De nier-hepcidine/ferroportine-as regelt de ijzerreabsorptie en bepaalt de omvang van de nier- en systemische ijzerstapeling

Contactpersoon: emily.li@wecistanche.com

Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1 en Samira Lakhal-Littleton1

SLEUTELWOORDEN:ferroportine; hemochromatose; hepcidine; ijzer; ijzer overbelasting;niertubuli

Ferroportine (FPN) is het enige bekende ijzerexporteiwit van zoogdieren. Het bemiddelt de afgifte van ijzer in de bloedsomloop door duodenale enterocyten en milt-reticulo-endotheliale macrofagen, de respectievelijke plaatsen van ijzerabsorptie en -recycling.1,2 FPN-gemedieerde ijzerafgifte wordt tegengewerkt door het hormoon hepcidine, ook bekend als hepcidine antimicrobieel peptide (HAMP). Hoofdzakelijk geproduceerd in de lever, bindt hepcidine aan en induceert internalisatie van FPN, waardoor de afgifte van ijzer in de bloedsomloop en de beschikbaarheid ervan voor perifere weefsels wordt beperkt.3,4 De HAMP/FPN-as werkt dus op de plaatsen van absorptie en recycling om systemische ijzer homeostase.

De nier is de plaats van ijzerreabsorptie. Zowel niet-transferrine-gebonden als transferrine-gebonden ijzer kan overgaan in het glomerulaire fifiltraat.5 Het overgrote deel van dit ijzer wordt terug opgenomen in het tubulaire epitheel. Verschillende transporters zijn betrokken bij deze heropname, waaronder multiligand megaline-cubilin-receptorcomplex, transferrinereceptor 1, divalente metaaltransporter 1, zinktransporter ZIP8 en zinktransporter ZIP14.5-10.

Eenmaal in denierepitheelwordt ijzer weer opgenomen in de bloedsomloop. FPN is overvloedig aanwezig in denieren is betrokken bij ijzerreabsorptie.11-14 Het blijft echter onbekend of renale FPN ook onderhevig is aan regulatie door endogeen HAMP onder normale fysiologische omstandigheden, en zo ja, of een dergelijke regulatie belangrijk is voor systemische en/of renale ijzerhomeostase.

Om deze vragen te beantwoorden, hebben we een nieuw muismodel gegenereerd met een induceerbarenierbuisje–specifieke knock-in van fpnC326Y, dat codeert voor een HAMP-resistent FPNC326Y-eiwit. Om de eerder gerapporteerde rol van FPN bij de reabsorptie van ijzer te bevestigen, hebben we bovendien ook een muismodel gegenereerd met een induceerbarenierbuisje–specifieke deletie van het fpn-gen. Onze resultaten tonen aan dat endogeen HAMP rechtstreeks FPN-gemedieerde ijzerabsorptie reguleert en dat deze regulatie belangrijk is voor beidenieren systemische ijzerhomeostase, met name in het kader van een overmatige ijzerbeschikbaarheid.

Deze studie is de eerste die muizen gebruikt die nierspecifiek verlies van HAMP-reactiviteit herbergen om formeel debelangvan denierHAMP/FPN-as. Het biedt nieuwe inzichten in de rol van ijzerreabsorptie bij het bepalen van de mate van renale en extrarenale ijzerstapeling bij hemochromatose.

METHODEN

muizen

Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de UK Home Offifice Animals (Scientifific Procedures) Act 1986 en goedgekeurd door de Ethical Review Committee van de Medical Sciences Division van de University of Oxford.

De voorwaardelijke fpnflfl- en fpnC326Yflfl-allelen werden gegenereerd zoals eerder beschreven.15,16

Muizen die het Pax8.CreERT2þ-transgen herbergen, waren een geschenk van Dr. Athena Matakidou, Cancer Research UK Cambridge Institute, University of Cambridge. Deze muizen werden gegenereerd zoals eerder beschreven.17 Alle muizen bevonden zich op een C57BL/6-achtergrond.

diëten

Tenzij anders vermeld, werden de dieren voorzien van een standaard knaagdiervoer dat 200 delen per miljoen (ppm) ijzer bevatte. In experimenten met ijzermanipulatie kregen muizen een ijzerhoudend dieet (5000-ppm ijzer; Teklad TD.140464) of een aangepast controledieet (200- ppm ijzer; Teklad TD.08713) vanaf het spenen gedurende 3 maanden.

IJzerkwantificering en ijzerindexen 

Serumijzer- en ferritinespiegels werden bepaald met behulp van het ABXPentra-systeem (Horiba Medical). Hemoglobinewaarden werden bepaald met HemoCue Hb 201 Hemoglobine Microcuvettes. Serum erythroferron niveaus werden gemeten door enzym-gekoppelde immunosorbent assay (Intrinsic Lifesciences). Bepaling van totaal elementair ijzer in weefsels werd uitgevoerd door inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie, zoals eerder beschreven.15,16,18 Kalibratie werd bereikt met behulp van het proces van standaardtoevoegingen, waarbij pieken van 0 ng/g, 0,5 ng/ g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g en 100 ng/g ijzer werden toegevoegd aan replica's van een geselecteerd monster. Een externe ijzerstandaard (High Purity Standards ICP-MS-68-A-oplossing) werd verdund en gemeten om de validiteit van de kalibratie te bevestigen. Rhodium werd ook toegevoegd aan elke blanco, standaard en monster als een interne standaard in een concentratie van 1 ng/g. Voor urine-ijzerkwantificering werd urine verzameld van muizen gedurende een periode van 24 uur, en onderworpen aan inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie. Creatinineniveaus in dezelfde monsters werden gemeten met behulp van een colorimetrische creatininetestkit (Abcam; ab65340), en ijzerwaarden werden genormaliseerd naar creatinineconcentratie.

Immunohistochemie 

Fluorescentie-immunokleuring werd uitgevoerd in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselcoupes, met behulp van FPN-antilichaam (Novus Biologicals; NBP1-21502) op 1:100 en Pro-Hepcidine (AA 39-59) antilichaam op 1:50 (Antilichamen online; ABIN350367). De specificiteiten van de FPN- en hepcidine-antilichamen werden bevestigd met respectievelijk Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren en Hamp–/–-dieren als negatieve controles (aanvullende figuur S1). Niersegmentmarkers werden geïdentificeerd met behulp van aquaporine-1 antilichaam op 1:200 (Biotechne; NB600- 749), aquaporine-2 antilichaam op 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), of calbindine-antilichaam bij 1:100 (Abcam; ab82812). Secundaire antilichamen waren anti-konijn IgG Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), anti-ezel IgG Cy3 (Abcam; ab6949) en anti-muis IgG Alexa568 (Abcam; ab175473). Dia's werden afgebeeld met behulp van een FV1000 Olympus-microscoop.

cistanche kan beschermennierfunctie

Western blotting

Weefsels werden snel ingevroren in vloeibare stikstof, fijngemaakt en vervolgens gelyseerd met behulp van RIPA Lysis Buffer System (Santa Cruz; sc-24948), volgens de instructies van de fabrikant. Weefsellysaten werden geklaard door centrifugatie bij 15 000g gedurende 10 minuten bij 4°C. De eiwitconcentratie in de lysaten werd gemeten met BCA Protein Assay (Pierce; 23225) en genormaliseerd naar dezelfde concentratie voor elke batch. Lysaten werden vervolgens verdund in niet-reducerende Laemmli-natriumdodecylsulfaat-monsterbuffer en gedurende 5 minuten op 95°C verwarmd. Eiwit (30-50 mg) werd geladen op Mini-PROTEAN TGX-gels (Biorad; 4561096). Na elektroforese werd het eiwit overgebracht op een polyvinylideendifluoridemembraan met behulp van het BioRad Translotter-systeem, en de membranen werden gedurende een uur geblokkeerd in blokkeringsbuffer die 5 procent runderserumalbumine bevatte. Membranen werden vervolgens overnacht bij 4 ° C gekleurd met polyklonaal konijnen-anti-muis-FPN-antilichaam (NBP1-21502; Novus Biologicals) bij 1:1000 of mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-b-actine-antilichaam (Proteintech; HRP{{18} }) om 1:5000. Blots werden ontwikkeld met behulp van de ECL prime-detectiekit (RPN2232; VWR International). Signaalintensiteiten werden gekwantificeerd door ImageJ en de verhouding tussen de FPN- en de b-actinesignalen werd berekend om genormaliseerde intensiteiten te produceren.

Diaminobenzidine (DAB)-versterkte Perls-kleuring

Met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselcoupes werden gedeparaffineerd met behulp van xyleen en vervolgens gerehydrateerd in ethanol. De objectglaasjes werden vervolgens 1 uur gekleurd met 1 procent kaliumferricyanide in 0,1 mol/L HCl-buffer. Endogene peroxidase-activiteit werd geblust en vervolgens werden de objectglaasjes gekleurd met DAB-chromogeensubstraat en tegengekleurd met hematoxyline. Ze werden gevisualiseerd met behulp van een standaard helderveldmicroscoop.

Kwantitatieve polymerasekettingreactie

Genexpressie werd gemeten met behulp van Applied Biosystems TaqMangene-expressietestprobes voor Hamp en huishoudgenbactine (Life Technologies). De drempelcycluswaarde (CT-waarde) voor het gen van belang werd eerst genormaliseerd door de CT-waarde voor b-actine af te trekken om een ​​DCT-waarde te verkrijgen. DCT-waarden van testmonsters werden verder genormaliseerd naar het gemiddelde van de DCT-waarden voor controlemonsters om DDCT-waarden te verkrijgen. Relatieve genexpressieniveaus werden vervolgens berekend als 2-DDCT.

Statistieken

Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. Gepaarde vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de Student t-test. Meerdere vergelijkingen werden gemaakt met behulp van variantieanalyse. Post-hoctests gebruikten Bonferroni-correctie.

Figuur 1|De hepcidine/ferroportine-as (FPN) in de niertubuli regelt de ijzerreabsorptie en is belangrijk voor de renale ijzerhomeostasebij vrouwelijke muizen. (a)Representatieve afbeeldingen van immunofluorescentiekleuring voor FPN, aquaporine 1 (AQP1), aquaporine 2 (AQP2) en Calbindin (CalD) in de nieren van wildtype muizen. Staven¼ 200 mm, oorspronkelijke vergroting 10. Eindpaneel, staaf¼ 25 mm, oorspronkelijke vergroting 60. (b) Western-blot voor FPN innierenvan vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreER T2 þ muizen en FpnC326Y flfl/flfl-controles 1 week na behandeling met tamoxifen. Kwantificering van de signaalintensiteit wordt weergegeven in het onderste paneel. (c) Western-blot voor FPN in nieren van vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles 1 week na behandeling met tamoxifen. Kwantificering van de signaalintensiteit wordt weergegeven in het onderste paneel. (d) Nierijzerniveaus bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Y^flfl/^flfl,Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen. ( e ) Representatieve afbeeldingen van met diaminobenzidine (DAB) verbeterde Perls-ijzervlek in het niercorticale gebied van overeenkomstige dieren 3 maanden na inductie van tamoxifen. Staven ¼ 200 mm, oorspronkelijke vergroting 10. (f) Nierijzergehalten bij vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na tamoxifen-inductie. (g) Representatieve afbeeldingen van DAB-versterkte Perls-ijzervlek in het niercorticale gebied van overeenkomstige dieren op 3 maanden na tamoxifen-inductie. (Voortgezet)

Figuur 1 |(Vervolg) Balken ¼ 200 mm, originele vergroting 10. (h) Serumijzerniveaus bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen. (i) Serumijzerniveaus bij vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na tamoxifen-inductie. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" en="" ****p="">< 0,0001.="" b-act,="" b-actine;="" cont,="" controle;="" dapi,="" 40,6-diamidino-2-fenylindool;="" ppm,="" delen="" per="" miljoen.="" om="" de="" weergave="" van="" deze="" afbeelding="" te="" optimaliseren,="" raadpleegt="" u="" de="" online="" versie="" van="" dit="" artikel="" op="">

RESULTATEN

De hepcidine/FPN-as in de niertubuli regelt de ijzerreabsorptie en is belangrijk voor de renale ijzerhomeostase bij vrouwelijke muizen

We hebben eerst geprobeerd de exacte plaats van FPN-expressie vast te stellen in denier. Daartoe hebben we muizennieren voor FPN en segmentspecifieke markers aquaporine 1 (een marker van proximale ingewikkelde tubuli en dunne dalende ledemaat van Henley), aquaporine 2 (een marker van verzamelbuizen en verbindende tubuli) en calbindin (een marker distale gekronkelde tubuli en corticale verbindings- en verzamelkanalen). We ontdekten dat FPN sterk tot expressie wordt gebracht in de cortex en colokaliseert met aquaporine 1 naar de proximale ingewikkelde tubuli. Er was wat FPN in de binnenste medulla, colokaliserend met aquaporine 2 naar de medullaire verzamelkanalen. Er was geen colokalisatie van FPN met calbindine (Figuur 1a; groter paneel getoond in aanvullende figuur S2). Deze resultaten bevestigen dat FPN het meest voorkomt in het corticale gebied binnen proximale ingewikkelde tubuli.

Om te bepalen of renale FPN wordt gereguleerd door HAMP, gebruikten we muizen die een Pax8.CreERT2þ knock-in transgen herbergen, dat tamoxifen-induceerbare expressie van het Cre-recombinase aanstuurt onder controle van de gepaarde box-gen 8 pax8-promoter in proximale en distale tubuli en in verzamelbuizen.17 We kruisten Pax8.CreERT2þ-muizen met muizen met een conditioneel knock-in flfloxed allel FpnC326Y, dat codeert voor een hepcidine-resistente FPN. Bovendien, en om de eerder gerapporteerde rol van renale FPN bij ijzerreabsorptie te bevestigen, hebben we Pax8.CreERT2þ-muizen gekruist met muizen die het Fpnflfl/flfl-allel herbergen. Een week na behandeling met tamoxifen om het Pax8.CreERT2-transgen te induceren, waren de renale FPN-spiegels verhoogd bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ-muizen ten opzichte van FpnC326Yflfl/flfl-controles (Figuur 1b), wat aantoont dat renale FPN wordt gereguleerd door endogene HAMP onder normale fysiologische omstandigheden, en bovendien de efficiëntie van het Pax8.CreERT2þ-transgen bevestigend. Omgekeerd waren de renale FPN-spiegels verlaagd bij vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl / flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen ten opzichte van Fpnflfl / flfl-controles, wat de efficiëntie van het Pax8.CreERT2þ-transgen verder bevestigt (Figuur 1c). De specificiteit van dit Pax8.CreERT2þ-transgen werd ook bevestigd door de aanwezigheid van het deletie-allel (DFpn) in deniermaar niet in de lever of milt van Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen (aanvullende figuur S2A).

Vervolgens gingen we bepalen of de renale HAMP/FPN-as de ijzerreabsorptie regelt. Daartoe hebben we de nier- en serumijzerspiegels gemeten 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na de behandeling met tamoxifen. We vonden dat nierijzer

het gehalte was op alle tijdstippen lager in FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes dan in FpnC326Yflfl/flfl-controlevrouwtjes (Figuur 1d). Het ijzergehalte in de nieren bij mannen was niet verschillend volgens het genotype (Figuur 1d). DAB-versterkte Perl's ijzervlek bevestigde ook de verlaging van ijzerniveaus in proximale tubuli van FpnC326Yflfl / fllfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes (Figuur 1e; groter paneel getoond in aanvullende figuur S2). Omgekeerd vonden we dat het renale ijzergehalte hoger was bij Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes dan bij Fpnflfl/flfl-controlevrouwtjes vanaf 1 maand (Figuur 1f). Het ijzergehalte in de nieren bij mannen was niet verschillend volgens het genotype (Figuur 1f). DAB-versterkte Perls-ijzervlek bevestigde ook ijzeraccumulatie in proximale tubuli van Fpnflfl / flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes (Figuur 1g; groter paneel getoond in Aanvullende Figuur S2).

Serumijzerspiegels waren tijdelijk verhoogd in zowel mannelijke als vrouwelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen ten opzichte van FpnC326Yflfl/flfl-controles op het tijdstip van 1-maand (Figuur 1h). Omgekeerd waren serumijzerspiegels verlaagd bij Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes ten opzichte van Fpnflfl/flfl-controlevrouwtjes op het 1-maandelijkse tijdstip, terwijl ze op alle tijdstippen vergelijkbaar bleven bij mannen met verschillende genotypen (Figuur 1i ). Herstel van serumijzerspiegels tot die waargenomen bij controledieren op een leeftijd van 3 maanden kon niet worden toegeschreven aan herstel van normale renale FPN-spiegels. Inderdaad, de Pax8.CreERT2þ-geïnduceerde veranderingen in renale FPN-niveaus werden 3 maanden na behandeling met tamoxifen nog steeds gehandhaafd (aanvullende figuur S2B en C). Verlaagd renaal ijzergehalte en verhoogde serumijzerspiegels bij FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes tonen aan dat FPN-afhankelijke ijzerreabsorptie in proximale tubuli onder normale fysiologische omstandigheden onderhevig is aan regulatie door HAMP. Verhoogd renaal ijzergehalte en verlaagde serumijzerspiegels bij Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes bevestigen eerdere bevindingen dat nier-FPN bijdraagt ​​aan de reabsorptie van ijzer. Bovendien lijkt onder normale fysiologische omstandigheden de controle van ijzerreabsorptie door de renale HAMP/FPN-as belangrijker te zijn bij vrouwen dan bij mannen, althans bij de C57BL/6-stam.

Cistanche kan de nierfunctie verbeteren

De renale HAMP/FPN-as draagt ​​bij aan, maar is niet essentieel voor, normale systemische ijzerhomeostase onder omstandigheden van normale ijzerbeschikbaarheid.

Vervolgens wilden we de bijdrage van de renale HAMP/FPN-as aan de systemische ijzerhomeostase bepalen. We ontdekten dat FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes een voorbijgaande toename van serumferritine (Figuur 2a), leverijzergehalte (Figuur 2b) en miltijzergehalte (Figuur 2c) hadden op het 1-maandelijkse tijdstip waarop vergeleken met FpnC326Yflfl/flfl-controlevrouwtjes. Hun hemoglobineniveaus bleven op alle tijdstippen vergelijkbaar met die van controles (Figuur 2d). Geen van deze parameters was verschillend tussen FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-mannetjes en hun FpnC326Yflfl/flfl-controles (Figuur 2a-d). Erythroferron-niveaus waren niet verschillend volgens genotype (aanvullende figuur 3A). Omgekeerd vonden we dat Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-vrouwtjes lagere serum-ferritinespiegels hebben op de 1- en 3-maandelijkse tijdstippen (Figuur 2e), een lager ijzergehalte in de lever op de 3- en 6-maandelijkse tijdstippen (Figuur 2f), en lager miltijzergehalte op de 1- en 3-maandelijkse tijdstippen (Figuur 2g), in vergelijking met Fpnflfl/flfl-controlevrouwtjes. Ze hadden ook een voorbijgaande en milde verlaging van de hemoglobinespiegels op het tijdstip van 3-maand (Figuur 2h). Geen van deze parameters was verschillend tussen Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-mannetjes en hun Fpnflfl/flfl-controles (Figuur 2e-h). Erythroferron-niveaus waren ook niet veranderd volgens het genotype (aanvullende figuur 3B). Samen tonen deze gegevens aan dat, onder normale fysiologische omstandigheden, de renale HAMP/FPN-as bijdraagt ​​aan systemische ijzerniveaus, maar op zichzelf niet essentieel is voor het behoud van een normale systemische ijzerhomeostase.

Figuur 2|De renale hepcidine antimicrobiële peptide/ferroportine (FPN) as draagt ​​bij aan, maar is niet essentieel voor, normale systemischeijzerhomeostase onder omstandigheden van normale ijzerbeschikbaarheid. (advertentie)Systemische ijzerindexen bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen, inclusief (a) serumferritine, (b) ijzergehalte in de lever , (c) ijzergehalte in de milt, en (d) hemoglobine. (e-h) Systemische ijzerindexen bij vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na tamoxifen-inductie, inclusief (e) serumferritine, ( f) ijzergehalte in de lever, (g) ijzergehalte in de milt en (h) hemoglobine. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" en="" ***p="">< 0.001.="" ppm,="" delen="" per="">

Figuur 3|De renale hepcidine antimicrobiële peptide (HAMP)/ferroportine (FPN) as bepaalt de omvang van de renale en systemische ijzerstapeling onder omstandigheden van overmatige ijzerbeschikbaarheid. (a-f)Extrarenale ijzerindexen bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles leverden ofwel een controlevoer (200 delen per miljoen [ppm]) of een met ijzer beladen dieet (5000 ppm) gedurende 3 maanden. (Voortgezet)

Figuur 3 |(Vervolg) Indexen omvatten (a) serumijzer, (b) serumferritine, (c) ijzergehalte in de milt, (d) ijzergehalte in het hart, (e) ijzergehalte in de longen en (f) ijzergehalte in de lever. (g) Nierijzergehalte bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles leverden ofwel een controlevoer (200 ppm) of eenijzer geladendieet (5000 ppm) gedurende 3 maanden. (h,i) Representatieve afbeeldingen van diaminobenzidine (DAB)-versterkte Perls-ijzerkleuring in levers en het renale kritieke gebied van overeenkomstige dieren. Balken ¼ 200 mm, originele vergroting 10. (j) Relatieve expressie van het hamp-gen in de levers van overeenkomstige dieren. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****p=""><0,0001, *****p=""><0,00001 en="" ******p=""><0,00001. om="" de="" weergave="" van="" deze="" afbeelding="" te="" optimaliseren,="" raadpleegt="" u="" de="" online="" versie="" van="" dit="" artikel="" op="">

De renale HAMP/FPN-as bepaalt de omvang van de renale en systemische ijzerstapeling onder omstandigheden van overmatige ijzerbeschikbaarheid 

Vervolgens wilden we de rol van de renale HAMP/FPN-as bepalen in de setting van ijzerstapeling. Daartoe werden FpnC326Yflfl/flfl-, Pax8.CreERT2þ-dieren en FpnC326Yflfl/flfl-controles geïnduceerd met tamoxifen en kregen vervolgens gedurende 3 maanden ofwel een controlevoer met 200 ppm ijzer, ofwel een met ijzer beladen dieet, dat 5000 ppm ijzer bevatte. . We vonden dat het verstrekken van een met ijzer beladen dieet het serumijzer-, serumferritine- en weefselijzergehalte verhoogde bij mannen en vrouwen van beide genotypen. FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren hadden echter een grotere toename van serumijzer (Figuur 3a), serumferritine (Figuur 3b) en ijzergehalte in de milt (Figuur 3c), hart (Figuur 3d), long (Figuur 3e) en lever (Figuur 3f) dan FpnC326Yflfl/flfl-controles. Daarentegen hadden ze een lagere toename van het renale ijzergehalte (Figuur 3g). Verschillen tussen genotypen in de mate van ijzerlading in proximale tubuli en in de lever waren ook duidelijk in DAB-versterkte Perls-ijzerkleuring (Figuur 3h en i; grotere panelen getoond in Aanvullende Figuur S4). In overeenstemming met een grotere systemische ijzerstapeling hadden FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren ook een grotere toename in leverhamp-genexpressie vergeleken met FpnC326Yflfl/flfl-controles (Figuur 3j). Hemoglo-bin-niveaus werden niet beïnvloed door voeding of genotype, en in overeenstemming hiermee bleven de serum-erythroferron-niveaus ook onveranderd (aanvullende figuren 4A en B). Deze bevindingen tonen aan dat, onder omstandigheden van overmatige ijzerbeschikbaarheid, de controle van de ijzerreabsorptie door de renale HAMP/FPN-as de systemische ijzerstapeling verlaagt en de renale ijzerstapeling verhoogt.

De renale HAMP/FPN-as bepaalt het patroon van ijzerstapeling in het weefsel bij hemochromatose 

Vervolgens gingen we de rol van de renale HAMP/FPN-as onderzoeken in de context van erfelijke hemochromatose, een genetische aandoening van ijzerstapeling veroorzaakt door defecten in de productie van hepcidine of de respons op hepcidine.19 Daartoe gebruikten we muizen die in- huis met een heterozygote alomtegenwoordige knock-in van het fpnC326Y-allel (Fpnwt/C326Y). We hadden eerder aangetoond dat deze muizen het fenotype ijzerstapeling ontwikkelen dat kenmerkend is voor erfelijke hemochromatose.15,18 We vergeleken het patroon van weefselijzer overbelastingbij deze muizen met die waargenomen bij wildtype muizen die gedurende 3 maanden vanaf het spenen een ijzerhoudend dieet kregen. Zowel Fpnwt/C326Y-muizen als wildtype muizen die een met ijzer beladen dieet kregen, hadden

verhoogd ijzergehalte in de lever, het hart en de longen vergeleken met hun respectieve controles (figuren 4a en b). Het ijzergehalte in de nieren in Fpnwt / C326Y-muizen was normaal op de leeftijd van 3 maanden (Figuur 4a) en nam slechts met 32 ​​procent toe ten opzichte van controles op de leeftijd van 6 maanden (aanvullende figuur 5A). Daarentegen hadden wildtype dieren die een met ijzer beladen dieet kregen een 260 procent hoger ijzergehalte in de nieren vergeleken met die op een normaal dieet (Figuur 4b). Relatieve verschillen in nier- en leverijzerstapeling tussen de 2 modellen waren ook duidelijk in DABenhanced Perls-ijzerkleuring (Figuur 4c en d; grotere panelen getoond in Aanvullende Figuur S5). De omvang van de extrarenale ijzerstapeling was vergelijkbaar tussen de 2 modellen, terwijl de omvang van de nieroverbelasting aanzienlijk hoger was bij wildtype dieren die een ijzerbeladen dieet kregen dan bij Fpnwt/C326Y-muizen (Figuur 4e). FPN was verhoogd in de cortex in zowel Fpnwt / C326Y-muizen als wildtype muizen die een met ijzer beladen dieet opleverden (Figuur 4f en g; grotere panelen worden getoond in Aanvullende Figuur S5). Nader onderzoek van de plaats van FPN-expressie in proximale tubuli onthulde dat het zich zowel intracellulair als naar het basolaterale membraan in Fpnwt/C326Y-muizen leek te lokaliseren. Daarentegen leek FPN zich voornamelijk te lokaliseren in het cytoplasma, het apicale membraan en verrassend genoeg zorgde de kern bij muizen voor een met ijzer beladen dieet (Figuur 4f en g, onderste panelen). Het patroon van FPN-lokalisatie als gevolg van het verstrekken van een met ijzer beladen dieet werd verder bevestigd met behulp van Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren als negatieve controles (aanvullende figuur S5B). Deze waarnemingen, samen met de eerdere bevinding dat FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ-dieren een lagere renale ijzerstapeling hebben dan controles na het verstrekken van eenijzer geladendieet, tonen aan dat het verlies van HAMP-werking op renale FPN deniervan ijzerlading in de setting van erfelijke hemochromatose.

DISCUSSIE

De belangrijkste bevinding van de huidige studie is dat endogeen HAMP FPN-gemedieerde ijzerreabsorptie regelt. Eerdere studies hadden melding gemaakt van de regulatie van FPN door exogeen HAMP in gekweekte niercellen, en een omgekeerd verband tussen HAMP- en FPN-niveaus in denierna eenzijdige ureterocclusie.12,13 Dit is echter de eerste demonstratie dat een dergelijke regulatie in vivo werkt onder normale fysiologische omstandigheden en op een manier die de renale en systemische ijzerhomeostase beïnvloedt. Een bijzonder sterk punt van deze studie is het gebruik van nieuwe muizen, in eigen beheer gegenereerd, om een ​​nierspecifiek verlies van HAMP-reactiviteit te herbergen. Deze benadering maakt de studie van de renale HAMP/FPN-as mogelijk zonder de verstorende effecten van veranderde systemische ijzerhomeostase, die anders wordt gezien in alomtegenwoordige diermodellen.

Figuur 4|Het renale hepcidine antimicrobiële peptide/ferroportine (FPN) bepaalt het patroon van ijzerstapeling in het weefsel bij hemochromatose. (a)IJzerniveaus in de nieren, lever, hart en longen van Fpnwt/C326Y-dieren en Fpnwt/wt-controles op een leeftijd van 3 maanden. (b) IJzerniveaus in denier, lever, hart en longen bij wildtype dieren leverden ofwel een controlevoer (200 delen per miljoen [ppm]) of een met ijzer beladen dieet (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) vanaf het spenen gedurende 3 maanden. (c) Representatieve afbeeldingen van met diaminobenzidine (DAB) versterkte Perls-ijzerkleuring in de nierschors en levers van Fpnwt/C326Y-dieren en Fpnwt/wt-controles op een leeftijd van 3 maanden. Staaf ¼ 200 mm, originele vergroting10. ( d ) Representatieve afbeeldingen van DAB-versterkte Perls-ijzerkleuring in de niercortex en levers van wildtype dieren leverden ofwel een controlevoer (200 ppm) of een met ijzer beladen dieet (5000 ppm) vanaf het spenen gedurende 3 maanden. Staaf ¼ 200 mm, oorspronkelijke vergroting 10. (e) Vergelijking van de mate van ijzerstapeling in het weefsel tussen Fpnwt/C326Y-dieren en wildtype dieren die een met ijzer beladen dieet kregen. Waarden die voor elk dier worden weergegeven, zijn genormaliseerd naar het gemiddelde van de respectieve controlegroep. (f) Representatieve beelden van FPN-immunofluorescentiekleuring in de niercortex van Fpnwt/C326Y-dieren en Fpnwt/wt-controles op een leeftijd van 3 maanden. Bovenpaneel, staven 200 mm, originele vergroting 10. Onderpaneel, staaf ¼ 25 mm, originele vergroting 60. (g) Representatieve beelden van FPN-immunofluorescentiekleuring in de niercortex van wildtype dieren leverden ofwel een controlevoer (200 ppm) of een ijzerhoudend dieet (5000 ppm) vanaf het spenen gedurende 3 maanden. Bovenpaneel, staven 200 mm, originele vergroting 10. Onderpaneel, staaf ¼ 25 mm, originele vergroting 60. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" en="" ****p="">< 0,0001.="" om="" de="" weergave="" van="" deze="" afbeelding="" te="" optimaliseren,="" raadpleegt="" u="" de="" online="" versie="" van="" dit="" artikel="" op="">

De tweede belangrijke vaststelling van de huidige studie is dat de renale HAMP/FPN de omvang van zowel renale als systemische ijzerstapeling bepaalt (Figuur 5). Inderdaad, verlies van HAMP-reactiviteit in niertubuli verhoogde de omvang van de ijzerstapeling van de lever, milt, hart en longen, terwijl de omvang van de renale ijzerstapeling na het verstrekken van een met ijzer beladen dieet werd verminderd. In overeenstemming hiermee werd een grotere renale ijzerstapeling gezien na het verstrekken van een met ijzer beladen dieet aan wildtype dieren (waarbij de renale HAMP/FPN-as intact is) dan bij hemochromatosemuizen (waarbij de renale HAMP/FPN-as ook verstoord) (grafisch abstract). Deze bevinding kan de klinische observatie verklaren dat denierwordt niet vaak beïnvloed bij patiënten met erfelijke hemochromatose

Figuur 5|De rol van de renale hepcidine antimicrobiële peptide (HAMP) / ferroportine (FPN) as in de setting van ijzerstapeling.Het verstrekken van een met ijzer beladen dieet verhoogt de ijzerbeschikbaarheid in het serum en de ijzerspiegels in het glomerulaire fifiltraat en verhoogt de productie en afgifte van hepcidine (HAMP) door de lever. Verhoogd serum HAMP remt de reabsorptie van ijzer door FPN in niertubuli te blokkeren. Remming van ijzerreabsorptie veroorzaakt ijzerretentie in de nieren, terwijl de systemische ijzerbeschikbaarheid afneemt en bijgevolg de ijzerstapeling in de lever vermindert. Bij FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ-muizen veroorzaakt het verlies van HAMP-reactiviteit in de niertubuli ongereguleerde ijzerreabsorptie. Dit voorkomt op zijn beurt ijzerretentie in de nieren, terwijl het de systemische ijzerbeschikbaarheid verhoogt en vervolgens de ijzerstapeling in de lever verhoogt.

Hoewel zowel hemochromatose als ijzerstapeling in de voeding de FPN in niertubuli verhoogde, leken ze te resulteren in verschillende patronen van lokalisatie naar de apicale, intracellulaire of basolaterale compartimenten. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan in de twaalfvingerige darm van de rat, waar werd gevonden dat ijzersonde de relatieve verdeling van FPN tussen deze compartimenten in duodenale enterocyten veranderde.20 Een interpretatie van deze resultaten is dat in de setting van ijzerstapeling in de voeding, verhoogde FPN-translatie ijzerregulerende eiwitten) zouden werken om een ​​hoge algemene FPN-productie in de renale tubulaire cel te handhaven, terwijl een verhoogd serum-HAMP het aandeel FPN dat zich op het basolaterale membraan kan lokaliseren, zou verminderen. Uit deze interpretatie volgt dat het verschil tussen eerdere rapporten met betrekking tot de lokalisatie van FPN in proximale tubuli een weerspiegeling zou kunnen zijn van verschillen in het ijzergehalte in de niertubuli en in serumhepcidineniveaus tussen diermodellen die in verschillende onderzoeken zijn gebruikt.5,11-14,21 Als alternatief, deze divergentie zou een weerspiegeling kunnen zijn van een mate van niet-specifieke reactiviteit die eerder is gerapporteerd met betrekking tot commerciële FPN-antilichamen, inclusief degene die in de huidige studie is gebruikt.14 De functionele betekenis van de apicale lokalisatie van FPN in niertubuli blijft onduidelijk en we konden geen veranderingen detecteren in ijzeruitscheiding via de urine bij met ijzer beladen muizen (aanvullende figuur 5C). Een andere interessante observatie is dat sommige FPN gelokaliseerd leek in de kern in niertubuli van met ijzer beladen muizen. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan door anderen in met ijzer beladen macrofagen en in de lever van de rat. De laatste studie vond dat nucleaire FPN betrokken is bij nucleaire ijzerretentie als onderdeel van de acute fase respons.22,23 Gedetailleerde studies van de subcellulaire lokalisatie van FPN in verschillende ijzertoestanden en in verschillende pathologieën zijn nodig om ons begrip van de rol verder te vergroten. van FPN in de nier.

De regulatie en functie van renale HAMP zijn ook niet volledig begrepen. We ontdekten dat de expressie van het hamp-gen in de nier was verhoogd bij wildtype dieren na het verstrekken van een met ijzer beladen dieet (aanvullende figuur 5E), maar ongewijzigd bleef in hemochromatose-muizen (aanvullende figuur 5D), en in die met niertubuli- specifiek verlies van FPN of niertubuli-specifiek verlies van HAMP-reactiviteit (aanvullende figuur S5F en G). Deze resultaten ondersteunen niet het idee dat genexpressie van de nierhamp lokaal wordt gereguleerd door renale ijzerniveaus. In termen van de functie van nier-HAMP, suggereerde een eerdere studie in een model van unilaterale ureterocclusie dat het betrokken is bij het beheersen van nier-FPN. We ontdekten dat nier-HAMP (gedetecteerd met behulp van een antilichaam tegen pro-HAMP-peptide) co-lokaliseerde met calbindine (een marker van distale ingewikkelde tubuli en corticale verzamelkanalen en verbindingskanalen) (aanvullende figuur S5H). Aan de andere kant colokaliseert FPN-expressie niet met calbindine, zelfs niet bij muizen met nierspecifiek verlies van HAMP-reactiviteit (Figuur 1a en Aanvullende Figuur S5I). Deze resultaten zijn niet consistent met een autocriene rol voor renaal HAMP bij de regulatie van nier-FPN. Desalniettemin kan renaal HAMP betrokken zijn bij paracriene regulatie van renale FPN. In de toekomst zou het interessant zijn om de paracriene functies van nier-HAMP te bestuderen en om de relatieve bijdragen van nier- en lever-HAMP's aan de controle van ijzerreabsorptie te kwantificeren.

Een andere interessante observatie van de huidige studie is dat, onder omstandigheden van normale ijzerbeschikbaarheid, de renale HAMP/FPN-as niet essentieel is voor het in stand houden van een normale systemische ijzerhomeostase en in plaats daarvan belangrijker is voor het reguleren van de renale ijzerniveaus, tenminste bij vrouwelijke muizen van de C57BL/6-stam. Hoewel de waargenomen veranderingen in renale ijzerniveaus als gevolg van verlies van FPN of HAMP-reactiviteit in de niertubuli persistent waren, waren veranderingen in systemische ijzerindexen inderdaad van voorbijgaande aard. De voorbijgaande aard van de systemische effecten suggereert het (de) compensatiemechanisme(n) van de betrokkenheid. Een mogelijk compensatiemechanisme is de modulatie van de ijzerabsorptie via de lever door HAMP in de lever. We ontdekten inderdaad dat bij muizen met nierspecifiek verlies van HAMP-reactiviteit, hepatische hamp-genexpressie was verhoogd na de toename van serumijzerspiegels op het tijdstip van 1-maand en verhoogd bleef op latere tijdstippen. Omgekeerd werd hepatische hamp-genexpressie onderdrukt bij muizen met nierspecifiek verlies van FPN na de afname van serumijzerspiegels op het 1- maandtijdstip en bleef onderdrukt op latere tijdstippen (aanvullende figuren S6A en B). Bovendien ging verhoogde leverhamp-genexpressie in de eerste setting gepaard met verlaagde darm-FPN-niveaus, terwijl verminderde leverhamp-genexpressie in de tweede setting gepaard ging met hogere darm-FPN (aanvullende figuren S6C en D). Deze resultaten geven aan dat de werking van HAMP in de lever op de ijzerabsorptie via de voeding een actief compensatiemechanisme is dat betrokken is bij het handhaven van een normale systemische ijzerhomeostase bij een verstoorde renale ijzerreabsorptie.

Cistanche kan de nierfunctie herstellen

Merk op dat onder omstandigheden van normale ijzerbeschikbaarheid de renale HAMP/FPN-as belangrijker lijkt te zijn bij vrouwelijke muizen dan bij mannelijke muizen, althans in de C57BL/6-stam. Deze waarneming kon niet worden toegeschreven aan verschillen tussen mannen en vrouwen in de activiteit van het Pax8.CreERT2þ-transgen. Seksueel dimorfisme in de niveaus en patronen van transporters langs het nefron is eerder gemeld bij deze muizenstam.24 In overeenstemming hiermee vonden we hogere basale expressie van FPN in denierenvan vrouwtjes dan in de nieren van mannelijke nestgenoten (aanvullende figuur S2D). Een eerdere studie met een ander Cre-recombinase-transgen, aangedreven door een constitutief actieve Nestin-promotor om fpn in het gehele nefron te verwijderen, rapporteerde ook een toename van de renale ijzerspiegels en een afname van de serumijzer- en leverijzervoorraden. Die studie werd echter uitgevoerd in een andere muizenstam (129/SvEvTac) en analyseerde het fenotype niet volgens geslacht of tijdsverloop.14

hemochromatose en andere ijzeraandoeningen.

OPENBARING

Alle auteurs verklaarden geen concurrerende belangen.

DANKBETUIGING

SL-L was de ontvanger van een British Heart Foundation Intermediate Basic Science Postdoctoral Fellowship (FS/12/63/29895). GM werd gefinancierd door eenNieronderzoek UK-projectsubsidie ​​(RP_020_20160303) toegekend aan SL-L.

AUTEURS BIJDRAGEN

SL-L bedacht onderzoek. SL-L en GM voerden experimenten uit. SL-L analyseerde en interpreteerde de resultaten. SL-L schreef manuscript. AM heeft materiaal bijgedragen. PAR gaf commentaar op het manuscript.

AANVULLEND MATERIAAL

Aanvullend bestand (PDF)

Figuur S1. Bevestiging van FPN- en HAMP-antilichaamspecificiteit. (A) Representatieve beelden van FPN-immunoflfluorescerende kleuring in de niercortex van Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren en Fpnflfl/flfl-controles op een leeftijd van 3 maanden. Bovenste panelen, staaf 200 mm, originele vergroting 10. Onderste panelen, staaf ¼ 25 mm, originele vergroting 60. (B) Representatieve beelden van HAMP immunofluorescente kleuring in de niercortex van Hamp-/- dieren en wildtype controles op 3 maanden oud. Bovenpanelen, staaf 200 mm, originele vergroting 10. Onderpanelen, staaf 25 mm, originele vergroting 60.

Figuur S2. Bevestiging van Pax8.CreERT2þ-activiteit en specificiteit. (A) genotypering van Fpnflfl/flfl en Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ muizen met behulp van genomisch DNA geëxtraheerd uit de lever, milt ennier1 week na inductie van tamoxifen. (B) Western-blot voor FPN innierenvan vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Y-controles 3 maanden na behandeling met tamoxifen. Kwantificering van de signaalintensiteit weergegeven in het onderste paneel. (C) Western-blot voor FPN in nieren van vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles 3 maanden na behandeling met tamoxifen. Kwantificering van de signaalintensiteit weergegeven in het onderste paneel. (D) Western-blot voor FPN in nieren van wildtype vrouwtjes en mannelijke nestgenoten op een leeftijd van 3 maanden. Kwantificering van de signaalintensiteit weergegeven in het onderste paneel. (E–G) Grotere versies van panelen in respectievelijk figuur 1a, g en e. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P < 0.05,="" ***p=""><>

Figuur S3. Serum erythroferron niveaus zijn niet veranderd in FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ en Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2 muizen. (A) Serum erythroferron niveaus bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ muizen en FpnC326Yflfl/flfl controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen. (B) Serum-erythroferronniveaus bij vrouwelijke en mannelijke Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na tamoxifen-inductie. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM.

Figuur S4. De hemoglobine- en serumerythroferronspiegels veranderen niet in FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ die een ijzerrijk dieet krijgt. (A) Hemoglobineniveaus bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles die ofwel een controledieet (met 200 ppm ijzer) of een ijzerhoudend dieet (met 5000 ppm ijzer) kregen vanaf het spenen gedurende 3 maanden . (B) Serum-erythroferron-niveaus bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles die ofwel een controledieet kregen (met 200 ppm ijzer) of eenijzerhoudend dieet(bevat 5000 ppm ijzer) vanaf het spenen gedurende 3 maanden. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. (C,D) Grotere versies van panelen in respectievelijk figuur 3h en i.

Figuur S5. Nierijzerbehandeling en nierhampexpressie in de verschillende muismodellen. (A) Nierijzerniveaus bij Fpnwt/C326Y-dieren en Fpnwt/wt-controles op een leeftijd van 6 maanden. (B) Representatieve beelden van FPN- en AQP1-immunofluorescentiekleuring in de niercortex van Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren en Fpnflfl/flfl-controles die gedurende 3 maanden een ijzerhoudend dieet kregen met 5 0 00 ppm vanaf het spenen. Bar ¼ 25 mm, oorspronkelijke vergroting 60. (C) Urine-ijzergehalte (genormaliseerd naar urinair creatinine) bij wildtype dieren die een ijzerhoudend dieet kregen met 5000 ppm ijzer of een controledieet met 200 ppm ijzer vanaf het spenen gedurende 3 maanden. (D) Nierhamp-genexpressie in Fpnwt/C326Y-dieren en Fpnwt/wt-controles op een leeftijd van 3 maanden. (E) Nierhamp-genexpressie bij wildtype dieren die gedurende 3 maanden een ijzerhoudend dieet met 5000 ppm ijzer of een controledieet met 200 ppm ijzer kregen vanaf het spenen. (F) Nierhamp-genexpressie bij vrouwelijke en mannelijke FpnC326Yflflflfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflflflfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen. (G) Nierhamp-genexpressie bij vrouwelijke en mannelijke Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na tamoxifen-inductie. (H) Representatieve afbeeldingen van HAMP- en CalD-immunofluorescentiekleuring in de nierschors van wildtype dieren op een leeftijd van 3 maanden. Staaf ¼ 25 mm, originele vergroting 60. (I) Representatieve beelden van FPN- en CalD-immunofluorescentiekleuring in de niercortex van FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-dieren op een leeftijd van 1 maand. Bar ¼ 25 mm, originele vergroting 60. (J-M) Grotere versies van panelen in respectievelijk figuur 4c, d, f en g. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P <>

Figuur S6. Leverhamp-genexpressie en darm-FPN-niveaus zijn veranderd bij muizen met niertubuli-specifieke knock-out van fpn en bij muizen met niertubuli-specifieke knock-in van fpnC326Y. (A) Relatieve expressie van hamp-mRNA in levers van vrouwelijke FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen. (B) Relatieve expressie van hamp-mRNA in levers van vrouwelijke Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles na 1 week, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden na behandeling met tamoxifen. (C) Representatieve beelden van FPN-immunokleuring in de darmen van vrouwelijke FpnC326Y flflflfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en FpnC326Yflfl/flfl-controles 1 maand na behandeling met tamoxifen. Staaf ¼ 200 mm, originele vergroting10. (D) Representatieve beelden van FPN-immunokleuring in de darm van vrouwelijke Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ-muizen en Fpnflfl/flfl-controles 1 maand na behandeling met tamoxifen. Staaf ¼ 200 mm, originele vergroting 10. Waarden worden weergegeven als gemiddelde SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" en=""><>

Cistanche kan nierinfectie verlichten

REFERENTIES

1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL, et al. De ijzerexporteur ferroportin/slc40a1 is essentieel voor de ijzerhomeostase. Cel Metab. 2005;1:191-200.

2. Ganz T. Cellulair ijzer: ferroportine is de enige uitweg. Cel Metab. 2005; 1:155-157.

3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidine reguleert de cellulaire ijzerefflflux door te binden aan ferroportine en de internalisatie ervan te induceren. Wetenschap. 2004;306:2090-2093.

4. Qiao B, Sugianto P, Fung E, et al. Door hepcidine geïnduceerde endocytose van ferroportine is afhankelijk van ubiquitinatie van ferroportine. Cel Metab. 2012;15:918-924.

5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R, et al. In vivo karakterisering van renaal ijzertransport bij de verdoofde rat. J Fysiol. 2000;524:581-586.

6. Christensen I, Birn H, Storm T, et al. Endocytische receptoren in de proximale niertubuli. Fysiologie. 2012;27:223–236.

7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. Renaal ijzermetabolisme: transferrine-ijzerafgifte en de rol van ijzerregulerende eiwitten. J Am Soc Nephrol. 2007;18:401-406.

8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Cellulaire en subcellulaire lokalisatie van de Nramp2-ijzertransporter in de darmborstelrand en regulatie door ijzer uit de voeding. Bloed. 1999;93: 4406-4417.

9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S, et al. ZIP8 is een ijzer- en zinktransporter waarvan de expressie op het celoppervlak omhoog wordt gereguleerd door cellulaire ijzerlading. J Biol Chem. 2012;287:34032-34043.

10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. IJzermetabolisme in de pathogenese van door ijzer geïnduceerd nierletsel. Nat Rev Nephrol. 2013;9:385-398.

11. Wolff N, Liu W, Fenton R, et al. Ferroportine 1 wordt basolateraal tot expressie gebracht in proximale tubuluscellen van rattennieren en een overmaat aan ijzer verhoogt de membraanhandel. J Cell Mol Med. 2011;15:209-219.

12. Pan S, Qian ZM, Cui S, et al. Lokaal hepcidine verhoogde de intracellulaire ijzerstapeling via de afbraak van ferroportine in de nier. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:322-327.

13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C, et al. Hepcidine reguleert de intrarenale ijzerbehandeling in het distale nefron. Nier Int. 2013;84:756-766.

14. Wang X, Zheng X, Zhang J, et al. Fysiologische functies van ferroportine bij de regulatie van renale ijzerrecycling en ischemisch acuut nierletsel. Am J Physiol Renal Physiol. 2018;315:F1042-F1057.

15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ, et al. Een essentiële cel-autonome rol voor hepcidine in cardiale ijzerhomeostase. leven. 2016;5: e19804.

16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA, et al. Cardiale ferroportine reguleert de cellulaire ijzerhomeostase en is belangrijk voor de hartfunctie. Proc Natl Acad Sci VS A. 2015;112:3164-3169.

17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K, et al. Generatie en karakterisering van een Pax8-CreERT2 transgene lijn en een Slc22a6-CreERT2 knock-in lijn voor induceerbare en specifieke genetische manipulatie van renale tubulaire epitheelcellen. PLoS Een. 2016;11:e0148055.

18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frise M, et al. Intracellulair ijzertekort in pulmonale arteriële gladde spiercellen induceert pulmonale arteriële hypertensie bij muizen. Proc Natl Acad Sci VS A. 2019;116:13122– 13130.

19. Camaschella C. Ijzerhomeostase begrijpen door genetische analyse van hemochromatose en gerelateerde aandoeningen. Bloed. 2005;106: 3710-3717.

20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A, et al. IJzeraanvoer bepaalt de apicale/basolaterale membraandistributie van intestinale ijzertransporters DMT1 en ferroportine 1. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298:C477–C485.

21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. De rol van de nier in ijzerhomeostase: renale expressie van prohepcdin, ferroportine en DMT1 bij anemische muizen. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295:F1213-F1221.

22. Naz N, Malik I, Sheikh N, et al. Ferroportine-1 is een "nucleair"-negatief acutefase-eiwit in rattenlever: een vergelijking met andere ijzertransporteiwitten. Lab Invest. 2012;92:842-856.

23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. IJzerbelading verhoogt ferroportine heterogene nucleaire RNA- en mRNA-niveaus in muizen J774-macrofagen. J Nutr. 2009;139:434-438.

24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J, et al. Seksueel dimorf patroon van niertransporters en elektrolythomeostase. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 3504-3517.