolatie van micro-organoïde.Isolatie van glomeruli uit nierorganoïden werd aangepast van aeerder beschreven protocol (45). In het kort: groepen van iPSC-afgeleide nierorganoïden met een initiaalstartcelnummer van 1,2x106 iPSC's werden gedissocieerd door incubatie met TrypLE select (ThermoFisher) gedurende 5 minuten bij 37 graden. Ter ondersteuning werd er elke 2-3 min voorzichtig gemengd met een pipet van 1 mldissociatie. Per groep werd een enkele celzeef van 70 µm (PluriSelect) op een buis van 50 ml (Falcon) geplaatsten het gaas werd gehydrateerd met PBS. De celoplossing werd met behulp van een pipet van 1 ml aan het mengsel toegevoegd, waardoor doorstroming mogelijk werd gemaaktvan de oplossing door de zwaartekracht. Gebruik de zuiger van een steriele injectiespuit van 1 ml om de resterende cel te verwijderende op de zeef opgevangen oplossing werd voorzichtig door het gaas geduwd. De zeef werd gewassenPBS en weggegooid, waardoor de cel doorstroomt. De celdoorstroom werd vervolgens gepipetteerd op een voorgehydrateerde cel40 µm celzeef (Pluriselect) en op een nieuw buisje van 50 ml (Falcon) geplaatst, waardoor afzonderlijke cellendoor de zwaartekracht door te laten stromen en de zeef uitgebreid te wassen met PBS om eventuele resterende single te verwijderencellen. De grootste glomeruli werden vervolgens uit de celzeef van 40 µm verzameld door de zeef om te keren opeen nieuw buisje van 50 ml en gewassen met PBS om de gevangen glomeruli weg te spoelen. Dit proces washerhaald met behulp van doorstroom van een 40 µm-proces met behulp van de laatste 30 µm-celzeef (PluriSelect) omverzamel de kleinere glomeruli. Er werden geïsoleerde glomeruli van van IPSC afkomstige nierorganoïden gekweektmet vitronectine gecoate platen met geavanceerde RPMI 1640 die 10% FBS bevatten in een standaard celcultuurbroedmachine op 37 graden plus 5% CO2. De media werden om de dag ververst totdat de cellen werden gebruiktexperimenten.

Immunofluorescentiekleuring, micro-organoïde.Niermicro-organoïden werden gewassen met PBS engefixeerd in 4% PFA in PBS gedurende 30-45 min op ijs. Vaste organoïden werden vervolgens driemaal gewassen met PBS,en een nacht bij 4 graden geïncubeerd in 30% sucrose in PBS. Organoïden werden ingebed in OCT enonderworpen aan cryosectie van 10 µm met een Laica-cryostaat. Organoïde cryosecties werden drie keer gewassenkeer met PBS en vervolgens geblokkeerd met blokkeringsbuffer 1 (1% visgelatine, 2% ezelenserum, 0,3% TritonX-100 in PBS) gedurende één uur bij kamertemperatuur. Vervolgens werden cryosecties geïncubeerd met primairantilichamen in blokkeerbuffer 1 overnacht bij 4 graden. Cryocoupes werden driemaal gewassen met PBS. NaBij het wassen werden de cryosecties gedurende 2 uur bij kamer geïncubeerd met secundaire antilichamen in blokkeerbuffer 1temperatuur. Na vijf wasbeurten met PBS werden de cryosecties gemonteerd met een Prolong Glass antifademontageoplossing (Thermo Scientific, P36980). Fluorescerende beelden werden gegenereerd met behulp van een ECHOmicroscoop.

Immunofluorescentiekleuring, podocyt.Podocytkweken werden gewassen met PBS en gefixeerd in 4%PFA in PBS gedurende 10-15 min bij kamertemperatuur. Na fixatie werden de cellen driemaal gewassen met PBSen geblokkeerd in blokkeerbuffer 2 (1% vissersgelatine, 2% ezelserum, 0,1% saponine in PBS) gedurende 30-60min. Cellen werden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met primaire antilichamen in blokkeerbuffer 2(of een nacht bij 4 graden). Cellen werden driemaal gewassen met blokkeerbuffer 2 en geïncubeerd metsecundaire antilichamen in blokkeerbuffer 2 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na drie wasbeurten metblokkeerbuffer 2 en een laatste wasbeurt met PBS, de cellen werden gemonteerd met een Drop-n-Stain EverBritemontagemedium (Biotium, 23008). Fluorescerende beelden werden vastgelegd met behulp van een ECHO-microscoop.

Levensvatbaarheid testen. Voor cellevensvatbaarheid en ATP-metingen werden van organoïden afkomstige podocyten uitgeplaatop met vitronectine gecoate 96-wellplaat in 100 µl media (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) en gekweekt in geavanceerde RPMI+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) in een bevochtigde omgeving bij 37 graden en 5% CO2. Van organoïden afkomstigpodocyten werden gelijktijdig uitgeplaat op 6-wellplaat om te gebruiken voor RNA-extractie voor qPCR enop een 24-wellplaat voor gebruik voor immunohistochemie (IHC). Cellen werden behandeld met een confluentie van ~80%met zes condities [controle, IFNG (10 ng/ml), IFNG (10 ng/ml) + baricitinib (eindconcentratie 10 uM),Alle cytokinen (10 ng/ml) en alle cytokinen (10 ng/ml) + baricitinib (eindconcentratie 10 uM)]. Mediawerd om 48 uur vervangen en de cellen werden om 96 uur geëvalueerd. 96-De putplaat werd verwerkt met behulp van Promegacellevensvatbaarheid en ATP-testen zoals hieronder verder vermeld; de 6-putjesplaat werd verwerkt op RNAextractie, cDNA-synthese en qRT-PCR; en de 24-putjesplaat werd gefixeerd in 4% PFA voor IHC. CelTiterFluorTMCellevensvatbaarheidstest (Promega, G6080) en CellTiter-Glo® 2.0 Test (Promega, G9241) wasuitgevoerd met behulp van standaardprotocolinstructies van de fabrikant. De testen werden gemultiplextper protocol. Fluorescentie (niet-lytische proteasetest) en luminescentie (lytische ATP-test) waren dat welgemeten met behulp van een SpectramaxM3 fluorometer. Het verschil in maatregelen werd bepaald door Studentongepaarde t-test.

Statistieken.Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Voor de gegevens werd GraphPad Prism 8.3.1-software gebruiktanalysis. Cytokine conditions inducing >1,5 vouwAPOL1transcript vergeleken met met media behandelde controlewerden op significantie geanalyseerd met behulp van een ongepaarde t-test met Holm-Sidak-correctie voor meerderevergelijkingen. De gerapporteerde P-waarden zijn de aangepaste p-waarden. De betekenis werd vastgesteld op p<0.05.

Goedkeuring studie. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van Duke University,Noord Carolina. De geïnformeerde toestemming van de patiënt was niet vereist door de IRB omdat het casusgedeelte hiervan isHet onderzoek was uitsluitend een retrospectieve beoordeling van klinisch en gearchiveerd pathologisch materiaal. Menselijke nier voorglomerulaire isolatie en podocytensubcultuur werden verkregen via het National Disease ResearchUitwisseling (NDRI); dit onderzoek naar menselijk weefsel was ook vooraf goedgekeurd via Duke's IRB. NDRIvereist dat alle weefselbronlocaties geïnformeerde toestemming verkrijgen van de weefseldonor of -surrogaat.

AuteursbijdragenSEN, GL, SD, KS en DS voerden experimenten uit en bewerkten manuscripten. AW en DT traden op eninterpreteerde histopathologie en IHC, en redigeerde het manuscript. GH droeg essentiële reagentia bij en gaf het uitmanuscript. SEN en OAO ontwierpen het onderzoek, analyseerden en interpreteerden gegevens, ontwierpen cijfers enschreef en redigeerde het manuscript.

DankbetuigingenDit werk werd ondersteund door 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 en de Whitehead Scholar Award(OAO); SEN werd ondersteund door Duke Nephrology T32 Training Grant (5T32DK007731-24). Wij dankenSuzie Scales (Genentech) voor de genereuze gift van APOL1-specifieke antilichamen. Wij danken het OnderzoekHistologielaboratorium bij Duke BRPC en Steven R. Colon bij PhotoPath, Duke Department of Pathology.

Referenties

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, et al. AKI bij ziekenhuispatiënten met COVID-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, et al. Acuut nierletsel bij patiëntenin het ziekenhuis opgenomen met COVID-19.Nier Int.2020;98(1):209-18.

3. Mei RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, et al. Een retrospectief cohort met meerdere centrastudie definieert het spectrum van nierpathologie bij de ziekte van Coronavirus 2019 (COVID-19).Nier Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, et al. AKI en instortenGlomerulopathie geassocieerd met COVID-19 en APOL 1 hoogrisicogenotype.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95.

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et al. associatie vantrypanolytische ApoL1-varianten met nierziekte bij Afro-Amerikanen.Wetenschap.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ en Pollak MR. APOL1 Nefropathie: van genetica tot klinische toepassingen.Clin J Am SocNefrol.2020.

7. Friedman DJ en Pollak MR. APOL1 en nierziekte: van genetica tot biologie.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. Missense-mutaties in de APOL1gen zijn sterk geassocieerd met het risico op nierziekte in het eindstadium dat eerder aan het MYH9-gen werd toegeschreven.Hum Genet.2010;128(3):345-50.