Karnovsky's fixeermiddel voorkomt dat artefacten verschijnen als vacuolatie afkomstig van weefselverwerking in nieren die zijn behandeld met antisense-oligonucleotide Ⅰ

Samenvatting: Antisense-oligonucleotide(ASO)-therapieën zijn geïdentificeerd als een nieuwe behandelingsmodaliteit voorhardnekkige ziekten. Innieren behandeld met ASO'sIn de proximale tubuli worden, naast basofiele korrels, vaak vacuolen waargenomen. Sommige rapporten hebben beschreven dat deze vacuolen waarschijnlijk een secundair fenomeen zijn dat voortkomt uit deextractie van ASO'stijdens weefselverwerking. In deze studie vergeleken we de niermorfologie na fixatie met Karnovsky's fixeermiddel of 4% paraformaldehydefosfaatbuffer (PFA) met die van 10% neutraal gebufferde formaldehyde-oplossing (NBF). Vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten, viermaal intraveneus behandeld met 50 mg/kg vergrendelde nucleïnezuur bevattende antisense-oligonucleotiden (LNA-ASO's) gedurende 1 of 2 weken, werden onderzocht. Microscopisch werden vacuolen en basofiele korrels in de proximale tubuli waargenomen in de nieren gefixeerd met NBF. Basofiele korrels zijn indicatief voor de accumulatie van ASO's. Bovendien bevatten sommige vacuolen ook zwakke basofiele korrels, wat suggereert dat de vacuolen relevant waren voor de accumulatie van ASO's. Hoewel matige vacuolatie werd waargenomen in de proximale tubuli, was het merendeel van de vacuolvormige epithelia negatief voor nierbeschadigingsmoleculen -1 bij immunohistochemische kleuring. Vacuolen in de proximale tubuli werden niet waargenomen in monsters onderworpen aan Karnovsky's fixatie, hoewel basofiele korrels werden waargenomen. In monsters onderworpen aan PFA-fixatie werden vacuolen en basofiele korrels waargenomen in de proximale tubuli, vergelijkbaar met die in monsters onderworpen aan NBF-fixatie. Over het geheel genomen hebben onze bevindingen de mogelijkheid aangetoond van overschatting van vacuolatie als gevolg van artefacten tijdens weefselverwerking bij gebruik van conventionele NBF-fixatie. Het fixeermiddel van Karnovsky wordt beschouwd als een nuttig alternatief om kunstmatige vacuolen te onderscheiden van echte nefrotoxiciteit. (DOI: 10,1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Trefwoorden:antisense oligonucleotide, artefact,Het fixeermiddel van Karnovsky, vacuolatie, basofiele korrel, nier

Cistanche Supplement Nierfunctieondersteuning Supplement PhGs75% Ech 30% Act 12%

Onlangs zijn antisense-oligonucleotide (ASO)-therapieën ontwikkeld als nieuwe modaliteiten voor de behandeling van hardnekkige ziekten1, 2. ASO's zijn korte, synthetische, enkelstrengige oligodeoxynucleotiden die binden aan ribonucleïnezuur en genexpressie onderdrukken3.

Toxicologisch worden ASO-geïnduceerde toxiciteiten onderverdeeld in hybridisatie-afhankelijke toxiciteiten, die gerelateerd zijn aan de ASO-sequentie, en hybridisatie-onafhankelijke toxiciteiten, die gerelateerd zijn aan chemische modificatie. Hybridisatie-onafhankelijke toxiciteiten worden veroorzaakt door drie hoofdmechanismen: 1) ASO-accumulatie, 2) pro-inflammatoire effecten en 3) aptamere bindingseffecten4. De accumulatie van ASO’s wordt voornamelijk waargenomen in de lever en de nieren, en overmatige accumulatie leidt tot disfunctie van deze organen5. Het pro-inflammatoire effect wordt geïnduceerd door de stimulatie van het aangeboren immuunsysteem via binding aan Toll-achtige receptoren bij knaagdieren en apen of activering van de alternatieve complementroute via remming van factor H door ASO's bij apen6. Het aptameerbindende effect induceert bloedplaatjesactivatie en aggregatie/trombocytopenie om de bloedplaatjesspecifieke receptor te binden7. Bovendien wordt aptamere binding aan intracellulaire eiwitten in hepatocyten beschouwd als een van de oorzaken van hepatotoxiciteit8-10. Om deze toxiciteiten op te sporen hebben onderzoekers verschillende niet-klinische testen ontwikkeld; hiervan is histopathologisch onderzoek een van de meest gevoelige tests om ASO-accumulatie te detecteren.

Histopathologisch wordt de accumulatie van ASO's gewoonlijk waargenomen als basofiele korrels in het cytoplasma van de Kupffer-cellen in de lever of de proximale tubuli van de nieren. De prominente accumulatie van basofiele granules is gecorreleerd met een verhoogde incidentie of ernst van degeneratieve veranderingen, vaak waargenomen als vacuolatie of degeneratie/necrose van het proximale tubulaire epitheel in de nieren4. Basofiele korrels alleen worden niet als toxicologisch significant beschouwd11; daarom is het onderscheid tussen basofiele korrelaccumulatie en degeneratieve veranderingen belangrijk voor het evalueren van ASO-gerelateerde toxiciteiten.

Vacuolen, die vaak worden waargenomen in de proximale tubuli van de nieren van cynomolgus-apen die met ASO worden behandeld, bevatten basofiel materiaal en vertonen dezelfde algemene verdeling binnen de cellen als basofiele korrels11, 12. Enkele rapporten hebben gesuggereerd dat het fixatieproces de verschijning van ASO-ophoping in het fagolysosomale compartiment5, 11. Bovendien hebben Henry et al. en Engelhardt beschreven dat vacuolen in de proximale tubuli waarschijnlijk een secundair fenomeen zijn als gevolg van de extractie van ASO's tijdens verwerking, omdat de vacuolen afwezig zijn in paraformaldehyde/glutaralde hyde perfusie-gefixeerde nieren5, 11. Vacuolen in de proximale tubuli van behandelde cynomolgus-apen met mipomersen werd gespeculeerd dat ze tijdens het fixatieproces zouden verschijnen13.

Hoewel vacuolatie als gevolg van ASO-behandeling in sommige gevallen een artefact kan zijn, is deze hypothese dus niet duidelijk bewezen en zijn er geen rapporten die de geschikte fixatiemethode voor toxicologische evaluatie hebben geïdentificeerd. Dienovereenkomstig vergeleken we in deze studie de niermorfologie na fixatie met Karnovsky's fixeermiddel of 4% paraformaldehydefosfaatbuffer (PFA) met die van 10% neutraal gebufferde formaldehyde-oplossing (NBF). Bovendien hebben we het nut van Karnovsky's fixeermiddel aangetoond als alternatief fixeermiddel om door artefacten veroorzaakte vacuolatie te voorkomen.

Vier weken oude vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten werden gekocht bij Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japan) en geacclimatiseerd aan laboratoriumomstandigheden. De dieren werden onder gecontroleerde omstandigheden gehouden (12-uur licht/donkercyclus, temperatuur van 23 ± 2 graden, relatieve vochtigheid van 50 ± 25%) en kregen vrije toegang tot een standaard commercieel dieet (geautoclaveerd CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japan) en leidingwater. Twintig dieren werden toegewezen aan de volgende vier groepen (met elk vijf dieren): de 1-week met zoutoplossing behandelde groep (controle- 1W), 2-week met zoutoplossing behandelde groep (controle{ {14}}W), de 1-week vergrendelde nucleïnezuurbevattende antisense oligonucleotide (LNA-ASO)-behandelde groep (ASO-1W), en 2-week LNA ASO-behandelde groep (ASO-2W). De dieren waren 5 weken oud op het moment van aanvang van de toediening van 50 mg/kg LNA-ASO. LNA-ASO werd in totaal vier keer intraveneus toegediend volgens het volgende regime: dag 1, 4, 8 en 11 in de ASO-2W-groep; en dagen 1, 2, 3 en 4 in de ASO-1W-groep. De dieren in de controle-1W- en ASO-1W-groepen werden op dag 7 opgeofferd. De dieren in de controle-2W- en ASO-2W-groepen werden op dag 7 opgeofferd. 14. Bij elke terminale necropsie werden bloedmonsters voor klinische pathologie verzameld uit de abdominale vena cava onder diepe anesthesie met isofluraan. Na bloedafname werden alle ratten geëuthanaseerd door leegbloeden door onmiddellijk de abdominale aorta door te snijden. Het uitwendige lichaamsoppervlak, de borst- en buikholte en de ingewanden werden macroscopisch onderzocht, en de linker nieren werden verwijderd en verwerkt voor microscopisch onderzoek. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels voor het voeren en opslaan van proefdieren en dierproeven van Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Serummonsters werden verkregen door centrifugeren van de bloedmonsters bij 4 graden Celsius. Biochemische serumanalyse werd uitgevoerd met behulp van een TBA-2000FR-instrument (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japan) om de bloedureumstikstof (BUN) en creatinine (CRE) niveaus te beoordelen

De nieren werden als volgt gefixeerd met behulp van drie fixeeroplossingen: Nadat de nier dwars in drie segmenten was verdeeld, werd het middelste gedeelte inclusief het nierbekken gedurende 5 dagen gefixeerd in 10% NBF; het schedelgedeelte werd gefixeerd in Karnovsky's fixeermiddel (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japan); en het caudale gedeelte werd gedurende 17 uur bij 4 graden gefixeerd in 4% PFA en vervolgens gedurende 24 uur in 10% NBF geplaatst. Elk gefixeerd monster werd gedehydrateerd en ingebed in paraffine. Weefselsecties werden voorbereid voor kleuring met hematoxyline en eosine (H&E). Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met behulp van antilichamen gericht tegen nierbeschadigingsmolecuul-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, VS; verdunning 1:300) en lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 2 (LAMP{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, VS; 1:1000 verdunning) na antigeenwinning (citraatbuffer, pH 6,0, gedurende 10 minuten verwarmd of gedurende 20 minuten onder druk verwarmd). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) werd gebruikt als het secundaire antilichaam.

Ondersteunende service van Wecistanche:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel voor meer specificaties:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-winkel