KLRG1 markeert tumor-infiltrerende CD4 T-celsubsets geassocieerd met tumorprogressie en immunotherapierespons

Abstract

De huidige methoden voor het ontdekken van biomarkers en het identificeren van doelwitten in immuno-oncologie zijn gebaseerd op statische snapshots van tumorimmuniteit. Om de temporele aard van antitumor-immuunresponsen grondig te karakteriseren, hebben we een 34-parameterspectraalflowcytometriepanel ontwikkeld en high-throughput-analyses uitgevoerd in kritieke contexten.

We hebben gebruik gemaakt van twee verschillende preklinische modellen die kankerimmunoediting (NPKC1) en immuuncontrolepuntblokkade (ICB) -respons (MC38) recapituleren, en hebben meerdere relevante weefsels geprofileerd op en rond belangrijke buigpunten van immuunbewaking en ontsnapping en / of ICB-respons.

Doelwitten verwijzen naar belangrijke biomoleculen in cellen, zoals eiwitten, enzymen en receptoren. Doelherkenning is het gebruik van chemische en biologische methoden om de specifieke eigenschappen en functies van deze biomoleculen te identificeren voor toepassing bij de behandeling van ziekten en de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Immuniteit verwijst naar het vermogen van het lichaam om de invasie van vreemde ziekteverwekkers en de groei van endogene abnormale cellen te weerstaan. De kern van het immuunsysteem zijn immuuncellen en -moleculen, die nauwe banden en interacties hebben met hun doelwitten.

Bij de behandeling van ziekten en de ontwikkeling van geneesmiddelen is de relatie tussen doelidentificatie en immuniteit erg belangrijk. Het werkingsmechanisme van veel geneesmiddelen is bijvoorbeeld door middel van doelherkenning, het richten op specifieke eiwitten, enzymen, receptoren en andere moleculen, het beïnvloeden van hun functies en het reguleren van signaaltransductie, om therapeutische effecten te bereiken. Cellen en moleculen in het immuunsysteem kunnen ook het doelwit zijn van medicijnen. Geneesmiddelen tegen kanker bereiken bijvoorbeeld therapeutische effecten door de immuunrespons van kankercellen te beïnvloeden en celapoptose en proliferatie te reguleren.

Daarom kan bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en de klinische behandeling een uitgebreide overweging van doelidentificatie en immuniteitsfactoren leiden tot een effectievere ontwikkeling van geneesmiddelen en een verbeterd therapeutisch effect. Vanuit dit oogpunt moeten we de immuniteit verbeteren. Cistanche kan de immuniteit versterken. Cistanche is rijk aan een verscheidenheid aan antioxidanten, zoals vitamine C, vitamine C, carotenoïden, enz. Deze ingrediënten kunnen vrije radicalen wegvangen, oxidatieve stress verminderen en de immuniteit verbeteren. systeem weerstand.

Klik op cistanche tubulosa-extractpoeder

Door machinaal leren aangestuurde data-analyse onthulde een patroon van KLRG1-expressie dat op unieke wijze intratumorale effector CD4 T-celpopulaties identificeerde die constitutief associëren met tumorbelasting in tumormodellen en verloren gaan in tumoren die regressie ondergaan als reactie op ICB. Evenzo werd een Helios-KLRG1 plus subset van tumor-infiltrerende regulatoire T-cellen (Tregs) geassocieerd met tumorprogressie van immuunevenwicht tot ontsnapping en ging ook verloren in tumoren die op ICB reageerden.

Validatiestudies bevestigden KLRG1-handtekeningen in menselijke tumor-infiltrerende CD4 T-cellen geassocieerd met ziekteprogressie bij nierkanker. Deze bevindingen nomineren KLRG1 plus CD4 T-celpopulaties als subsets voor verder onderzoek naar kankerimmuniteit en demonstreren het nut van longitudinale spectrale stroomprofilering als een motor voor dynamische biomarker en / of doelontdekking.

Invoering

Immunotherapie is nu een pijler van de behandeling van kanker. Reacties op de meeste immunotherapeutische middelen blijven echter zeldzaam, beperkt tot een beperkt aantal tumortypes en moeilijk te voorspellen(1). Het verbeteren van responspercentages en het ontwikkelen van biomarkers die voorspellend zijn voor de respons zijn centrale doelen van het veld van tumorimmunologie, maar dit blijft een uitdaging.

Een groot aantal complexe meercellige interacties kan de uitkomst van een antitumor immuunrespons bij een bepaalde patiënt bepalen. Daarom is het gebruikelijk dat enkele biomarkers - of therapeutische modulatie van enkelvoudige routes - bij sommige, maar niet bij de meeste kankerpatiënten bruikbaar zijn.

Er zijn bijvoorbeeld drie immuungerelateerde biomarkers die momenteel op grote schaal klinisch worden gebruikt; (i) tumormutatielast (TMB), zoals direct gemeten of afgeleid via de aanwezigheid van invaliderende mutaties in DNA-reparatiemachines(2-4), (ii) PD-L1-expressie door immunohistochemie (IHC)(5), en (iii) reeds bestaande immuniteit zoals gemeten aan de hand van de aanwezigheid van CD8 T-cellen in en rondom tumoren, de zogenaamde Immunoscore(6).

Hoewel elk significant geassocieerd is met respons op immunotherapie in bepaalde contexten, blijven de gevoeligheid en specificiteit van deze voorspellers suboptimaal(7). Deze unimodale benaderingen slagen er waarschijnlijk niet in om de complexe mechanismen die ten grondslag liggen aan de antitumorimmuniteit volledig vast te leggen, inclusief de dynamische aard van dergelijke reacties die optreden in weefsels en in de loop van de tijd.

Als zodanig kan de toepassing van sterk gemultiplexte eencellige immuunprofileringsbenaderingen voor detectie van biomarkers en doeldetectie op een longitudinale manier over weefsels heen genuanceerde immuunfenotypes opleveren met een grotere voorspellende en translationele bruikbaarheid.

Hiertoe hebben we een 34-parameterspectraalflowcytometriepanel en hoogdimensionale data-analysepijplijn ontwikkeld om immuunfenotypes op eiwitniveau te onderzoeken die verband houden met verschillende fasen van de immunobewerkingscyclus van kanker, waaronder immuunontsnapping en tumoruitgroei, en immuuncontrolepunt blokkade (ICB) respons in preklinische modellen.

We hebben de met NPK-C1 en ICB behandelde MC38-modellen geprofileerd, waarbij we meerdere weefsels (tumor, drainerende versus niet-drainerende lymfeklieren en bloed) analyseerden over en rond belangrijke buigpunten in tumorprogressie. Dit vergemakkelijkte de diepgaande karakterisering van de dynamiek die ten grondslag ligt aan natuurlijke en ICB-geïnduceerde tumorregressie, overgang naar immuunevenwicht en daaropvolgende overgang van evenwicht naar ongecontroleerde tumorontsnapping. Validatiestudies in humane eencellige datasets van nierkanker bevestigden de translationele relevantie van deze bevindingen.

Materialen en methodes

Muizen. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J-muizen (5-6 weken oud) werden gekocht bij het Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Muizen waren 6-8 weken oud op het moment van gebruik. Alle dieren werden gehuisvest in strikte overeenstemming met de voorschriften van de NIH en de American Association of Laboratory Animal Care. Alle experimenten en procedures voor deze studie werden goedgekeurd door de Columbia University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Cel lijnen. De NPK-C1-cellijn (oorspronkelijk LM7304) werd geleverd door Dr. Cory AbateShen van Columbia University. Zie eerdere referenties voor meer details (8,9). NPK-C1-cellen werden gehandhaafd in R10, bestaande uit RPMI-medium (Corning; Corning, NY) aangevuld met 10 procent FBS (HyClone; Logan, UT), 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (Gibco; Gaithersburg, MD). MC38 coloncarcinoomcellen werden gekocht bij Kerafast en gekweekt in D10 bestaande uit DMEM (Corning; Corning, NY) aangevuld met 10 procent FBS, 100 U/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine (Gibco; Gaithersburg, MD).

Tumoruitdaging en therapie-injecties. NPK-C1-cellen bij 70-90 procent confluentie of MC38-cellen bij 50-75 procent confluentie werden geoogst met 0.05 procent trypsine (Gibco, Gaithersburg, MD), gewassen met PBS, geteld en geresuspendeerd bij 10x106 cellen/ml in ijskoude PBS. Op dag 0 werden muizen van 6-8 weken oud op de rechterflank geïmplanteerd met 1x106 NPK-C1- of MC38-cellen. Tumormetingen werden geregistreerd in X-, Y- en Z-dimensies (respectievelijk grootste diameter, kleinste diameter en grootste hoogte) elke 2-3 dagen met een digitale schuifmaat en het tumorvolume werd berekend door X*Y*Z te vermenigvuldigen. Anti-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,K) of Rat IgG2a isotype antilichaam (Bio X Cell; Lebanon, NH) werd verdund in steriele PBS en toegediend door middel van intraperitoneale (IP) injectie met 200 µg/ ml per muis op dag 3, 6, 9 en 12 na MC38-implantaties.

Weefsel oogsten. Na euthanasie bij muizen werd ~2{1}}0 µl bloed geïsoleerd via een hartpunctie met behulp van een met 0,2 procent heparine (StemCell Technologies; Vancouver, BC) gecoate injectienaald en op ijs geplaatst in buisjes met 10 µl 0,5M EDTA (Corning; Corning, NY). Tumor-drainerende en niet-drainerende lieslymfeklieren werden ontleed en in 48-well-platen met 150 µl R10-medium op ijs geplaatst.

Tumoren werden geoogst, samengevoegd en tot 50 mg tumor werd in blokjes gesneden en in X-Vivo 15-media (Lonza; Basel, Zwitserland) in Eppendorf-buisjes van 5 ml op ijs geplaatst. DNase (40 µl van een 20 mg/ml oplossing; Roche; Basel, Zwitserland) en Collagenase D (125 µl van een 40 mg/ml oplossing; Roche; Basel, Zwitserland) werden toegevoegd aan de tumormonsters vóór incubatie op een shaker bij 37°C gedurende 30 minuten. Digestreacties werden gedoofd door vortexen (30 seconden) en toevoeging van 5 ml R10-medium. Tumordigesten werden gefiltreerd door filters van 70 μm (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) en gepelleteerd. Bloedmonsters werden RBC gelyseerd met twee opeenvolgende incubaties van 2-minuten in 2 ml ACK-buffer (Quality Biological; Gaithersburg, MD) en geblust in R10 voordat ze werden gepelleteerd. Lymfeklieren werden fysiek gedesaggregeerd met een injectiespuit van 1 ml in de 48-well-plaat, waarna de suspensies werden gefilterd door 40-um-filters. Alle monsters werden voor kleuring in 96-well-platen met U-bodem geplaatst.

Flowcytometrie. Monsters werden gewassen met PBS. Dode cellen werden gekleurd door resuspensie in 100 µl PBS plus Live/Dead Fixable Blue kleurstof (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Deze en alle verdere kleurings- of fixatiestappen werden uitgevoerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een plaatschudder, beschermd tegen licht. Monsters werden 2x gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in FACS (PBS plus 3 procent FBS plus 1 mM EDTA plus 10 mM HEPES) aangevuld met TruStain FcX (1:50; BioLegend; San Diego, CA) en TruStain Monocyte Blocker (1:20; BioLegend; San Diego, CA) en op ijs geplaatst.

Oppervlakte-antilichamen werden bereid in optimale verdunningen (zie aanvullende tabel S1) in FACS aangevuld met Brilliant Stain Plus-buffer (BD; Franklin Lakes, NJ), en werden vervolgens toegevoegd aan monsters in een blokkerende oplossing. Na kleuring werden monsters 2x gewassen met FACS-buffer en gefixeerd in 100 µl FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit-buffer (eBioscience; San Diego, CA). Monsters werden tweemaal gewassen met 1X permeabilisatiebuffer (1X PW) en vervolgens gekleurd in 1X PW plus intracellulaire antilichamen. Monsters werden vervolgens tweemaal gewassen in 1X PW en vervolgens gefixeerd in 100 µl FluoroFix-buffer (BioLegend: San Diego, CA), tweemaal gewassen met FACS, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 200 µl FACS en afgesloten in de platen met 96 putjes voor acquisitie de volgende dag op een Cytek Aurora 5-lasercytometer.

Gelijktijdig gekleurde monsters van splenocyten werden gebruikt voor enkelvoudige vlekcontroles. Analyse en Statistieken. Longitudinale profileringsexperimenten werden eenmaal uitgevoerd voor MC38- en NPK-C1-modellen. Er werden in totaal n=10-25 muizen per tijdstip beoordeeld. Flowcytometriegegevens werden geanalyseerd in FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), en hoogdimensionale plug-in-algoritmen UMAP en FlowSOM werden gedownload van FlowJo Exchange. Tot 30.000 levende CD45 plus tumor-infiltrerende cellen en tot 15.000 levende CD45 plus bloed of LN-afgeleide cellen per monster werden aaneengeschakeld voor hoogdimensionale analyse.

Alle dimensionaliteitsreductie en clustering werden uitgevoerd in FlowJo. Statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism v9.3.1. Pearson-correlatie werd gebruikt om correlatiecoëfficiënten te genereren, en ongepaarde Student's T-tests met Welch's correctie werden gebruikt om clusterfrequenties tussen groepen te vergelijken. Eencellige analytische methoden zijn eerder beschreven(10,11).

Het KLRG1-regulon werd geëxtraheerd uit het consensus metaVIPER KLRG1-regulon van Obradovic, et al(11). Om de KLRG1-regulonsignatuur te berekenen, pasten we een willekeurig bosregressiemodel met regulon-genen als kenmerken en KLRG1 als doelwit, en berekenden vervolgens Gini-belangrijkheidsscores van regulon-genen om hun impact op KLRG1-expressie te bepalen. De KLRG1-regulonscore van elke cel werd gegeven door de gewogen som van expressiematen van alle regulon-genen in de cel met belangrijkheidsscores als gewichten.

For more information:1950477648nn@gmail.com