Nierziekte-geassocieerde varianten van apolipoproteïne L1 tonen versterking van functie in kationkanaalactiviteit

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno en John C. Edwards

Van varianten in Apolipoproteïne L1 (ApoL1) is bekend dat ze verantwoordelijk zijn voor een verhoogd risico op sommige progressievenierziektenonder mensen van Afrikaanse afkomst. ApoL1 is een amfitroop eiwit dat kan worden ingevoegd in fosfolipidemembranen en anion- of kationselectieve permeabiliteit voor fosfolipidemembranen kan verlenen, afhankelijk van de pH. Of deze activiteiten verschillen tussen de varianten of dat ze bijdragen aan de pathogenese van ziekten is niet bekend. We gebruikten testen van spanningsgestuurde ionenflux van fosfolipideblaasjes en van stabiele membraanassociatie om verschillen tussen ApoL1isovormen te beoordelen. Er is een significante (ongeveer tweevoudige) toename in de kation-selectieve ionpermease-activiteit van de twee nierziekte-geassocieerde varianten in vergelijking met het referentie-eiwit. Daarentegen vinden we geen verschil in de anion-selectieve permease-activiteit bij lage pH tussen de isovormen. Vergeleken met de referentiesequentie, vertonen de twee ziekte-geassocieerde varianten een verhoogde stabiele associatie met fosfolipide-blaasjes onder omstandigheden die de kationpermease-activiteit ondersteunen, wat suggereert dat de verhoogde activiteit kan het gevolg zijn van efficiëntere membraanassociatie en -insertie. Er is geen verschil in membraanassociatie tussen isovormen onder optimale omstandigheden voor de anionpermease-activiteit. Deze gegevens ondersteunen een model waarin verbeterde kationpermeabiliteit kan bijdragen aan de progressieve nierziekten die verband houden met ApoL1-allelen met een hoog risico.

Van twee verschillende varianten in het eiwit ApoL1 is bekend dat ze verantwoordelijk zijn voor het erkende verhoogde risico op progressieve proteïnurienierziektebij mensen van Afrikaanse afkomst, met name als gevolg van focale segmentale glomerulosclerose, hypertensieve nefrosclerose en HIV-geassocieerde nefropathie (1-3). De functionele rollen van ApoL1 in menselijke cellen, de impact van de ziekte-geassocieerde varianten op deze functies, en hoe dergelijke veranderingen inactiviteit kunnen versnellennierziektezijn onduidelijk (4, 5).

De enige biochemische activiteit waarvan bekend is dat het ApoL1-eiwit bezit, is dat het functioneert als een ionkanaal. Van het N-terminale domein van ApoL1 is opgemerkt dat het een structurele overeenkomst heeft met bacterieel colicine Al (6). Net als colicine A1 is ApoL1 een amfitroop eiwit dat onder bepaalde omstandigheden een lipidemembraan kan binnendringen vanuit een waterige oplossing en vervolgens als een ionenpermease functioneert (6–9). Gezuiverd recombinant wildtype ApoL1 is stabiel in detergensoplossing bij neutrale pH (8, 9). Bij lage pH kan ApoL1 fosfolipidemembranen binnendringen en de anionselectieve permeabiliteit van de membranen verhogen (6, 7, 9). Wanneer de cis-pH weer neutraal wordt, wordt de anionselectieve permeabiliteit onderdrukt en wordt een kationselectief kanaal geactiveerd (8, 9). Deze gegevens ondersteunen een model waarin ApoL1, gepresenteerd aan een zuur compartiment langs ofwel de exocytische ofwel de endocytische routes, zou kunnen inbrengen in het beperkende membraan van het organel, wat leidt tot verhoogde anionpermeabiliteit. Daaropvolgend transport van het eiwit naar andere membraancompartimenten waar de cis-pH neutraal zou zijn (zoals het plasmamembraan of mitochondriale membranen) zou de anionpermeabiliteit onderdrukken en het kationpermease activeren. Of deze ionenpermease-activiteiten een rol spelen in de pathogenese van ApoL1-geassocieerdenierziektenis onduidelijk.

We gebruikten op blaasjes gebaseerde methoden om te testen op verschillen inion-permease-activiteiten en membraanbinding tussen de desbetreffende (wildtype) sequentie, aangeduid als G0, en de twee met ziekte geassocieerde varianten, aangeduid als G1 en G2. We vinden dat, vergeleken met G0, zowel de G1- als de G2-isovormen een verhoogde specifieke activiteit van de kationpermeaseactiviteit vertonen bij neutrale pH zonder de anionselectieve permeaseactiviteit bij lage pH te veranderen. Verder vertonen de ziekte-geassocieerde isovormen G1 en G2 verhoogde stabiele membraanassociatie vergeleken met G0 onder omstandigheden die de kationpermease-activiteit ondersteunen, maar niet onder omstandigheden die de anionpermease-activiteit ondersteunen. We vinden geen enkel effect op het patroon van pH-gevoeligheid van de bindingsstap of de effluxstap van de kationkanaalactiviteit, en we vinden geen effect op de pH-gevoeligheid van de anionselectieve permeaseactiviteit. We concluderen dat de ziekte-geassocieerde varianten van ApoL1 selectief de kationkanaalactiviteit van het eiwit versterken, waarschijnlijk ten minste gedeeltelijk door membraaninsertie te versterken. We stellen voor dat deze verbeterde kanaalactiviteit bijdraagt ​​aan progressivenierziektebij mensen die risicovolle genotypen dragen.

Cistanche kan behandelennierziekte

Resultaten

Recombinante isovormen van ApoL1 met de N-terminale signaalsequentie verwijderd en vervangen door een 6His/T7epitoop-tag werden tot expressie gebracht en gezuiverd. Alle drie vertoonden identieke chromatografische eigenschappen door de zuivering en waren niet te onderscheiden door gelelektroforese Figuur 1.

Piekfracties werden verdund tot 100 ug/ml en onderworpen aan tovesicle-efflux-assays voor het vermogen om chloride- en kaliumpermeabiliteit te verlenen. De test bestaat uit twee afzonderlijke fasen. In de associatiefase wordt ApoL1 gemengd met KCl-geladen fosfolipide-blaasjes en mag het in de membranen worden ingebracht. Extravehicular KCl en buffer worden vervolgens verwijderd door passage door een ontzoutende spinkolom die in isotone sucrose is geëquilibreerd, waardoor grote gradiënten van binnen naar buiten van beide Kand worden gegenereerd. Cl ionen. In de effluxfase wordt het spinkolomeluaat verdund in een isotone gebufferde sucroseoplossing die de KCl-gradiënt op de gewenste pH houdt. Extravehicular Cl-concentratie wordt gecontroleerd met een chloride-selectieve elektrode. Zelfs als K- of Cl-selectieve permeabiliteit aanwezig is, zal geen van beide ionen de blaasjes kunnen verlaten vanwege gebrek aan tegenionbeweging. Spanningsgestuurde ionenefflux wordt geïnitieerd door de toevoeging van een verzadigende concentratie van een tegenion-ionofoor. De toevoeging van de K-selectieve ionofoor, valinomycine (Val), zal een groot intern negatief membraanpotentiaal induceren dat, als Cl-permeabiliteit aanwezig is, KCl-efflux zal aansturen die zal worden gedetecteerd door de chloride-selectieve elektrode; dus na Val weerspiegelt de snelheid van Cl-efflux de Cl-permeabiliteit. Omgekeerd zal de toevoeging van de Cl-selectieve ionofoor, Chloride Ionofoor 1 (CI1), een binnen-positief membraanpotentieel induceren dat KCl-efflux zal aansturen als er een K-permeabiliteit aanwezig is. Vandaar dat, na de toevoeging van CI1, de snelheid van Cl-efflux de K-permeabiliteit weerspiegelt. Deze test kan dus dienen als een Cl- of K-permeabiliteitstest, afhankelijk van welke ionofoor wordt gebruikt. De initiële snelheid van ionefflux na de toevoeging van ionofoor wordt genomen als de specificionische permeabiliteit van de blaasjes. Let op, Cl-efflux voorafgaand aan de toevoeging van ionofoor duidt op enige permeabiliteit voor zowel Kand Cl. Zelfs in deze omstandigheid vertegenwoordigt de snelheid van Cl-efflux na toevoeging van een overmaat van het tegenion-ionofoor de permeabiliteit voor het van belang zijnde ion - Cl na toevoeging van Val en K na toevoeging van CI1.

Cistanche kan behandelennierziekte

Chloridepermease-activiteit

Onze eerdere studies toonden aan dat de anionpermeabiliteit het grootst is wanneer zowel de membraanassociatiestap als de effluxstap worden uitgevoerd bij pH 5.0, en deze omstandigheden werden gebruikt om de Cl-permeabiliteitsactiviteit van de drie isovormen te vergelijken, met behulp van Val om te initiëren Cl permeabiliteitsafhankelijke efflux. Voorbeelden van onbewerkte gegevens worden weergegeven in figuur 2A, die de output van de Cl-selectieve elektrode in millivolts uitgezet tegen de tijd toont. De opname begint voorafgaand aan de toevoeging van het spinkolom-eluaat dat blaasjes en eiwit bevat, waarbij de mV-waarde de 10 μM Cl-concentratie weerspiegelt. Het Cl-vrije spinkolom-eluaat wordt toegevoegd bij de eerste pijl, waardoor de Cl wordt verdund, wat wordt weerspiegeld in de opwaartse afbuiging van de mV-tracering. Val wordt toegevoegd bij de tweede pijl, waardoor Cl-efflux wordt geactiveerd als Cl-permeabiliteit aanwezig is, wat wordt weerspiegeld door de progressieve daling inmV. Triton X-100 wordt toegevoegd bij de derde pijl, waardoor alle resterende intravesiculaire chloride vrijkomt. Na conversie van mV naar chlorideconcentratie met behulp van een standaardcurve die voor de elektrode is gegenereerd onder de omstandigheden van de test, wordt de fractionele aanvankelijke snelheid van Cl-afgifte na toevoeging van Val bepaald en genomen als de chloridepermeabiliteit. Vergeleken met de controle zonder eiwit (blauwe tracering), geeft de hoge snelheid van Cl-afgifte na de toevoeging van Val aan dat ApoL1 substantiële Cl-permeabiliteit verleent die vergelijkbaar lijkt tussen de drie isovormen (rode, groene en gele traceringen). De zeer lage uitstroomsnelheid voorafgaand aan Val geeft aan dat de kaliumpermeabiliteit veel lager is dan de Cl-permeabiliteit. Een reeks concentraties van de ApoL1-isovormen werd getest op Cl-permeaseactiviteit (Fig. 2B). Zoals eerder gerapporteerd voor G0, vinden we dat Clpermease-activiteit lineair gerelateerd is aan de hoeveelheid eiwit in de test voor alle drie isovormen. De permease-activiteit bij elke concentratie is niet verschillend tussen de drie isovormen. De concentratiecurve werd tweemaal uitgevoerd met behulp van twee verschillende sets eiwitpreparaten, wat hetzelfde resultaat opleverde.

Zes onafhankelijke preparaten van de drie eiwitten werden getest op Cl-permease-activiteit bij pH 5.0 zoals samengevat in figuur 2C. In geen van de sets preparaten vonden we een significant verschil in Cl-permease-activiteit tussen de isovormen (p > 0.05 voor vergelijking van G0 met G1 of G2 in elke set) . De gemiddelde uitstroomsnelheden van alle zes preparaten (aangeduid met ALL in Fig. 2C) waren 1,21 ± 0,32 procent /s voor de referentiesequentie G0, 1,36 ± 0,41 procent /s voor G1 en 1.18 ± 0.34 voor G2(gemiddelde ± SD, n=6 voor elk; p=0.47 en 0.94 voor vergelijking van G0 met G1 en G2 respectievelijk). Om te bepalen of de ziekte-geassocieerde mutaties de pH-gevoeligheid van het anionpermease veranderen, werd de door elke isovorm verleende Cl-permeabiliteit getest door middel van een reeks pH-waarden, met behulp van de aangegeven pH voor zowel associatie- als effluxstappen van de test (Fig. 2D). We vonden geen grote verschillen tussen de isovormen. Dit experiment werd twee keer uitgevoerd met twee verschillende sets eiwitpreparaten, wat hetzelfde resultaat opleverde. De Clpermease-activiteit is dus niet significant verschillend tussen de twee met de ziekte geassocieerde varianten en de referentiesequentie.

Kaliumpermease-activiteit

Onze eerdere studies gaven aan dat de permeabiliteit van kationen het grootst is wanneer de membraanassociatiestap wordt uitgevoerd bij pH 6.0 en de effluxstap wordt uitgevoerd bij pH 7,5, en we gebruikten deze omstandigheden tenzij anders aangegeven. Voorbeelden van onbewerkte gegevens van een K-permease-assay worden weergegeven in figuur 3. Net als bij de Cl-permeabiliteitsassays wordt het spinkolom-eluaat toegevoegd aan de eerste pijl, de ionofoor (in dit geval Chloride Ionofoor1, CI1) wordt toegevoegd aan de tweede pijl, en wasmiddel wordt toegevoegd bij de derde pijl. De aanvankelijke uitstroomsnelheden na de toevoeging van ionofoor, die de K-permeabiliteit vertegenwoordigen, worden weergegeven door de grijze stippellijnen. De blauwe tracering is van de geen-eiwitcontrole, die de endogene achtergrondpermeabiliteit van alleen de blaasjes laat zien. De rode tracering toont de activiteit van de G0(wildtype) variant, wat duidelijk de aanwezigheid aantoont van K-permeabiliteit die groter is dan controlevesikels verleend door het eiwit zoals eerder gerapporteerd (9). De gele en groene sporen tonen respectievelijk de activiteit van de G1- en G2-varianten. De aanvankelijke hellingen na de toevoeging van ionofoor zijn duidelijk groter voor G1 en G2 dan voor G0, wat aangeeft dat de ziekte-geassocieerde varianten een grotere K-permease-activiteit ondersteunen dan G0.

In tegenstelling tot de Cl-permeabiliteitstest, en zoals eerder gerapporteerd voor de G0-isovorm (9), is er onder de K-permeasetestomstandigheden enige efflux voorafgaand aan ionofoor in de blaasjes die een van de drie isovormen bevatten, weergegeven door de neerwaartse helling van de opnames na toevoeging van monster en vóór toevoeging van ionofoor. Hoewel de hoge uitstroomsnelheid na de toevoeging van ionofoor de aanwezigheid van aanzienlijke K-permeabiliteit aangeeft, duidt de uitstroom voorafgaand aan ionofoor ook op de aanwezigheid van enige Cl-permeabiliteit, waardoor beide ionen uit de blaasjes kunnen lekken in afwezigheid van ionofoor. Dit lek verklaart waarschijnlijk zowel de afgestompte stijging van de elektrode-output onmiddellijk na de toevoeging van het spinkolom-eluaat als de daaropvolgende neerwaartse helling voorafgaand aan CI1 die wordt waargenomen bij alle opnames die ApoL1 bevatten. Ervan uitgaande dat dit lek begint wanneer het monster door de spinkolom gaat, zou dit ook de verschillen in de uiteindelijke Cl-concentratie verklaren na de toevoeging van detergens, aangezien elk verlies van KCl op de spinkolom zou betekenen dat er minder totaal KCl aan de test wordt toegevoegd. De kwantitatieve interpretatie van de ionofoorsnelheid is niet eenvoudig, behalve dat het een functie moet zijn van de permeabiliteiten voor zowel Kand Cl. Zoals eerder (9), schrijven we deze activiteit toe aan de residuele Cl-permease-activiteit die we zien bij pH 7,5 zoals in figuur 2D (zie ook Bruno et al. (9), figuur 4D).

Kaliumpermease-assays werden uitgevoerd over een reeks eiwitconcentraties (Fig. 4A). De activiteit was lineair gerelateerd aan de hoeveelheid eiwit in de test voor elke isovorm, maar de twee ziekte-geassocieerde isovormen vertoonden aanzienlijk verhoogde efflux-activiteit in vergelijking met G0. Deze concentratiecurve werd gereproduceerd met drie afzonderlijke sets eiwitbereiding, wat zeer vergelijkbare resultaten opleverde.

Zes onafhankelijke preparaten van de drie isovormen werden getest op K-efflux-activiteit met gebruikmaking van 2 ug eiwit in elke test. In elk van de zes sets was de activiteit voor de G1- en G2-isovormen significant groter dan die van G0 (figuur 4B). Het gemiddelde van alle zes datasets leverde effluxsnelheden op van 0,349 ± 0.063 procent /s voor G{{10}}, {{15} }.709 ± 0.176 procent /s voor G1 en 0.673 ± 0.142 procent /s voor G2 (gemiddelde ± SD, n=6 voor elk; p < 0,00001="" voor="" vergelijking="" van="" g0="" met="" g1="" of="" g2).="" de="" specifieke="" activiteiten="" van="" het="" k-permease="" van="" g1="" en="" g2="" zijn="" bij="" deze="" test="" respectievelijk="" 2,03-="" en="" 1,93-voudig="" groter="" dan="">

De afhankelijkheid van de K-permease-activiteit van de pH van de membraanassociatiestap en de ioneneffluxstap werd afzonderlijk geanalyseerd. Hoewel we hebben bevestigd dat de totale effluxactiviteit van G1 en G2 groter is dan die van G0 onder "standaard" omstandigheden (binding bij pH 6, efflux bij pH 7,5), vonden we geen significant verschil in de vorm van de curve van activiteit versus externe (cis) pH van ofwel de membraanassociatiestap (Fig. 4C) of de ion-effluxstap (Fig. 4D). We vonden ook geen verschillen tussen de isovormen in de afhankelijkheid van activiteit van hoge intravesiculaire (trans) pH of de noodzaak van de aanwezigheid van tweewaardige kationen (Fig. 4E), en merken verder op dat calcium of magnesium even efficiënt is in het leveren van het noodzakelijke tweewaardige kation voor volledig werkzaamheid. Elk van deze experimenten werd tweemaal uitgevoerd met verschillende sets gezuiverd eiwit, wat identieke resultaten opleverde.

Stabiele membraanassociatie

We hebben eerder aangetoond dat gezuiverd recombinant ApoL1 spontaan bindt aan fosfolipidemembranen die een vergelijkbare afhankelijkheid van pH en fosfolipidesamenstelling vertonen als die van de ionpermease-activiteiten (9). Met behulp van vergelijkbare methoden vergeleken we de lipidevesikel-bindende eigenschappen van de referentieversie van ApoL1 met de nierziekte-geassocieerde varianten onder omstandigheden die optimale Cl- of K-permease-activiteiten ondersteunen (Fig. 5). Voor de Clpermease-omstandigheden werd het eiwit geïncubeerd met lipideblaasjes bij pH 5.0 voorafgaand aan chaotrope extractie om eiwitten te verwijderen die niet stabiel waren geassocieerd met de blaasjes. Membraangebonden eiwit werd geïsoleerd door flotatie door een sucrosekussen en beoordeeld door kwantitatieve western blotting. Resultaten worden getoond in figuur 5A. Er was geen significant verschil in de hoeveelheid eiwit gebonden aan blaasjes tussen G{{10}} en G1- of G2-isovormen. Van het 500 ng eiwit in elke reactie was de hoeveelheid gebonden aan blaasjes 223 ± 33 ng voor G0,239 ± 38 ng voor G1 en 191 ± 28 ng voor G2 (gemiddelde ± SD ; n=8 voor elke groep, p=0.35 en 0.076 voor vergelijking van G0 met respectievelijk G1 en G2). Ongeveer 40-50 procent van het eiwit in de test is onder deze omstandigheden aan membranen gebonden. Dit experiment werd tweemaal uitgevoerd en leverde zeer vergelijkbare resultaten op.

Om de binding te beoordelen onder omstandigheden die optimaal zijn voor de Kpermease-activiteit, werd het eiwit geïncubeerd met blaasjes bij pH 6.0, vervolgens verschoven naar pH 7,5 voorafgaand aan chaotrope extractie om niet-stabiel ingevoegd eiwit te verwijderen. Membraangebonden proteïne werd geïsoleerd door flotatie van de membraanblaasjes door asucrosekussen en beoordeeld door kwantitatieve western blotting. Resultaten worden getoond in figuur 5B. De ziekte-geassocieerde varianten vertonen een significant efficiëntere binding vergeleken met de G0. Van de 500 ng eiwit die aan elke reactie werd toegevoegd, was de hoeveelheid gebonden aan blaasjes 43,5 ± 14,5 ng (n=8) voor G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) voor G1 en 69,3 ± 10,3 ng (n=8) voor G2(gemiddelde ± SD; p=0.00076 en 0,0018 voor vergelijking van G0 met respectievelijk G1 en G2). Ongeveer 9 procent van het GO-eiwit in de reactie was stabiel geassocieerd met de blaasjes, vergeleken met ongeveer 14 procent van het G1 en G2 onder deze omstandigheden. Dit experiment werd tweemaal uitgevoerd met behulp van onafhankelijke preparaten die vergelijkbare resultaten opleverden.

Discussie

We presenteren hier resultaten van onderzoeken naar ionpermease-activiteiten van ApoL1 en zijnnier-ziekte-geassocieerde varianten die verschillende significante resultaten opleverden. Ten eerste vinden we dat de ziekte-geassocieerde varianten van ApoL1 een aanzienlijk verhoogde Kpermease-activiteit hebben, wat ongeveer het dubbele is van die van de G0-isovorm in onze tests. Ten tweede zijn er, in tegenstelling tot de Kpermease, geen significante verschillen in de specifieke activiteit van de Cl-permeaseactiviteit bij pH 5.0 tussen de isovormen. Ten derde zijn er geen verschillen in de pH-gevoeligheid van ofwel de K- of Cl-permease-activiteiten, of de vereiste voor een hoge trans-pH en de noodzaak van een tweewaardig kation voor de Kpermease-activiteit tussen de isovormen. Ten vierde, onder optimale omstandigheden die het K-permease ondersteunen, vertonen de ziekte-geassocieerde varianten verbeterde stabiele membraanassociatie vergeleken met G0, maar geen verschil in membraanassociatie onder optimale omstandigheden voor de Cl-permeaseactiviteit.

Onze bevindingen die verhoogde K-permease aantonen zonder effect op Cl-permease zijn zeer robuust. Onder gebruikmaking van optimale omstandigheden voor elke permease-activiteit, vonden we in wezen identieke resultaten tussen zes onafhankelijke sets preparaten, waarbij de Kpermease-activiteit van de ziekte-geassocieerde varianten significant groter was dan G0 in elk. Elke set werd tegelijkertijd bereid en getest met gebruikmaking van gewone reagentia. De validiteit van de eiwitconcentraties bepaald door de BCA-assay werd bevestigd door de vergelijkbare intensiteit van Coomassie-kleuring op SDS-PAGE. Deze gegevens omvatten alle succesvolle pogingen tot gelijktijdige zuivering - we hebben nooit met succes een reeks gegenereerd van alle drie de varianten waarin deze relatieve activiteiten niet werden waargenomen.

Evenzo was de afwezigheid van verschillen in de anion-permease-specifieke activiteit bij pH 5 consistent tussen alle sets preparaten. Onze primaire conclusie is dus dat de ziekte-geassocieerde varianten van ApoL1 selectieve winst van functie in de K-permease-activiteit verlenen zonder de Cl-permease-activiteit te beïnvloeden, zoals getest onder optimale omstandigheden voor elk van deze activiteiten. De aanwezigheid van substantiële verschillen in de kationkanaalactiviteit van ApoL1-varianten die correleren met het vermogen om ziekte aan te drijven, heeft implicaties voor mogelijke pathogene mechanismen. De selectieve aard van de verhoogde ionpermeabiliteit geeft aan dat een verhoogde kation-permease-activiteit van de ziekte-geassocieerde varianten zou kunnen bijdragen aan de ziekte, maar dat het onwaarschijnlijk is dat de anion-permease-activiteit bij lage pH, die niet verschilt tussen de isovormen, een cruciale rol zal spelen.

Het onderzoek naar de effecten van de varianten op de pH-gevoeligheden van de activiteiten en op de mate van stabiele membraanbinding door het eiwit werpt licht op het mechanisme waardoor de K-permease-activiteit kan worden versterkt. Ten eerste, behalve het bevestigen van de verhoogde activiteit van het K-permease onder optimale omstandigheden, vonden we geen verschillen in de vormen van de curven die pH-effecten op de membraanassociatie en effluxstappen van de K-permease-activiteit of van het effect van pH op de totale Cl-permease-activiteit laten zien. Verder waren er geen verschillen in de vereiste voor verhoogde pH van het inwendige van de blaasjes of in de vereiste voor de aanwezigheid van tweewaardige kationen in de reactie voor de K-permease-activiteit van alle isovormen. We vonden dus geen bewijs voor een verschil in de intrinsieke eigenschappen van het kanaal zelf. Daarentegen vertoonden de varianten een significant verhoogde stabiele associatie met fosfolipide-blaasjes onder omstandigheden die de Kpermease-activiteit ondersteunen, waarbij de schaal van dit effect ongeveer hetzelfde bereik is als de verandering inactiviteit. Alles bij elkaar genomen suggereren de gegevens dat de basis voor de verhoogde K-permease-activiteit eenvoudigweg efficiëntere membraaninsertie is onder de omstandigheden die de activiteit ondersteunen, zonder de noodzaak om een ​​fundamentele verandering in de eigenschappen van het ingevoegde eiwit teweeg te brengen.

Er zijn drie domeinen geïdentificeerd in de ApoL1-structuur (6). Aangenomen wordt dat de ionkanaalactiviteit in het colicine-homologe "porievormende" domein ligt, dat ongeveer 60% van het eiwit aan zijn N-terminus inneemt. De ziektegerelateerde sequentievariaties bevinden zich niet in het porievormende domein, maar op een afstand daarvan in een coiled-coil-domein, dat ongeveer 16 procent van het eiwit aan het C-uiteinde omvat. Deletie van dit domein heeft geen effect op trypanolytische activiteit, maar is sterk geconserveerd onder Apol-isovormen, zowel binnen als tussen soorten (10). Er is gesuggereerd dat dit gebied functioneert als een gecontroleerd domein (10), en onze gegevens geven aan dat ziekteverwekkende mutanten in dit domein inderdaad een verhoogde membraanbinding hebben onder omstandigheden die kationkanaalactiviteit en verhoogde kationkanaalactiviteit ondersteunen. Eén interpretatie is dat het C-terminale domein dient om de membraanassociatie/insertie die nodig is voor kationpermease-activiteit te onderdrukken, en mutatie van dit domein ontspant deze onderdrukking.

Cistanche kan behandelennierziekte

De waarnemingen over membraanbinding hebben verdere implicaties en verlichten enkele aspecten van de relatie tussen anion- en kationpermease-activiteiten. We vinden hier dat aanzienlijk meer eiwit aan membranen wordt gebonden bij optimale anionpermease-activiteitsomstandigheden (pH 5.0) dan bij optimale bindingscondities die kationpermease-activiteit ondersteunen (pH 6.0), en dit geldt voor alle isovormen (Fig. 5). Let op het verschil in de pH-gevoeligheden van de anionpermeaseactiviteit (Fig. 2D) en de membraanbindende stap van de kationpermeaseactiviteit (Fig. 4C): anionpermease neemt dramatisch toe onder pH 6, terwijl het vermogen van eiwit dat in het membraan wordt ingebracht om kationen te ondersteunen permease-activiteit daalt aanzienlijk. Onze eerder gerapporteerde gegevens toonden aan dat de stabiele membraanassociatie van G0 aanzienlijk stijgt als de pH door datzelfde pH-bereik daalt, en dat is het bereik waarin de fluorescentie van het trinsieke eiwit het meest dramatisch wordt onderdrukt (9), wat wijst op een significante overgang in de structuur van het eiwit . Alles bij elkaar genomen suggereren de gegevens dat membraaninsertie bij pH 6.0 fundamenteel anders is dan membraaninsertie bij pH 5.0. Bij pH 6.0 associeert een kleinere fractie van het eiwit zich met membranen, vergezeld van slechts een kleine verandering in intrinsieke fluorescentie en beperkte anionpermeaseactiviteit, maar met het vermogen om over te gaan naar een kationpermeabele vorm wanneer het cis-compartiment wordt getitreerd tot pH7 .5. Verder is de efficiëntie van deze binding groter voor de met de ziekte geassocieerde varianten, parallel aan de verhoogde kationpermease-activiteit na pH-verschuiving. Daarentegen is bij pH 5.0 een veel grotere fractie van het eiwit geassocieerd met de membranen; deze binding gaat gepaard met een grote verandering in intrinsieke fluorescentie en het optreden van een veel grotere anionpermease-activiteit. Noch membraanbinding noch anionpermease-activiteit is verschillend tussen isovormen. Het vermogen van dit ingebrachte eiwit om over te gaan naar de kationpermeasebevestiging is sterk verminderd. We veronderstellen dat de eerder gerapporteerde verandering in intrinsieke fluorescentie als de pH daalt van 6 naar 5 een structurele transformatie weerspiegelt naar een vorm die niet in staat is om over te gaan naar de kationpermeaseconformatie, en verschillen tussen de isovormen hebben geen effect op de ionpermease-eigenschappen van deze conformatie.

Een andere nieuwe observatie is dat calcium- en magnesiumionen even effectief zijn in het ondersteunen van de activiteit van de kationkanalen van ApoL1. Dit suggereert sterk dat de rol van tweewaardige kationen niet ligt in een binding met hoge affiniteit door het eiwit, maar waarschijnlijker een minder specifiek ladingsoverbruggend effect waardoor negatief geladen eiwit kan interageren met het negatief geladen oppervlak van fosfolipidemembranen.

Andere onderzoeken naar verschillen in ionkanaalactiviteit van ApoL1-isovormen zijn gepubliceerd. Thompson en Finkelstein (8) gebruikten elektrofysiologische methoden met vlakke lipidedubbellaagtechnieken om de kanaalactiviteit van gezuiverd recombinant ApoL1 te beoordelen, waarbij geen verschillen in kanaalkenmerken tussen de isovormen werden gemeld. Het is belangrijk op te merken dat vlakke lipide dubbellaagse methoden en op blaasjes gebaseerde efflux-assays, hoewel beide kanaalassays zijn, verschillende soorten informatie opleveren en kunnen worden beschouwd als complementaire experimentele systemen. Lipide bilayer-methoden zijn een ongeëvenaarde benadering om enkelkanaalseigenschappen van gezuiverd eiwit te definiëren, maar zijn minder krachtige hulpmiddelen om specifieke activiteit te kwantificeren, terwijl vesikel-efflux-assays kwantitatieve gegevens kunnen leveren over de activiteit van een populatie, maar weinig informatie over enkelkanaals eigenschappen. De waarnemingen van Thomp son en Finkelstein zijn dus niet in strijd met de onze, die ook geen duidelijke verschillen in de intrinsieke eigenschappen van het kanaal laten zien, maar slechts een verschil in specifieke activiteit van ongeveer het dubbele, een schaal van verschil dat vrij moeilijk zou zijn om detecteren in lipide dubbellaagsystemen.

Onderzoeken met gezuiverde eiwitten en lipiden hebben de eigenschap eigenschappen aan het licht te brengen die duidelijk te wijten zijn aan het eiwit zelf en niet worden gewijzigd door andere componenten, expressiekinetiek of membraantransport die complexere systemen in gevaar brengen. Ze zwijgen echter noodzakelijkerwijs over het uiteindelijke effect dat deze activiteiten op levende cellen hebben. Er zijn onderzoeken gerapporteerd waarbij celgebaseerde expressiesystemen werden gebruikt om ionkanaalactiviteiten van ApoL1 te ontkrachten (beoordeeld in Friedman en Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al. (11) brachten ApoL1-isovormen tot expressie in HEK-cellen en beoordeelden de stabiele intracellulaire kaliumconcentratie. Ze vonden een lager intracellulair kalium in cellen die G1 en G2 tot expressie brengen in vergelijking met cellen die G0 tot expressie brengen. Hoewel deze waarneming consistent zou kunnen zijn met een verhoogde permeabiliteit van plasmamembraan K, zou de lagere intracellulaire K ook een niet-specifiek gevolg kunnen zijn van het grotere cytotoxische effect van de variant via elk mechanisme, wat leidt tot minder actieve NaK-ATPase-activiteit en/of afbraak van de integriteit van het plasmamembraan. O'Toole et al. (12) zorgvuldig gekalibreerde expressieniveaus in HEK-cellen en het uiterlijk van plasmamembraankationkanaalactiviteit beoordeeld, waarbij geen verschillen tussen de isovormen werden gevonden. Sjah et al. (13) rapporteerde het richten van ApoL1 op mitochondriën waar de ziekte-geassocieerde varianten de opening van de mitochondriale permeabiliteit-overgangsporie induceerden, consistent met recent bewijs voor trypanosoom-cytotoxiciteit. Of dit effect ionkanaalactiviteit van ApoL1 vereist, is onduidelijk. Bij elk van deze onderzoeken kan, vanwege de complexiteit van op cellen gebaseerde expressiesystemen, niet zeker worden gesteld of de geconstateerde verschillen te wijten zijn aan intrinsieke eigenschappen van het eiwit of aan andere interagerende componenten die aanwezig zijn in cellen.

Pathogene gain-of-function-mutaties vertonen doorgaans een dominant overervingspatroon, terwijl denierziekte fenotypegeassocieerd met ApoL1-varianten recessief is. Een mechanisme waardoor een gain-of-function-mutatie recessief kan zijn, is als het eiwit functioneert als een homomultimeer, en de WT een dominant-negatief effect kan uitoefenen op de geactiveerde variant. Of ApoL1 functioneert als een kanaal als een monomeer of een multimeer is momenteel niet bekend.

Onze gegevens suggereren dat een verhoogde kationpermeabiliteit bij vergelijkbare niveaus van eiwitexpressie zou kunnen bijdragen aan tocytotoxiciteit in podocyten of andere cellen. Het lijkt echter waarschijnlijk dat een loutere tweevoudige toename van de activiteit een schijnbaar goedaardig molecuul zou kunnen omzetten in één drijvende ziekte. Desalniettemin hebben de ziekten die geassocieerd zijn met ApoL1-varianten de neiging langzaam progressief te zijn, en subtiele verschillen over een langere periode (maanden tot jaren) zouden een groot cumulatief effect kunnen hebben. Andere mogelijke mechanismen van ApoL1-actie die verantwoordelijk zijn voor:nierblessurezijn voorgesteld en worden ondersteund door bewijs (3-5, 11-16), waaronder effecten op onder meer apoptose, autofagie, mitochondriale functie, intracellulaire membraanhandel en mediërende effecten van extracellulaire signaalmoleculen. Het relatieve belang van de verschillen in de hier beschreven ApoL1-kanaalactiviteit versus andere mogelijke werkingsmechanismen bij het aansturen van ziekten moet nog worden bepaald.

Cistanche kan behandelennierziekte

Experimentele procedures

Expressie constructies

pET-ApoWT coderend voor N-terminaal 6His en T7 epitoop-gelabeld ApoL1 (G0 versie) werden eerder beschreven (9). Het gecodeerde eiwit is identiek aan dat van Genbank accession#BC143038 (haplotype 150K, 228I, 255K) van aminozuur 28 tot 398, waarbij de signaalsequentie in aminozuren 1-27 wordt geëlimineerd en met de toevoeging van N-terminus {{ 17}}His- en T7-epitooptags gecodeerd door het pET28a-plasmide. Plasmiden die coderen voor de G1- en G2-varianten werden gegenereerd uit pET-ApoWT door substitutie van het AleI- naar XhoI-restrictiefragment met fragmenten die de variantsequenties bevatten, gesynthetiseerd door Integred DNA Technologies, Coralville, IA, en de identiteit van de resulterende plasmiden bevestigd door directe sequencing. Alle drie de constructen waren identiek behalve de S342G- en I384M-aminozuursubstituties in de G1-isovorm en de N388-Y389-deletie in de G2-isovorm. Recombinante ApoL1-isovormen werden tot expressie gebracht in bacteriën en gezuiverd zoals beschreven (8) behalve dat de S200-kolombuffer 0,03% n-dodecyl- -D-maltoside (DDM) (Millipore-Sigma) bevatte. Voor alle reeksen experimenten waarbij isovormen werden vergeleken, werden de materialen tegelijkertijd onder identieke omstandigheden met dezelfde reagentia bereid. De eiwitconcentratie werd bepaald met de BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) met behulp van de standaard bovineserumalbumine. Voor totaal eiwit zoals in Figuur 1 werden gels gekleurd met Instant Blue (Expedeon Inc). Eiwit in S200-buffer werd snel ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 C. Hoeveelheden werden ontdooid op ijs en verdund in S200-buffer voorafgaand aan tests.

Ionoforen

Valinomycine (Millipore Sigma) werd opgelost bij 50 mM inabsolute ethanol en onmiddellijk voor gebruik verdund tot 1 mM in absolute ethanol. Chloride Ionofoor 1 (MilliporeSigma) werd onmiddellijk voor gebruik opgelost bij 100 mM in 1-hexanol en verdund tot 0,2 mM in absolute ethanol.

Membraan blaasjes

Asolectine (sojafosfatidylcholine type II, Sigma) werd met aceton geëxtraheerd zoals beschreven (30), gedroogd en vervolgens opgelost in chloroform en bewaard bij -20 C. Een hoeveelheid fosfolipiden in chloroform werd gedroogd onder een stroom stikstof en gesuspendeerd bij 20 mg/ml in 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8,0 door vijf vries-dooicycli en krachtig vortexen. Deze suspensie werd bewaard bij –20 graden. Om met KCl beladen unilamellaire blaasjes met een diameter van ongeveer 200 nm te genereren, werd de lipidesuspensie 15 keer door een 200 nm poriepolycarbonaatmembraanfilter geleid met behulp van een extruderkamer (Avanti Polar Lipids) en het protocol geleverd door de fabrikant (17, 18). Geëxtrudeerde blaasjes werden op ijs bewaard en binnen 24 uur gebruikt.

Activiteitstesten

Ionenpermease-activiteitsassays met behulp van door membraanpotentiaal aangedreven KCl-efflux gedetecteerd met een chloride-selectieve elektrode werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (9). Twintig microliter ApoL1 in S200-buffer (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH 8,3, 0,3 procent DDM) wordt toegevoegd tot 380 ul reactiemengsel bestaande uit 82 mM KCl, 127 mM sucrose, 42,1 mM buffer bij de aangegeven pH (MES voor pH 5-6,5, HEPES voor pH 7,0-8,0), 2,63 mMCa(gluconaat)2 en 1,84 mg/ml geëxtrudeerd isolectine blaasjes. Het mengsel wordt gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd voordat het door een Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) spinkolom van 3 ml wordt geleid, die is geëquilibreerd in 330 mM sucrose. Het eluaat wordt onmiddellijk toegevoegd aan 2 ml 330 mM sucrose, 10-5 M KCl, 2,5 mM Ca(gluconaat)2 en 10 mM buffer (MES voor pH 5-6,5; HEPES voor pH 7-8) zoals aangegeven, met continue bewaking met een chloride-selectieve elektrode en geregistreerd zoals beschreven. Na 20 s werd de spanningsgestuurde efflux geïnitieerd door de toevoeging van een ionofoor (2,5 ul van ofwel 1 mM valinomycine of 0,2 mMChloride Ionofoor 1 in ethanol) en liet men 30 s doorgaan gevolgd door de toevoeging van Triton X-100 tot 0,1 procent om het resterende intravesiculaire chloride vrij te maken. Ruwe gegevens in mV werden geconverteerd naar Cl-concentratie met behulp van een standaardcurve gegenereerd voor de elektrode onder omstandigheden van de test. Aanvankelijke fractionele snelheden van chlorideafgifte werden afgeleid van 3 s tijdens de maximale onmiddellijke respons op de toevoeging van ionofoor.

Alle activiteitsvergelijkingen werden uitgevoerd met materiaal van gelijktijdige bereidingen van de drie isovormen die voorafgaand aan de test waren verdund tot 100 ug/ml eiwit in S200-buffer. Alle tests die werden gebruikt voor directe vergelijking tussen de varianten werden op dezelfde dag uitgevoerd met dezelfde vers bereide reagentia.

Membraanassociatietest

Membraanassociatiebepalingen werden afzonderlijk uitgevoerd onder omstandigheden die optimaal waren voor de Cl-permease-activiteit en voor de K-permease-activiteit. Voor aandoeningen die Clpermease-activiteit ondersteunen, 5 ul van 100 ug/ml eiwit in 1{{30}} mM Tris pH8,2, 150 mM NaCl , 0 0,03% DDM werd toegevoegd aan 95 ul reactiemengsel (3,4 mg/ml isolectineblaasjes (geladen met 200 mM KCl,5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca(gluconaat) 2, 100 mM KCl, 100 mM sucrose) en gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur geïncubeerd. De eiwit-tot-lipideverhouding in de test is 1:680 massa/massa. Het monster werd verdund zonder pHshift door toevoeging van 200 µl 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(gluconaat)2, 100 mM KCl, 100 mM sucrose en 20 s geïncubeerd. Honderd microliter 8 M ureum werd toegevoegd, gemengd en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De sucroseconcentratie werd op 40% gebracht door toevoeging van 1,6 ml 50% sucrose. Het monster van 2 ml werd aangebracht onder 1 ml 30% sucrose in 8 mM MES pH 5,0, dat op zijn beurt minder dan 1,7 ml sucrosevrij 8 mM MES pH 5,0 was. De steile gradiënten werden gecentrifugeerd bij 200,000g in een Beckman Coulter TLA-110rotor gedurende 90 min bij 4°C. De blaasjes werden verzameld van het 0 tot 30% sucrosegrensvlak. Gelijke fracties van monsters werden viervoudig verdund en gedurende 1 uur bij 100,000g gecentrifugeerd. De membraanpellets werden gedroogd, gescheiden door SDS-PAGE, geblot op polyvinylideenfluoridemembraan en onderzocht door westernblotting met antilichaam tegen het T7-epitoop (MilliporeSigmaproduct nr. 69522-3) met chemiluminescentiedetectie met behulp van een digitaal beeldvormingssysteem. Seriële verdunningen van gezuiverd eiwit werden op de gel opgenomen om een ​​isotype en blot-specifieke standaardcurve voor elk eiwit te genereren.

Voor omstandigheden die K-permease-activiteit ondersteunen, werd 5 ul van 100ug/ml eiwit in 10 mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03% DDM toegevoegd aan 95 ul van reactiemengsel (3,4 ug/ml isolectineblaasjes (geladen met 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6,0, 2,5 mM Ca(gluconaat)2, 100 mM KCl, 100 mM sucrose) en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Het monster werd verdund met pH-verschuiving naar 7,5 door toevoeging van 200 ul 60 mM HEPES pH 8,0, 2,5 mM Ca(gluconaat)2,100 mM KCl, 100 mM sucrose en 20 s geïncubeerd. Honderd microliter van 500 mM Na2C03 werd toegevoegd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De sacharoseconcentratie werd op 40 procent gebracht door toevoeging van 1,6 ml 50 procent sacharose. Het monster van 2 ml werd aangebracht onder 1 ml 30% sucrose in 8 mM Tris pH 8,3, dat op zijn beurt lager was dan 1,7 ml sucrosevrij 8 mM Tris pH 8,3. Sucrosekussens werden gecentrifugeerd en een monster werd verzameld en verwerkt zoals hierboven.

Statistieken

De significantie van verschillen tussen paren van gemiddelden binnen datasets werd bepaald met behulp van variantieanalyse (ANOVA) (19). Statistische parameters werden bepaald met behulp van een in Excel ingebedde functie. P-waarden werden berekend met behulp van socscistatistics.com. Alle datapunten worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), bepaald met de STDEV.S-functie van Excel voor elke individuele groep replica's.

Beschikbaarheid van gegevens Alle gegevens ter ondersteuning van dit artikel worden op verzoek gedeeld met Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche kan behandelennierziekte

Dankbetuigingen-Wij danken de afdeling Nefrologie en de afdeling Interne Geneeskunde van de Saint Louis University voor de essentiële ondersteuning om dit werk uit te voeren.

Bijdragen van auteurs—JCE bedacht en begeleidde de studie, zorgde voor financiering, voerde de efflux-assays uit, interpreteerde gegevens en schreef de paper; JB zuiverde de eiwitten, voerde de membraanassociatie-assays uit, interpreteerde gegevens, bereidde de figuren voor en bewerkte het papier.

Financiering en aanvullende informatie—Het werk werd gefinancierd door institutionele middelen van de Saint Louis University en door de NationalInstitutes of Health schenken R01 DK120651 aan JCE. De inhoud van dit document is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Belangenverstrengeling—De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben met de inhoud van dit artikel.

Afkortingen—De gebruikte afkortingen zijn: ApoL1, apolipoproteïneL1; CI1, chloride-ionofoor 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltoside; PVDF, polyvinylideenfluoride; SD, standaarddeviatie; Val, valinomycine.

Van: 'Nier-ziekte-geassocieerde varianten van apolipoproteïne L1 vertonen een toename van functie in kationkanaalactiviteit' doorJonathan Bruno en John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (202) 296 100238

Referenties

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Associatie van trypanolytische ApoL1-varianten metnierziektebij Afro-Amerikanen. Wetenschap 329, 841-845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) APOL1-risicovarianten, ras en progressie van chronischnierziekte. N. Engl. J. Med. 369, 2183-2196
3. Friedman, DJ en Pollak, MR (2020) APOL1 ennierziekte: Van genetica tot biologie. Ann. Rev. Fysiol. 82, 323-342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF en Sedor, JR (2017) Identificatie van de intracellulaire functie van APOL1. J. Ben. Soc. Nefrol. 28, 1008-1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H., en Okamoto, K. (2018) Apolipoproteïne L1-nefropathieën: 2017 in overzicht. Curr. Opin. Nefrol. Hypertensie. 27, 153-158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., en Pays, E. (2005) Apolipoproteïne LI bevordert de lysis van trypanosoom door poriën in lysosomale membranen te vormen. Wetenschap 309, 469-472
7. Harrington, JM, Howell, S., en Hajduk, SL (2009) Membraanpermeabilisatie door trypanosoomlytische factor, een cytolytisch menselijk lipoproteïne met hoge dichtheid. J. Biol. Chem. 284, 13505-13512
8. Thomson, R., en Finkelstein, A. (2015) Menselijke trypanolytische factor APOL1 vormt pH-gestuurde kation-selectieve kanalen in vlakke lipidedubbellagen: relevantie voor trypanosoomlysis. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 112, 2894-2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., en Edwards, JC (2017) Apolipoproteïne L1 verleent pH-schakelbare ionenpermeabiliteit aan fosfolipideblaasjes. J. Biol. Chem. 292, 18344-18353
10. Vanhollebeke, B., en Pays, E. (2006) De functie van apolipoproteïnen L. Cell Mol. Levenswetenschap. 63, 1937-1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3e, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ, en Pollak, MR (2016) APOL1nierziekterisicovarianten veroorzaken cytotoxiciteit door cellulair kalium uit te putten en te induceren
door stress geactiveerde proteïnekinasen. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 113, 830-837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA, en Sedor, JR (2018) ApoL1-overexpressie stimuleert variantonafhankelijke cytotoxiciteit. J. Ben. Soc. Nefrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR en Friedman, DJ (2019) APOL1nierrisicovarianten induceren celdood via mitochondriale translocatie en opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie. J. Ben. Soc. Nefrol. 30, 2355-2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Een tripartiet complex van suPAR, APOL1-risicovarianten en alfavbeta3-integrine op podocyten medieert chronischenier ziekte. nat. Med. 23, 945-953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) APOL1-nierrisicovarianten induceren mitochondriale disfunctie. J. Ben. Soc. Nefrol. 28, 1093-1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z., en Hu, CA (2008) Apolipoproteïne L1, een nieuw Bcl-2 homologiedomein {{4 }}alleen lipide-bindend eiwit, induceert autofagische celdood. J. Biol. Chem. 283, 21540-21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G., en Cullis, PR (1985) Productie van grote unilamellaire blaasjes door een snelle extrusieprocedure: karakterisering van grootteverdeling, ingesloten volume en vermogen om een ​​membraanpotentiaal te behouden. Biochim. Biofysica. Acta 812, 55-65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ, en Papahadjopoulos, D. (1979) Bereiding van liposomen met een gedefinieerde grootteverdeling door extrusie door polycarbonaatmembranen. Biochim. Biofysica. Acta 557, 9-23
19. Armitage, P. (1971) Statistische methoden in medisch onderzoek, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Verenigd Koninkrijk