Polycysteuze nierziekte

ali.ma@wecistanche.com

Deel Ⅱ: Nierorganoïden gegenereerd uit erytroïde voorlopercellen van patiënten met autosomaal dominante polycystische nierziekte

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

Achtergrond:Nierorganoïden zijn in grote lijnen verkregen uit in de handel verkrijgbare geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's); het was echter een grote uitdaging om op efficiënte wijze nierorganoïde modellen te produceren van patiënten met autosomaal dominante polycystischenierziekte (ADPKD) die zowel de embryogenese als de mechanismen van cystogenese recapituleren.

Klik om bijwerkingen en voordelen voor de nieren te verwijderen

Methoden: Bloederytroïde voorlopers (EP's) van twee ADPKD (autosomaal dominante polycystischenierziekte) patiënten en één gezonde donor (HC) werd gebruikt als vergelijkende controle om de vele technische stappen voor het herprogrammeren van EP's en voor de generatie van organoïden te normaliseren. EP's werden geherprogrammeerd door een episomale vector in iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen), die werden gedifferentieerd in nierbuisvormige organoïden en vervolgens gestimuleerd door forskoline om cystenvorming te induceren.

Resultaten: iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) afgeleid van EP's vertoonden alle kenmerken van pluripotentie en waren in staat om te differentiëren in alle drie de kiemlagen. 3D-buisvormige organoïden werden na 28 dagen in Matrigel uit afzonderlijke cellen gegenereerd. HC en ADPKD (autosomaal dominante polycystische)nierziekte) organoïden niet spontaan cysten vormden, maar na forskolinestimulatie werden cysten-achtige structuren waargenomen in de ADPKD (autosomaal dominante polycysteuzenierziekte) organoïden, maar niet in de van HC afgeleide organoïden.

Conclusie: De bevindingen van deze studie toonden aan dat:nierorganoïden werden met succes gegenereerd uit de bloed-EP-cellen van ADPKD (autosomaal dominante polycystische)nierziekte) patiënten en een gezonde controledonor. Deze aanpak zou moeten bijdragen als een krachtig instrument voor de embryonalenierontwikkelingsmodel, dat in staat is om de zeer vroege pathofysiologische mechanismen die betrokken zijn bij cytogenese te recapituleren.

KLIK HIER OM DEEL TE NEMENⅠ

Discussie

In de huidige studie hebben we in detail een procedure beschreven om nierorganoïden te genereren uit menselijke iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) verkregen uit de bloederytroïde voorlopercellen van patiënten met ADPKD (autosomaal dominante polycystische nierziekte). Veel somatische celtypen zijn met succes geherprogrammeerd tot iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen), waaronder bloedcellen [Z]. Hier hebben we ervoor gekozen om bloederytroïde voorlopers te gebruiken als het startceltype om een ​​aantal redenen, zoals hun genomische integriteit, epigenetisch geheugen en efficiënte herprogrammering [11,17,18]. De efficiëntie waarmee erytroïde voorlopers waren omgezet in iPSC's was maar liefst twee ordes van grootte beter (7 procent -28 procent) dan de efficiëntie van gedifferentieerde typen bloedcellen (0.0 2 procent -0,60 procent )of fibroblasten (0,74 procent)[Z]. Ondanks de lage abundantie van deze cellen in het perifere bloed, kunnen ze gemakkelijk in vitro worden geïsoleerd en uitgebreid om een ​​voldoende aantal te produceren voor herprogrammering. Een van de belangrijkste uitdagingen bij het vaststellen van geschikte iPSC's is hun genotype en fenotypische variabiliteit [6], maar er zijn enkele technische strategieën voorgesteld om dergelijke variabiliteit te omzeilen of te verminderen. In de huidige experimenten gebruikten we een niet-integrerend episomaal systeem voor herprogrammering dat geen genoomintegratie vereist om de herprogrammerende genen tot expressie te brengen [10], waardoor minder immunogeniciteit mogelijk is en meer genetisch stabiele cellen worden verkregen [19,20]. Bovendien waren alle monsters afkomstig van dezelfde bron, wat helpt bij het minimaliseren van epigenetische variabiliteit [12], ervan uitgaande dat differentiatie van de startcel de efficiëntie van de eindresultaten zou kunnen beïnvloeden. Analyse van de pluripotentiemarkers en het vermogen van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) om te differentiëren in alle drie de kiemlagen werden naast elkaar vergeleken, en ze werden ook vergeleken met de H9-embryocellijn, die werd gebruikt als een positieve controle . Al deze vergelijkingen lieten geen significante verschillen zien tussen ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte), HC's en H9-cellen.

Er zijn verschillende protocollen ontwikkeld voor het induceren van de differentiatie van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) tot nierorganoïden [13,21]. Op basis van protocollen beschreven door Cruz et al. [6], hebben we structuren verkregen met de kenmerken van proximale tubuli, inclusief de expressie van NHE3 en AOP1. Bovendien brachten de organoïden NPHS2 tot expressie, wat wijst op de aanwezigheid van podocytachtige cellen.

Omgekeerd werd AQP2 niet tot expressie gebracht in deze buisvormige organoïden. Deze bevinding is in overeenstemming met eerdere onderzoeken die wijzen op verschillende beperkingen bij het ontwikkelen van structuren die zijn afgeleid van de ureterknop (UB) in vitro, waarbij de ontwikkeling van UB specifieke protocollen vereist, aangezien het tijdvenster voor de toevoeging van de specifieke inductor zeer beperkt is [ 6,22,23].

In het proces van het genereren van nierorganoïden uit iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen), wordt alle renale embryogenese in vitro gerecapituleerd, waarbij aanvankelijk de vorming van gecaviteerde sferoïden uit afzonderlijke cellen betrokken is [14]. We ontdekten inderdaad dat ongedifferentieerde iPSCss (geïnduceerde pluripotente stamcellen) van zowel ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte) als gezonde controle epiblastachtige sferoïde structuren vormden die morfologisch vergelijkbaar waren. Hoewel DNA-sequencing van de PKD1- en PKD2-genen in de huidige studie niet werd uitgevoerd, geven de huidige bevindingen aan dat het type mutatie dat door de patiënten werd gedragen geen invloed had op de typische epiblastmorfogenese. Verdere studies zijn nog nodig om de expressie van cruciale moleculen die betrokken zijn bij deze fase van embryonale ontwikkeling beter te evalueren.

Volgens het protocol ontwikkeld door Freedman et al. [14], we hebben waargenomen dat sferoïden 26 dagen na inductie van differentiatie differentiëren in buisvormige organoïden, en de timing was vergelijkbaar voor zowel ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte) als HC (Fig③). Desalniettemin merkten we enige variabiliteit op met betrekking tot het tijdschema van expressie en de niveaus van differentiatiemarkers. Aan de andere kant was de morfologie van de buisvormige structuren vergelijkbaar en vergelijkbaar tussen monsters van de ADPKD-patiënten en HC. Daarentegen, met behulp van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) afkomstig van nierbiopten van ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte), vond de groep van Cruz et al een grotere variabiliteit in het vermogen van deze cellen om organoïden te vormen [6].In Naast de enorme diversiteit aan mutaties die inherent zijn aan deze ziekte, kunnen deze verschillen in de efficiëntie van het verkrijgen van organoïden ook worden verklaard door de heterogene celtypen die aanwezig zijn in biopsiemonsters, in tegenstelling tot de erytroïde voorlopers, die een meer homogene celpopulatie vormen. Samengevat geven deze resultaten aan dat ondanks de variabiliteit en verschillen in de efficiëntie van verschillende iPSC-klonen om nierorganoïden te vormen, het verkrijgen van de laatste van ADPKD-patiënten (autosomaal dominante polycystische nierziekte) een uniek model kan vormen voor het bestuderen van de meerdere vormen van fenotypische manifestaties van deze ziekte. Bovendien is het belangrijk op te merken dat als er een aanzienlijke variabiliteit van mutaties is in de door ADPKD getroffen populatie, de patiëntspecifieke iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen), die volledig immuuncompatibel zijn, in de toekomst kunnen worden gebruikt voor individuele regeneratieve therapieën. , naast het mogelijk maken van de ontwikkeling van een in vitro-model om te verifiëren of de zeer vroege fenotypische manifestaties ook zo divers zijn als de klinische presentatie.

Niet-gestimuleerde organoïden afgeleid van HCor ADPKD (autosomaal dominante polycystische nierziekte) patiënten vormden niet spontaan cysten. De typische morfologie van cysten en de expressie van cystogenesemarkers waren in geen enkel monster detecteerbaar, zelfs de organoïde differentiatie in kweek verlengd tot 35 dagen. Er is aangetoond dat celproliferatie alleen geen cysten produceert [24]. Bovendien is een derde onafhankelijke gebeurtenis (bekend als derde treffer) vereist om de vorming en groei van cysten in vivo te versnellen [23]. Omgekeerd kwam cystevorming geïnduceerd door forskolin voor bij de organoïden van ADPKD-patiënten, maar niet bij die van HC. Merk op dat, hoewel aanwezig, cysten in een laag percentage werden waargenomen in de ADPKD-monsters, zelfs in de aanwezigheid van forskolin, zoals ook is waargenomen door Freedman et al. [14] in organoïden gevormd uit het CRISPR/Cas9-model van de ziekte van ADPKD. Er kunnen enkele hypothesen naar voren worden gebracht om de lage frequentie van cysten in het huidige model te verklaren. 1) Organoïden gekweekt in een 3D-suspensiemilieu vertoonden een veel hogere cystogenese-efficiëntie in vergelijking met hechtende organoïden [6], wat aangeeft dat de micro-omgeving direct betrokken is bij cystogenese.2) Het experimentele protocol dat in het huidige onderzoek werd gebruikt, vormde proximale tubulus-organoïden, maar niet distale delen van de nefron [23]. Hoewel alle nefronsegmenten cysten kunnen veroorzaken, inclusief proximale tubuli [25], lijken die afkomstig van verzamelkanalen blijkbaar groter en in hogere aantallen te zijn dan die van andere segmenten [26], 3) Ten slotte werd onlangs aangetoond dat de oorsprong van cysten kan verband houden met de aanwezigheid van meerdere PKD1-mutaties die de ernst van de ziekte bepalen en dat cystevorming in de verzamelbuisjes geassocieerd was met de ernst van de ziekte [27, 28].

Concluderend toonden de huidige bevindingen aan dat het haalbaar is om organoïden te genereren met driedimensionale structuren die vergelijkbaar zijn met de niervoorlopersarchitectuur met behulp van iPSC's (geïnduceerde pluripotente stamcellen) die opnieuw zijn geprogrammeerd uit erytroïde voorlopers die gemakkelijk konden worden geïsoleerd uit ADPKD (autosomaal dominante polycystische nierziekte) patiënten en dat deze organoïden cysten kunnen vormen onder forskolinestimulatie. Deze veelbelovende methodologie onthult een methode voor het vergroten van het begrip van de zeer vroege genetische, fenotypische en fysiologische stappen in cystevorming in de ADPKD-setting (autosomaal dominante polycystische nierziekte).

Referenties

1. Chebib FT, Torres VE: autosomaal dominante polycysteuze nierziekte: kerncurriculum 2016. AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:26530876

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatische mutatie in individuele levercysten ondersteunt een twee-hit model van cystogenese bij autosomaal dominante polycystische nierziekte.Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Somatische PKD2-mutaties in individuele nier- en levercysten ondersteunen een "twee-hit"-model van cystogenese bij type 2 autosomaal dominante polycystische nierziekte.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: een kritische ontwikkelingsschakelaar definieert de kinetiek van niercystevorming na verlies van Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: Nierbeschadiging is een derde hit die de snelle ontwikkeling van polycystische nierziekte bij volwassenen bevordert. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: Organoïde cystogenese onthult een cruciale rol van micro-omgeving bij menselijke polycystische nierziekte. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Inductie van pluripotente stamcellen uit fibroblastculturen. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al: Verminderd ciliair polycystine-2 in geïnduceerde pluripotente stamcellen van patiënten met polycystische nierziekte met PKD1-mutaties. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Afleiding van transgenvrije geïnduceerde pluripotente stamcellen uit een enkele druppel bloed. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen vrij van vector- en transgene sequenties.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/wetenschap. 1172482 PMID: 19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Differentiatiefase bepaalt het potentieel van hematopoëtische cellen voor herprogrammering tot geïnduceerde pluripotente stamcellen. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Efficiënte menselijke iPS-celafleiding door een niet-integrerend plasmide uit bloedcellen met unieke epigenetische en genexpressiesignaturen. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Pluripotente stamcel-afgeleide nierorganoïden: een in vivo-achtige in vitro-technologie. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https:/ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Modellering van nierziekte met CRISPR-mutante nierorganoïden afgeleid van menselijke pluripotente epiblastsferoïden. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Uniforme criteria voor ultrasonografische diagnose van ADPKD (autosomaal dominante polycystische nierziekte). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: Een ROCK-remmer maakt overleving van gedissocieerde menselijke embryonale stamcellen mogelijk. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nucleaire herprogrammering en pluripotentie.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: een zeer efficiënt systeem voor het genereren en bestuderen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Cel/ Stamcel. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420