Kv1.3-remming verzwakt neuro-inflammatie door verstoring van microgliale calciumsignalering

ABSTRACT

In de afgelopen 5 jaar is aangetoond dat remmers van het kaliumkanaal KV1.3 neuro-inflammatie verminderen in knaagdiermodellen van ischemische beroerte, de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en traumatisch hersenletsel. Op systemisch niveau worden deze heilzame acties gemedieerd door een vermindering van microglia-activering en een onderdrukking van pro-inflammatoire cytokine- en stikstofmonoxideproductie.

De moleculaire mechanismen voor de onderdrukkende werking van KV1.3-blokkers op pro-inflammatoire microglia-functies waren echter niet bekend totdat onze groep onlangs aantoonde dat KV1.3-kanalen niet alleen de membraanpotentiaal reguleren, zoals zou worden verwacht van een voltage-gated kaliumkanaal , maar spelen ook een cruciale rol bij het in staat stellen van microglia om weerstand te bieden aan depolarisaties die worden geproduceerd door het gevaarsignaal ATP, waardoor de calciuminstroom via P2X4-receptoren wordt gereguleerd. We bespreken hier de rol van KV1.3 in microgliale signalering en laten zien dat, vergelijkbaar met hun rol in T-cellen, KV1.3-kanalen ook de door de winkel bediende calciuminstroom in microglia reguleren.

Kaliumkanaal KV1.3 is een ionkanaal dat veel tot expressie komt in immuuncellen, dat een belangrijke rol speelt bij de regulering van het celmembraanpotentieel, celmigratie en immuuncelfunctie. Recent onderzoek suggereert dat verbindingen die het kaliumkanaal KV1.3 remmen, de immuniteit van het lichaam kunnen helpen versterken.

Het reguleren van het immuunsysteem is een belangrijk onderdeel van het behoud van een goede gezondheid. Veel ziekten, zoals auto-immuunziekten, kanker en infectieziekten, leiden echter tot een disfunctioneel immuunsysteem. Daarom hebben onderzoekers gezocht naar manieren om de immuniteit te versterken. Recente studies suggereren dat remmers van het kaliumkanaal KV1.3 een veelbelovende optie kunnen zijn.

In immuuncellen reguleert het kaliumkanaal KV1.3 het membraanpotentieel, waardoor de celfunctie wordt beïnvloed. Uit de studie bleek dat het door remming van het kaliumkanaal KV1.3 mogelijk was om de migratie van T-cellen te verminderen en verder te voorkomen dat ze gezonde cellen aanvallen, waardoor het immuunsysteem wordt beschermd tegen onnodige vernietiging.

Bovendien hebben sommige experimenten aangetoond dat het remmen van het kaliumkanaal KV1.3 ook andere aspecten van het immuunsysteem kan bevorderen. Studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat door remming van dit kanaal de kwaliteit en kwantiteit van immuuncellen kan worden verbeterd, waardoor de weerstand van het lichaam tegen ziekteverwekkers en andere bedreigingen van buitenaf toeneemt. Daarom kan remming van het kaliumkanaal KV1.3 een effectieve manier zijn om de immuniteit te verbeteren.

Concluderend suggereert de huidige studie dat remming van het kaliumkanaal KV1.3 een veelbelovende benadering kan zijn om de functie van het immuunsysteem te verbeteren en de algehele immuniteit van het lichaam te vergroten. Maar hoewel deze bevindingen veelbelovend zijn, is verder onderzoek nodig om de veiligheid en haalbaarheid van het gebruik van deze aanpak te bepalen. Vanuit dit oogpunt moeten we onze immuniteit verbeteren. Cistanche kan de immuniteit aanzienlijk verbeteren. Vleesas bevat verschillende biologisch actieve ingrediënten, zoals polysacchariden, twee paddenstoelen en Huang Li, die het immuunsysteem kunnen stimuleren. verschillende soorten cellen, waardoor hun immuunactiviteit toeneemt.

Klik op gezondheidsvoordelen van cistanche

Invoering

Het spanningsafhankelijke kaliumkanaal KV1.3 werd oorspronkelijk beschreven in T-cellen [1] en werd vervolgens nagestreefd als doelwit voor de behandeling van T-cel-gemedieerde auto-immuunziekten zoals multiple sclerose, reumatoïde artritis en psoriasis [2–4]. Meer recentelijk is KV1.3 naar voren gekomen als een aantrekkelijk farmacologisch doelwit voor het verminderen van zogenaamde "neuro-inflammatie" door microglia-activering te moduleren. In zowel muizen- als rattenmodellen van ischemische beroerte is door ons en anderen aangetoond dat KV1.3-blokkers het infarctgebied verkleinen en de neurologische uitval verbeteren [5,6]. In transgene muismodellen van de ziekte van Alzheimer verminderde KV1.3-blokkade de cerebrale amyloïdebelasting, verhoogde neuronale plasticiteit van de hippocampus en verbeterde gedragsstoornissen [7].

Evenzo remde toediening van de kleine molecule KV1.3-blokker PAP-1 in meerdere diermodellen van de ziekte van Parkinson degeneratie van dopaminerge neuronen en verbeterde gedragsresultaten [8]. Van KV1.3-remming of genetische deletie is verder aangetoond dat het de pathologie van de witte stof verbetert na traumatisch hersenletsel [9], postoperatieve cognitieve achteruitgang [10] en door straling veroorzaakt hersenletsel [11]. In al deze diermodellen van neurologische ziekte werd verhoogde KV1.3-expressie waargenomen op pathologie-geassocieerde microglia en behandeling met KV1.3-blokkers resulteerde in verminderde microglia-activering en verlaagde inflammatoire cytokineniveaus in de hersenen van de dieren.

De ziekte-geassocieerde verhoogde KV1.3-expressie lijkt zich te vertalen naar mensen, aangezien sterke KV 1.3-expressie ook is gevonden in postmortale menselijke hersenen op microglia in infarctgebieden na een ischemische beroerte [5,12], op microglia rond amyloïde plaques bij de ziekte van Alzheimer [ 7,13], en op microglia in de prefrontale cortex en substantia nigra bij de ziekte van Parkinson [8]. Alles bij elkaar genomen suggereren deze bemoedigende bevindingen in menselijke en dierlijke modellen sterk microgliale KV1.3-kanalen als een therapeutisch doelwit voor het verminderen van schadelijke ontstekingsreacties in de hersenen. Maar hoe werken KV1.3-blokkers? Hoe vermindert het blokkeren van een voltage-gated kaliumkanaal in microglia, en vermoedelijk ook in de hersenen infiltrerende monocyt-afgeleide macrofagen, de inflammatoire cytokineproductie en door ontsteking gemedieerde weefselschade?

Effecten van KV1.3-blokkers op de microglia-functie

Van gekweekte neonatale microglia van muizen en ratten, evenals acuut geïsoleerde microglia van muizenhersenen of op weefsel geprinte microglia van rattenhersenen, is aangetoond dat ze KV1.3-stromen tot expressie brengen door patch-clamp van hele cellen die aanzienlijk toenemen na in vitro stimulatie of in vivo intracerebroventriculaire injectie met de TLR-4 ligand lipopolysaccharide (LPS) [14–18]. Stimulatie met de gram-negatieve celwandcomponent LPS wordt veel gebruikt om een ​​"klassiek" geactiveerde "M1--achtige" staat van microglia te induceren die algemene ontsteking simuleert die zou worden geassocieerd met een bacteriële infectie [19,20]. Op het gebied van neuro-immunologie zou LPS-gestimuleerde microglia idealiter M(LPS)-microglia moeten heten, gebaseerd op de stimulus die wordt gebruikt om polarisatie te induceren om het gebruik van de M1/M2-terminologie te vermijden, die wordt beschouwd als te vereenvoudigd [21], maar algemeen wordt gebruikt vanwege zijn therapeutische werking. aantrekkelijkheid.

Na stimulatie met LPS kan verhoogde KV1.3-expressie worden waargenomen op het mRNA-niveau en het eiwitniveau door middel van Western-blotting, immunohistochemie en verhoogde stroomdichtheid gemeten met patch-clamp van hele cellen [15-18]. Een vergelijkbare, maar iets minder intense toename in Kv1.3-expressie treedt op wanneer gekweekte neonatale microglia worden gestimuleerd met oligomeer amyloïde- (AO) of -synucleïne [7,8], twee eiwitten die verkeerd gevouwen en geaggregeerd zijn bij de ziekte van Alzheimer of Parkinson, en die vaak worden gebruikt om een ​​in vitro model te maken van microglia-responsen die verband houden met de betreffende ziekte.

In dit soort in-vitrosystemen vermindert KV1.3-remming of genetische deletie de expressie en productie van meerdere ontstekingsmediatoren, gemeten op 24- of 48-uur na microglia-activering. Ongeveer 20 jaar geleden rapporteerde het laboratorium van Lyanne Schlichter dat KV1.3-remmers door forbolester gestimuleerde respiratoire burst [22] en NO-productie in gekweekte neonatale microglia van ratten onderdrukken, waardoor microglia-gemedieerde neuronale doding in een transwell-kweeksysteem wordt verminderd [16].

In een recentere studie van ons laboratorium [17], waarin de effecten van KV1.3- en KCa3.1-blokkers werden vergeleken met de veelgebruikte microgliaremmer minocycline op differentieel gepolariseerde neonatale muismicroglia, zagen we dat Kv1.3-remming de expressie en productie verminderde. van de pro-inflammatoire cytokines IL-1 en TNF- na 24 en 28 uur en verhinderde opwaartse regulatie van de met ontsteking geassocieerde enzymen cyclooxygenase2 (COX-2) en induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS). Dit laatste effect was waarschijnlijk verantwoordelijk voor de verminderde NO-productie die werd waargenomen in microglia behandeld met KV1.3-remmers 24 en 48 uur na LPS-stimulatie. Vergelijkbaar met het eerdere werk, hebben we ook waargenomen dat KV1.3-remmers microglia-gemedieerde neuronale doding voorkomen in organotypische hippocampus-plakculturen 3 dagen nadat microglia waren geactiveerd ofwel gedurende 1-uur hypoxie/glycemie om ischemische beroerte te simuleren [5] of door behandeling met oligomeer amyloïde om activering van microglia bij AD te simuleren [7].

Naast het verminderen van door AO geïnduceerde activering van microglia, een fenomeen dat duidelijk kan worden aangetoond door microglia te kleuren op CD11b of Iba-1 en de fluorescentie-intensiteit te evalueren, is ook gevonden dat de KV1.3-remmer PAP-1 Een O2-geïnduceerde, microglia-gemedieerde verslechtering van langetermijnpotentiëring (LPT) in hippocampusplakjes en om A O2-geïnduceerde productie van IL-1, TNF- en NO in gekweekte muizenmicroglia te verminderen [7], zeer vergelijkbaar naar wat was gevonden voor KV1.3-remmers met LPS-gestimuleerde microglia [17,18]. In experimenten waarbij gekweekte neonatale muizenmicroglia van wildtype en KV1.3-/- muizen werden gestimuleerd met aggregaat-synucleïne (SynAgg), dat microglia activeert door binding aan de patroonherkenningsreceptoren TLR2 en CD36 [23], beide farmacologische KV1. 3-remming met PAP-1 en genetische deletie van het kanaal resulteerde in verminderde productie van IL-1, IL-6, IL-12 en TNF-productie en verhinderde opregulatie van NLRP3-inflammasoomeiwit op 24 uur na microglia-stimulatie [8]. Omgekeerd verhoogde overexpressie van KV 1.3 in een microgliale cellijn de door SynAgg geïnduceerde expressie of secretie van IL-1, TNF-, IL-6 en IL-12 24 uur na stimulatie [8].

Verschillende onderzoeken door andere groepen bevestigden dat KV1.3-blokkers pro-inflammatoire microglia-functies verminderen bij gebruik van vergelijkbare stimuli of stimuli die geassocieerd zijn met andere inflammatoire pathologieën. In gekweekte rattenmicroglia geactiveerd met het HIV Tat-eiwit of met glycoproteïne 120 (gp120) om met HIV1-geassocieerde neurocognitieve stoornis te simuleren, bleek KV1.3-remming of -knockdown met siRNA bijvoorbeeld IL te verminderen-1 , TNF- en NO-productie en onderdrukte neurotoxiciteit [24,25]. Met behulp van een model van ischemische beroerte en zuurstof/glucose deprivatie van gekweekte microglia Ma et al. meldde dat KV1.3-remming het microgliale fenotype verschoof van een pro-inflammatoire M1-achtige naar een M{16}}achtige reactie en verminderde NLRP3-inflammasoomactivering [5,6], vergelijkbaar met de hierboven beschreven onderzoeken in modellen van de ziekte van Parkinson [8].

Met behulp van vers geïsoleerde CD11b plus-cellen, die bestaan ​​uit zowel CZS-infiltrerende macrofagen als hersenresidente microglia uit de hersenen van muizen die systemisch waren behandeld met LPS in aanwezigheid en afwezigheid van het KV1.3-blokkerende peptide ShK-223, Rangaraju et al. bevestigde dat KV 1.3-remming de expressie van inflammatoire cytokines zoals IL-1 vermindert, maar toonde aan dat KV1.3-remming ook de expressie van TAP1 verminderde en opwaartse regulatie van EHD1 in CD11b plus CD45low microglia verhinderde, zoals gemeten met flowcytometrie [26]. Zowel TAP1 als EDH1 zijn eiwitten die betrokken zijn bij MHC klasse-I-assemblage en transport naar het celoppervlak. De auteurs onderzochten daarom vervolgens het effect van ShK-223-behandeling op MHC-klasse-1-expressie op acuut geïsoleerde microglia, en veronderstelden op basis van verminderde MHC-expressie dat LPS-geïnduceerde toenames in het antigeenpresenterende vermogen van microglia zijn KV 1.3-afhankelijke processen, wat suggereert dat KV1.3-remming de presentatie van antigeen aan CD8 plus cytotoxische T-cellen zou kunnen verminderen.

In een daaropvolgende gewogen co-expressie netwerkanalyse toegepast op microgliale transcriptomische datasets van muismodellen met neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten, identificeerde dezelfde groep KV1.3 als onderdeel van een pro-inflammatoire genesignatuur die ook Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFKB, Stat1 en RelA [27]. KV1.3-blokkade met ShK-223 zou deze pro-inflammatoire signatuur kunnen verschuiven naar een signatuur met verhoogde expressie van ontstekingsremmende genen in ziekte-geassocieerde microglia. Wat in deze context interessant is, is dat in andere onderzoeken is gemeld dat Kv1.3-remmers de migratie van gekweekte microglia gestimuleerd met de ontstekingsremmende cytokines IL-4 en IL-10 verder verhogen [28] en om de microgliale fagocytose van microbeads niet te beïnvloeden [26] of zelfs de fagocytose van amyloïde te verhogen [7].

Alles bij elkaar genomen is er dus voldoende bewijs dat microglia KV1.3 tot expressie brengen en dat KV1.3-blokkers pro-inflammatoire, neurotoxische microglia-functies onderdrukken en microglia zelfs kunnen verschuiven naar een meer neuroprotectief fenotype. We hebben ons hier vooral geconcentreerd op het samenvatten van gegevens die zijn verkregen met gekweekte microgliale of slice-culturen, omdat er in deze reductionistische systemen geen twijfel over bestaat dat knock-out, knockdown of farmacologische blokkade zijn effect rechtstreeks uitoefent door remming van microgliale KV1.3-kanalen en niet indirect door het beïnvloeden KV1.3-kanalen in T-cellen, B-cellen, dendritische cellen of monocyten, die allemaal KV1.3 tot expressie brengen [29], en dus zouden kunnen bijdragen aan de in vivo effecten van KV1.3-blokkers of bevindingen gedaan met KV1.3-/- muizen. We willen er hier echter op wijzen dat naast talrijke onderzoeken die KV1.3-expressie op microglia bij knaagdieren en mensen door immunohistochemie aantonen, het Kettenmann-laboratorium en onze groep herhaaldelijk hebben aangetoond dat verhoogde KV1.3-expressie op geactiveerde microglia niet alleen een weefselkweekfenomeen en dat Kv1.3-stromen kunnen worden vastgelegd van microglia in acute plakjes [30,31] en van acuut geïsoleerde microglia uit de hersenen van 5xFAD-muizen [7] of uit het infarctgebied na occlusie van de middenhersenslagader [5, 12], een model voor ischemische beroerte.

Signaalroutes beïnvloed door KV1.3-remming of modulerende Kv1.3-expressie

Studies die onderzoek doen naar signaalroutes (figuur 1) die worden beïnvloed door KV1.3-blokkers om deze gunstige verminderingen van pro-inflammatoire microglia-functies 24 of 48 uur later te produceren, hebben enigszins tegenstrijdige resultaten opgeleverd, wat suggereert dat de effecten van KV1.3-blokkers afhankelijk zijn op de stimulus en misschien de soort. Terwijl Fordyce et al. rapporteerden dat KV1.3-blokkers geen invloed hebben op p38MAPK-fosforylering in met LPS behandelde neonatale microglia van ratten [16], verschillende andere studies met muis-microglia hebben aangetoond dat KV1.3-blokkers de p38MAPK-fosforylering sterk verminderen, evenals activering van NF-KB na stimulatie met LPS, AO, SynAgg of HIV-1 glycoproteïne 120 [7,8,24]. In de microgliale cellijn is ook aangetoond dat BV2 KV1.3 de S727-fosforylering van STAT1 reguleert [26]. Interessant is dat of KV1.3-blokkers NFAT-translocatie remmen, een van de best bestudeerde effecten van KV1.3-blokkers in T-cellen [2,32,33] tot nu toe niet is onderzocht in microglia.

De toename van KV1.3-expressie na stimulatie van microglia met LPS, AO of SynAgg lijkt veel van dezelfde signaalcascades te omvatten die worden beïnvloed door KV1.3-remming, en KV1.3-blokkers voorkomen typisch toename van Kv1.3-expressie. De KV1.3-promoter bevat meerdere NF-KB- en SP1-bindingsplaatsen en remmers van NF-KB of p38MAPK verminderen onafhankelijk door SynAgg gestimuleerde Kv1.3-upregulatie in microglia [8], wat aantoont dat zowel de p38MAPK- als de klassieke NF-KB-routes mediëren de transcriptionele regulatie van KV1.3 (Figuur 1). Kinase Fyn van de Src-familie werkt stroomopwaarts van de NF-KB-transcriptiefactor door de nucleaire translocatie van zijn component p65 te reguleren [34] en door de PKC-isovorm PKCδ te fosforyleren. Sarkar et al. meldde dat Fyn-knock-out zowel door LPS als door SynAgg geïnduceerde toenames in KV1.3-stroomdichtheid in gekweekte microglia vermindert, een effect dat kan worden nagebootst door behandeling van microglia met de Fyn-remmer saracatinib of door een tekort aan PKCδ, wat suggereert dat de Fyn / PKCδ-kinasesignalering cascade is betrokken bij het mediëren van opwaartse regulatie van KV1.3 als reactie op ontstekingsstimuli [8]. Zoals aangetoond in een Duolink-proximity-ligatietest, heeft Fyn een directe interactie met Kv1.3 en fosforyleert het kanaal op Y135 om zijn activiteit te verhogen.

Kv1.3 reguleert membraanpotentiaal en gaat depolarisatie tegen'

Ondanks de hierboven beschreven goed gedocumenteerde verbeterende effecten van KV1.3-blokkers op neuro-inflammatie in vivo en op microgliale signaleringscascades en inflammatoire mediator-expressie en secretie in vitro, waren de fundamentele moleculaire mechanismen van hoe KV1.3-blokkers microgliale functies beïnvloeden lange tijd onduidelijk. Veel onderzoekers, inclusief ons laboratorium, gingen er gewoon van uit dat KV1.3 dezelfde functie vervulde in microglia die het vervulde in T-cellen, namelijk het reguleren van membraanpotentiaal en calciuminstroom [29,32,33].

In T-cellen leidt KV1.3-remming tot membraandepolarisatie en vermindert het de calciuminstroom via door calciumafgifte geactiveerde calciumkanalen (CRAC) na stimulatie van de T-celreceptor [33,35,36]. Calciuminstroom via CRAC-kanalen is van cruciaal belang voor defosforylering en daaropvolgende nucleaire translocatie van de calcium/calmoduline-afhankelijke transcriptiefactor NFAT [29], die de transcriptie van het cytokine IL-2 [29,33] triggert. IL-2 wordt bij synthese vrijgemaakt uit geactiveerde T-cellen en stimuleert de klonale expansie van T-cellen op autocriene en paracriene wijze. Door de neutraliserende kaliumuitstroom te remmen die nodig is om de calciuminstroom via CRAC-kanalen in stand te houden, verstoren KV1.3-blokkers de activering van T-cellen, voorkomen ze NFAT-defosforylering en nucleaire translocatie [32] wat leidt tot verminderde T-celproliferatie en verminderde inflammatoire cytokineproductie en secretie na 48 uur [5,33,35,36].

Het was echter nog nooit getest in microglia, die in tegenstelling tot T-cellen ook de inwaartse gelijkrichter Kir2.1 [17,37,38] en het kaliumkanaal met twee poriën THIK-1 (K2P 13.1) [39] tot expressie brengen, of KV1.3-blokkers dezelfde moleculaire effecten zouden hebben of dat de rol van KV1.3 werd overgenomen door deze andere kaliumkanalen. In een recente studie heeft onze groep deze vraag dienovereenkomstig aangepakt door eerst de fundamentele betekenis van KV1.3 opnieuw te onderzoeken voor het in stand houden van het rustmembraanpotentieel en het weerstaan ​​van depolarisatie [40]. Zoals verwacht verlaagde overexpressie van KV1.3 in CHO-cellen het typisch zeer gedepolariseerde rustmembraanpotentiaal van deze cellen van −20 mV naar −50 mV, terwijl KV1.3-remming met ShK-223 gedepolariseerde microglia, die inherent een meer gehyperpolariseerd rustmembraanpotentieel, dat in onze handen gemiddeld ongeveer −90 mV was in ongedifferentieerde microglia die voornamelijk Kir2.1 tot expressie brachten en ongeveer −65 mV in door LPS gestimuleerde microglia die hogere KV1.3 en lagere Kir2.1 stroomdichtheden tot expressie brachten [40].

Hoewel KV1.3 dus zeker bijdraagt ​​aan het reguleren van het rustmembraanpotentieel in microglia (Figuur 2), geloven wij dat de belangrijkere rol ervan, en de reden waarom Kv1.3-expressie toeneemt in geactiveerde microglia, het vermogen van het kanaal is om extreme en langdurige membraandepolarisatie die mogelijk een negatieve invloed kan hebben op de gezondheid en fysiologie van microglia, zoals blijkt uit huidige injectie-experimenten. Hoewel huidige injecties van 25 pA niet in staat zijn om KV 1.3 te depolariseren die microglia tot expressie brengt boven -30 mV in de afwezigheid van blokkers, depolariseren microglia die zijn voorbehandeld met KV 1.3-blokkers tot potentialen van plus 50 mV als reactie op dezelfde 25 pA stroominjecties [40] , wat suggereert dat KV1.3 het membraanpotentiaal dicht bij het activeringsdrempelpotentieel van het kanaal kan "klemmen" om overmatige membraandepolarisaties te voorkomen (figuur 2).

De situatie in de microgliale fysiologie waar deze capaciteit belangrijk is, is wanneer microglia worden blootgesteld aan extracellulair ATP, een gevaarsignaal dat concentraties in het hoge micromolaire bereik kan bereiken als gevolg van het vrijkomen van cytosolisch ATP uit beschadigde neuronen of ATP-bevattende synaptische blaasjes [41], die P2X-receptorkanalen activeren, wat leidt tot intense depolarisaties [42]. In onze eigen handen toonden stroomklemexperimenten uitgevoerd op ongedifferentieerde en LPS-gestimuleerde microglia aan dat acute blootstelling aan 100 μM ATP, die van de P2X-receptoren tot expressie gebracht in microglia voornamelijk P2X4 activeert, leidt tot meer uitgesproken depolarisaties in ongedifferentieerde microglia, ondanks hun meer uitgesproken depolarisaties in ongedifferentieerde microglia. gehyperpolariseerd rustmembraanpotentieel dan in KV1.3high LPS-gestimuleerde microglia, die niet depolariseerden boven -40 mV. KV1.3-blokkers verminderden dit vermogen om ATP-geïnduceerde depolarisaties te weerstaan ​​en microglia gedepolariseerd in hun aanwezigheid [40].

KV1.3 moduleert P2X4-receptor-gemedieerde calciuminstroom in microglia

Calciumbeeldvormingsexperimenten onthulden dat dit vermogen van KV1.3-kanalen om weerstand te bieden aan ATP-geïnduceerde P2X{4}}-gemedieerde depolarisaties Ca2 verbetert plus toegang tot microglia via P2X4-receptoren gestimuleerd met 100 μM ATP [40]. We hebben bijvoorbeeld waargenomen dat de KV1.3-blokkers ShK-223 en PAP-1 ATP-geïnduceerde Ca2 plus instroom door P2X4-receptoren in LPS-gedifferentieerde microglia verminderden die hoge KV1.3-stroomdichtheden tot expressie brengen, veel meer sterker dan in niet-gestimuleerde microglia, hoewel LPS-stimulatie de expressie van de P2X4-receptor in gekweekte microglia neerwaarts reguleert. KV1.3-blokkade daarentegen had geen effect op door ATP geïnduceerde calciumtransiënten in door IL-4 gestimuleerde microglia, die zeer lage niveaus van KV1.3 tot expressie brengen. Interessant is dat terwijl LPS ook KV1.3 verhoogt en P2X4-expressie op microglia in vivo vermindert, zowel KV1.3- als P2X4-expressie parallel toeneemt in de setting van ischemische beroerte, zoals aangetoond door ons laboratorium op acuut geïsoleerde microglia van de geïnfarceerde hersenhelft van muizen onderworpen aan ischemische beroerte en door andere groepen op knaagdier- en menselijke microglia door immunohistochemie of qPCR [5,12,43-46]. Dit suggereert dat na een ischemische beroerte KV1.3 mogelijk de meer complexe purinerge microgliale calciumsignalering geïnitieerd door het gevaarsignaal ATP sterker reguleert dan in vitro. ATP en ander neuronaal afval in het infarctgebied van de hersenen activeren microglia, die vervolgens binnen 24 tot 72 uur continu meer ontstekingsmediatoren produceren en vrijgeven en zo meer neuronen in de halfschaduw beschadigen en doden, wat leidt tot een ontstekingsuitbreiding van het infarct.

De verhoogde KV1.3-expressie die wordt waargenomen op microglia in de infarctgrens binnen 2-5 dagen [5] stelt vermoedelijk geactiveerde microglia in staat om sterkere calciumsignalen te ondersteunen door het toegenomen aantal P2X4-receptoren en zo meer ontstekingsmediatoren te produceren, waardoor meer neuronen worden beschadigd. en meer microglia activeren. Deze hypothese zou in overeenstemming zijn met de bevinding dat de KV1.3-blokker PAP-1 microglia-activering en hersenniveaus van IL-1 en IFN- verminderde, wat leidde tot ongeveer 40 procent kleinere infarctgebieden en verbeterde neurologische uitval scores in zowel muizen- als rattenmodellen van ischemische beroerte [5]. Door microglia te depolariseren, verminderen Kv1.3-blokkers de calciuminstroom via P2X4-receptoren die worden geactiveerd door ATP dat vrijkomt uit beschadigde neuronen en dempen zo verdere calciumafhankelijke activering van het NLRP3-ontstekingsmasker, NF-KB en andere transcriptiefactoren die leiden tot verminderde productie van ontstekingsmediatoren (figuur 1) en verminderde pathologie.

Welke andere calciuminstroomroutes in microglia worden gereguleerd door KV1.3?

Hoewel KV1.3-blokkade de door ATP geïnduceerde calciuminstroom door P2X4-receptoren duidelijk verminderde [40] en dus een belangrijke regulator vormt van deze calciuminstroomroute in microglia (Figuur 2), is dit niet de enige KV1.3 of ATP-afhankelijke calciumsignalering. proces in microglia. Naast P2X-receptorkanalen brengen microglia ook metabotrope P2Y-purinerge receptoren tot expressie die na activering door ATP of UTP calciumafgifte uit interne voorraden kunnen induceren [47] en store-operated Ca2 plus entry (SOCE) kunnen activeren na uitputting van de relatief kleine intracellulaire calciumvoorraden. in microglia [38]. Het is daarom zeker mogelijk dat extra SOCE heeft bijgedragen aan de ATP-geïnduceerde Ca2 plus-signalen die we hadden afgebeeld en dat sommige van de KV1.3-blokkerende effecten werden gemedieerd door extra SOCE te verminderen.

Dit is een zeer waarschijnlijke hypothese aangezien het "klassieke" moleculaire mechanisme voor KV1.3-blokkers in T-cellen de reductie van SOCE via CRAC-kanalen is na activering van de T-celreceptor en vervolgens verminderde transcriptiefactoractivering en cytokineproductie en -afgifte [29,33, 36,48]. Van microglia van ratten en muizen is herhaaldelijk gemeld dat ze stromingen vertonen met biofysische eigenschappen die typisch zijn voor CRAC-stromen [49,50] en dat ze de moleculaire componenten van CRAC-kanalen, Orai en STIM tot expressie brengen [51,52]. Er is verder bewijs dat genetische deletie van Orai1, STIM1 en STIM2 de CRAC-stroom en/of SOCE vermindert en migratie en fagocytose remt in microglia van gekweekte muizen [52], terwijl de kleine molecule CRAC-kanaalblokker CM-EX-137 onlangs is gemeld dat het de activering van microglia en de grootte van de laesie vermindert in een muismodel van traumatisch hersenletsel [53].

Blokkering van KV1.3-kanalen verzwakt de door de winkel bediende calciuminvoer in door LPS gestimuleerde microglia

Als een vervolgexperiment op ons vorige artikel over de rol van KV1.3 bij het reguleren van door P2X4 gemedieerde calciuminstroom, hebben we hier specifiek de vraag gesteld of de KV1.3-blokker ShK-223 ook SOCE in LPS-gedifferentieerde microglia zou verminderen , dezelfde stimulatieconditie, waar we de hoogste KV1.3-stroomdichtheden en de grootste effecten van KV1.3-remming op ATP-geïnduceerde calciumsignalering hadden waargenomen [40]. Met behulp van de ratiometrische calciumindicator Fura-2 om veranderingen in de vrije intracellulaire calciumconcentratie ([Ca2 plus ]i) bij te houden, ontdekten we dat LPS-gedifferentieerde microglia een rustcytosolische calciumconcentratie [Ca2 plus] I hadden die varieerde tussen 60 nM en 370 nM, gemiddeld 150 ± 8,8 nM (n=50; figuur 3a,c,g), wat consistent is met een eerder rapport [54]. Om SOCE op te wekken, werden de intracellulaire calciumvoorraden eerst uitgeput met thapsigargin (Tg), een blokker van het endoplasmatisch reticulum Ca2 plus -ATPase, aangebracht in een nominaal Ca2 plus-vrije badoplossing.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) asynchrone verhogingen in [Ca2 plus ] I als gevolg van passieve calciummobilisatie uit voorraden. De hertoevoeging van calcium aan de badoplossing veroorzaakte een snelle verhoging van [Ca2 plus] I boven de rustniveaus veroorzaakt door SOCE. De omvang van de SOCE-geïnduceerde [Ca2 plus] I transiënten ("piek SOCE") gemeten als het verschil tussen [Ca2 plus] I niveau in de Ca2 plus -vrije badoplossing en maximale [Ca2 plus] I verhoging na toevoeging van calcium varieerde significant tussen individuele cellen met een piek-SOCE-verdeling met een maximum van 120 nM en een staart tot 1800 nM (Figuur 1b). Deze heterogeniteit in de sterkte van SOCE wordt waarschijnlijk veroorzaakt door variaties in het rustmembraanpotentieel, dat de drijvende kracht vormt voor het binnendringen van calcium tijdens SOCE. Het rustmembraanpotentieel van LPS-gedifferentieerde microglia bleek te variëren tussen -90 mV en -40 mV in individuele cellen [40,55] en zou dus de waargenomen verschillen in SOCE kunnen verklaren.

Een eerdere studie rapporteerde dat verhoging van [Ca2 plus] I in rust geassocieerd was met een verminderd vermogen van externe stimuli zoals de P2Y-receptoragonist UTP of complementfactor 5a om [Ca2 plus] I-transiënten op te wekken in LPS-geactiveerde microglia [54]. Omdat in onze studie zowel [Ca2 plus ]i-niveaus in rust als piek-SOCE-waarden varieerden tussen individuele cellen, hebben we onderzocht of variatie in [Ca2 plus ]i in rust de heterogeniteit in piek-SOCE-waarden kan verklaren. Het uitzetten van piek-SOCE-waarden versus rustende [Ca2 plus] I, onthulde een positieve correlatie tussen piek-SOCE en rustende [Ca2 plus] I (Figuur 3c). Toen we de gegevens opsplitsten in twee groepen met een afkapwaarde van 600 nM voor piek-SOCE, waren de relaties tussen rustende [Ca2 plus ]I en piek-SOCE in elke groep sterker dan in de hele populatie, wat wijst op de aanwezigheid van ten minste twee cellen. populaties, die verschillen in zowel de grootte van de SOCE als de sterkte van de correlatie tussen rustende [Ca2 plus] I en piek-SOCE. Dus, binnen de populatie van met LPS behandelde cellen, is een verhoging van [Ca2 plus ]i in rust niet causaal gekoppeld aan het verminderde vermogen van geactiveerde microglia om te reageren op externe prikkels met een [Ca2 plus] I voorbijgaande aard, zoals eerder werd gesuggereerd. door Hofman et al. Onze gegevens suggereren dat een gemeenschappelijke invloed, zoals het niveau van membraanpotentiaal, dat wordt gecontroleerd door verschillende kanalen, waaronder KV1.3, Kir2.1 en THIK{21}}, verantwoordelijk kan zijn voor de positieve correlatie tussen rust [Ca2 plus ] I en piek SOCE waargenomen in onze studie. Overexpressie of functionele opregulatie van hyperpolariserende kanalen zou bijvoorbeeld het membraan kunnen hyperpolariseren en de drijvende kracht kunnen vergroten voor zowel calciuminvoer via constitutief actieve calcium-permeabele kanalen zoals metabolisch geactiveerde transiënte receptorpotentiaal (TRP) -kanalen en door de winkel bediende kanalen die worden geactiveerd na uitputting van de winkel. zoals CRAC-kanalen.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. De specifieke kenmerken van de cellen met hoge en lage piek-SOCE moeten nog worden bepaald.

Onder fysiologische omstandigheden kan SOCE vervolgens worden geactiveerd om uitputting op te slaan na activering van aan G-eiwit gekoppelde P2Y-receptoren en draagt ​​het bij aan de gecombineerde [Ca2 plus] I-verhoging tijdens activering van P2Y- en P2X-receptoren die worden opgewekt door gewone purinerge agonisten, zoals ATP. De omvang van de SOCE varieert aanzienlijk tussen LPS-gedifferentieerde cellen, wat een functie kan zijn van de unieke combinatie van differentiële expressie van door de winkel bediende kanalen en kanalen die het membraanpotentieel regelen, zoals KV1.3. Verlaging van piek-SOCE door ShK-223 geeft aan dat KV1.3-kanalen krachtige regulatoren van SOCE zijn en een bijkomend mechanisme aan het licht brengen waardoor KV1.3-blokkers calciumsignalering en daaropvolgende functionele reacties (bijv. cytokineproductie) verzwakken na calciumafhankelijke transcriptie factoractivering in microglia.

Conclusies

Hoewel het zeker een uitdaging is om de effecten van de bijdrage aan de cellen van het perifere immuunsysteem, met name op geheugen-T-cellen en van monocyten afgeleide macrofagen, te bepalen aan de gunstige effecten van KV1.3-blokkers op ontstekingen in het CZS, is het duidelijk dat KV1.3 een belangrijke rol speelt bij het reguleren van het membraanpotentieel, het voorkomen van depolarisatie en het beheersen van calciumsignaleringsgebeurtenissen die vervolgens leiden tot activering van microglia en de productie van ontstekingsmediatoren. We zouden willen suggereren dat het vanuit een therapeutisch perspectief waarschijnlijk wenselijk is om KV1.3 in meerdere celtypen van het immuunsysteem te remmen. Het zou echter intellectueel zeer bevredigend en nuttig zijn voor de ontwikkeling van therapieën om te verduidelijken wat het belangrijkste cellulaire doelwit van KV1.3-remmers is en of therapieën hersenpenetrerend moeten zijn om optimale verbeterende effecten bij CZS-ziekten uit te oefenen. Deze vragen zouden idealiter farmacologisch moeten worden aangepakt door kleine moleculen die de hersenen binnendringen te testen naast perifere beperkte peptide-KV1.3-remmers of anti-KV1.3-antilichamen [58,59] in diermodellen van de ziekte van Alzheimer en Parkinson. Het zou verder zeer informatief zijn om de effecten van voorwaardelijke KV1.3-deletie in microglia, van monocyten afgeleide macrofagen en verschillende subsets van T-cellen te vergelijken met de effecten van medicamenteuze behandeling om een ​​meer gedetailleerd begrip te krijgen van de rol van KV1.3 bij neuro-inflammatie. en het cellulaire doelwit van KV1.3-remmers. We zijn echter van mening dat op cellulair niveau de fundamentele rol van KV1.3 altijd zal zijn wat eerst werd beschreven in T-cellen, namelijk regulatie van membraanpotentiaal en calciuminstroom en daaropvolgende activering van calciumafhankelijke transcriptiefactoren. Wat in dit opzicht soms niet genoeg benadrukt wordt, is waarschijnlijk dat de biofysische eigenschappen van KV1.3, zoals de halve activeringsspanning en de relatief langzame inactivatie [60,61], het kanaal perfect "kwalificeren" om membraandepolarisaties te weerstaan ​​en zo KV1 mogelijk te maken. .3 om niet alleen SOCE te reguleren, zoals 30 jaar geleden werd beschreven in T-cellen, maar ook P2X-receptor-gemedieerde calciuminstroom.

Openbaarmakingsverklaring

De auteurs hebben geen potentiële belangenverstrengeling gemeld.

Financiering

Dit werk werd ondersteund door een National Institute of Neurological Disease and Stroke award NS100294 (naar HW) en een UC Davis School of Medicine Research Partnership Grant (naar AFF).

Referenties

[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S, et al. Spanningsafhankelijke K-plus-kanalen in menselijke T-lymfocyten: een rol bij mitogenese? Natuur. 1984; 307 (5950): 465-468.

[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE, et al. Kv1.3-kanalen zijn een therapeutisch doelwit voor door T-cellen gemedieerde auto-immuunziekten. Proc Natl Acad Sci VS. 2006; 103 (46): 17414-17419.

[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ, et al. Duurzame farmacologische reacties van het peptide ShK-186, een specifieke Kv1.3-kanaalremmer die T-celmediatoren van auto-immuunziekten onderdrukt. J Pharmacol Exp Ther. 2012;342(3):642-653.

[4] Chandy KG, Norton RS. Peptideblokkers van Kv1.3-kanalen in T-cellen als therapieën voor auto-immuunziekten. Curr Opin Chem Biol. 2017;38:97–107.

[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Remming van het kaliumkanaal Kv1.3 vermindert infarct en ontsteking bij ischemische beroerte. Ann Clin Vertaald Neurol. 2018;5(2):147-161.

[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN, et al. Kv1.3-kanaalblokkade verlicht cerebrale ischemie/reperfusieschade door M1/M2-fenotypes opnieuw vorm te geven en de activering van NLRP3-ontstekingsmasker in microglia in gevaar te brengen. Exp Neurol. 2020;332:113399.

[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J, et al. Kv1.3-remming als een potentiële op microglia gerichte therapie voor de ziekte van Alzheimer: preklinisch proof of concept. Brein. 2018; 141 (2): 596-612.

[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E, et al. Kv1.3 moduleert neuro-inflammatie en neurodegeneratie bij de ziekte van Parkinson. J Clin Invest. 2020;130 (8):4195-4212.

[9] Reeves TM, Trimmer PA, Colley BS, et al. Gericht op Kv1.3-kanalen om wittestofpathologie na traumatisch hersenletsel te verminderen. Exp Neurol. 2016;283(PtA):188-203.

[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K, et al. Het blokkeren van Kv1.3-kaliumkanalen voorkomt postoperatieve neuro-inflammatie en cognitieve achteruitgang zonder de wondgenezing bij muizen te belemmeren. Broer J Anaesth. 2020;125 (3):298-307.

[11] Peng Y, Lu K, Li Z, et al. Blokkade van Kv1.3-kanalen verbetert door straling veroorzaakt hersenletsel. Neuro Oncol. 2014;16(4):528-539.

[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, et al. Het kaliumkanaal KCa3.1 vormt een farmacologisch doelwit voor neuro-inflammatie geassocieerd met ischemie/reperfusieberoerte. J Cereb Bloedstroom Metab. 2016;36 (12):2146-2161.

[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW, et al. Kaliumkanaal Kv1.3 wordt in hoge mate tot expressie gebracht door microglia bij de ziekte van Alzheimer bij de mens. J Alzheimer Dis. 2015;44 (3):797-808.

[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Ontstekingsstimuli induceren een nieuwe K plus uitgaande stroom in microglia van gekweekte ratten. Neurosci Lett. 1992; 147 (2): 171-174.

[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Een Kv1.5 naar Kv1.3 switch in endogene hippocampale microglia en een rol in proliferatie. J Neurosci. 1999;19(24):10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, et al. Microglia Kv1.3-kanalen dragen bij aan hun vermogen om neuronen te doden. J Neurosci. 2005;25(31):7139-7149.

[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M, et al. Differentiële Kv1.3-, KCa3.1- en Kir2.1-expressie in "klassiek" en "alternatief" geactiveerde microglia. Glia. 2017;65(1):106–121.

For more information:1950477648nn@gmail.com