Lage concentraties van paraquat induceren vroege activering van extracellulair signaal-gereguleerd kinase 1/2, proteïnekinase B en C-Jun N-terminaal kinase 1/2 Pathways: rol van C-Jun N-terminal kinase in door paraquat geïnduceerde celdood

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ en Jose´ M. Fuentes

Abstract:

Paraquat is een herbicide met een potentieel risico op het induceren van parkinsonisme vanwege de aangetoonde neurotoxiciteit en de sterke structurele gelijkenis met 1-methyl-4-fenylpyridinium (MPP plus), een bekend neurotoxine dat een klinisch syndroom veroorzaakt dat vergelijkbaar is met totziekte van Parkinson(PD). Op dit moment is er echter zeer weinig bekend over de signaalroutes die door paraquat in welk celsysteem dan ook worden geactiveerd. In deze studie hebben we het effect van paraquat op extracellulaire signaal-gereguleerde kinasen 1 en 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminaal kinase (JNK) en eiwitkinase B (PKB) activering in E18-cellen onderzocht. Lage concentraties paraquat stimuleerden zeer vroege verhogingen van ERK1/2-, JNK1/2- en PKB-fosforylering. De fosfatidylinositol-3-kinase (PI-3K)-remmers wortmannine en LY 294002 (2-(4-morfolinyl)-8-fenyl-4H{{ 19}}benzopyran-4-on) remde vroege door paraquat geïnduceerde verhogingen van PKB-fosforylering. Bovendien waren vroege paraquat-gemedieerde verhogingen van ERK1/2-activering gevoelig voor de door mitogeen geactiveerde proteïnekinasekinase 1 (MEK1)-remmer PD 98059 (2#-amino-3#-methoxyflflavone), terwijl JNK1/2-responsen geblokkeerd door de JNK1/2-remmer SP 600125 (antra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-on). Voorbehandeling met wortmannine, LY 294002 of PD 98059 had geen invloed op paraquat-celdood in E18-cellen. Daarentegen verminderde SP 600125 significant de door paraquat geïnduceerde celdood in E18-cellen. Concluderend hebben we aangetoond dat lage concentraties paraquat robuuste zeer vroege verhogingen van ERK1/2-, JNK1/2- en PKB-fosforylering in E18-cellen stimuleren. Bovendien suggereren de gepresenteerde gegevens dat remming van de JNK1/2-route E18-cellen beschermt tegen door paraquat geïnduceerde celdood en ondersteunt het feit dat remming van vroege activering van JNK1/2 een mogelijke strategie kan vormen bij de behandeling van PD. Sleutelwoorden: paraquat; lage concentraties; JNK; celdood; Parkinson.

Kruid tegen de ziekte van Parkinson:cistanche

INVOERING

Ziekte van Parkinson (PD)is een neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door de dood van dopaminerge neuronen in de sub-Constantia nigra in combinatie met intracytoplasmatische insluitsels die bekend staan ​​als Lewy-lichaampjes (Olanow en Tatton, 1999). Slechts 5-10 procent van de PD-patiënten heeft een familiale vorm van deze ziekte met een autosomaal dominante wijze van overerving (Gasser, 2001). Genetische factoren zijn belangrijk bij jonge patiënten, maar het is niet waarschijnlijk dat ze een belangrijke rol spelen bij de meer voorkomende sporadische PD. Daarentegen wijzen epidemiologische studies op verschillende omgevingsfactoren die het risico op het ontwikkelen van PD verhogen (ziekte van Parkinson). Deze omvatten pesticiden, herbiciden, industriële chemicaliën, landbouw en wonen in een landelijke omgeving (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner en BenShlomo, 1999). Het meest overtuigende argument ter ondersteuning van een omgevingsfactor bij PD heeft betrekking op de ontdekking van de biologische effecten van MPTP (1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6- tetrarchie-dropyridine). Dit toxine van het centrale zenuwstelsel produceert een syndroom dat zowel klinisch als anatomisch vergelijkbaar is met PD (Kopin en Markey, 1988; Langston et al., 1983). In die zin is het veelgebruikte herbicide paraquat (1,1#-dimethyl-4,4#-bypiridinium) gesuggereerd als een vermeende risicofactor op basis van zowel zijn structurele homologie met MPPþ, de actieve metaboliet van MPTP ( Tanner en Langston, 1990), en op meldingen van parkinsonisme die verband houden met blootstelling aan het middel (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al., al., 1992). Hoewel de signaalroutes die betrokken zijn bij MPPþ-celdood algemeen bekend zijn (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), is er echter zeer weinig bekend over de geactiveerde signaalroutes. door paraquat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) Hoe dan ook, er zijn geen studies over vroege gebeurtenissen die zijn waargenomen na blootstelling aan lage concentraties paraquat.

Verschillende stimuli, waaronder MPPþ en paraquat, kunnen een reeks intracellulaire signaalcascades activeren die nauw verbonden zijn met zowel celdood als celoverlevingsroutes. MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) activeert bijvoorbeeld leden van de familie van mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) en proteïnekinase B (PKB). De leden van de TheMAPK-familie die worden geactiveerd door MPPþ of paraquat omvatten extracellulaire signaalgereguleerde kinasen 1 en 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminale kinasen (JNK1 en JNK2) en p38 MAPK's. Algemeen wordt aangenomen dat ERK1/2 en PKB-activering bevordert celoverleving door activering van anti-apoptotische signaalroutes, terwijl activering van JNK1/2 en p38 MAPK geassocieerd is met neuronale celdood (Harper en LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Activering van de fosfatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/PKB-route is betrokken bij neuronale overleving (Shin et al., 2001). Activering van de JNK1/2-route kan met name een cruciale rol spelen bij MPP- en paraquat-toxiciteit (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) en bijgevolg in de cellulaire processen die worden beïnvloed in PD(ziekte van Parkinson).

Kruidencistanche: de ziekte van Parkinson

MATERIALEN EN METHODES

Cellijn en cultuur.

In deze studie werden spontaan onsterfelijk gemaakte neuroblasten van rattenhersenen, E18-cellen, gebruikt. De E18-cellijn is verkregen door spontane immortalisatie uit kweken van 18-dag oude foetale hersenschorsen van ratten en werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Spanje) . E18-cellen vertegenwoordigen primitieve neuroblasten die NF 68 en de primitieve neuronale marker nestine tot expressie brengen, maar de astrocytenmarker, gliaal fibrillair zuur eiwit, missen. Na gedeeltelijke differentiatie-inductie met dibutyryl-cAMP, brengen de cellen extra neuronale markers tot expressie, zoals NF 145, NF 220 en neuron-specifieke enolase (Mun˜oz, persoonlijke communicatie). Cellen werden gekweekt in Hanks' F-12 (Hyclone, Brevieres, Frankrijk) en aangevuld met 10% FCS (Hyclone), streptomycine (100 mg/ml) en penicilline (100 U/ml). Cellen werden uitgezaaid bij 5 3 10 5 in een weefselkweekfles van 75-cm2 (TPP, Trasadingen, Zwitserland) en bij 37°C onder een luchtatmosfeer van 5% CO2/95% geïncubeerd. Culturen werden eenmaal per week gepasseerd door trypsinisatie met behulp van een trypsine-EDTA-oplossing (Hyclone).

Cel behandelingen.

Confluente cellen (~ 80 procent) in weefselkweekflessen van 75-cm2 werden getrypsiniseerd en uitgezaaid in weefselkweekschalen met een concentratie van 5 3104 cellen/cm2. Vierentwintig uur later werd het medium afgezogen en vervangen door alleen vers medium of medium dat de aangegeven concentraties paraquat bevatte. In verdere experimenten werden verschillende concentraties kinaseremmers (LY 294002, wortmannin, SP 600125 en PD(ziekte van Parkinson)98059, allemaal uit Tocris, Bristol, Verenigd Koninkrijk) werden 30 minuten voor de blootstelling aan paraquat toegevoegd. Omdat kinaseremmers werden opgelost in dimethylsulfoxide, werden controles gemaakt met de hoogste gebruikte concentratie (0,2 procent vol/vol). Toevoeging van dimethylsulfoxide had geen invloed op de levensvatbaarheidswaarden van controleplaten.

Cellevensvatbaarheidstest.

De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door de colorimetrische MTT-assay (Mosmann, 1983). In levensvatbare cellen kan het mitochondriale enzym succinaatdehydrogenase MTT metaboliseren tot een formazankleurstof die licht absorbeert bij 570 nm. Voor deze experimenten werden 24-well-testplaten gebruikt. Aan het einde van elke behandeling werd 100 ul MTT, bereid met een concentratie van 5 mg/ml in PBS, aan elke plaat toegevoegd. Na 3 uur incubatie werd het medium gedecanteerd en werden de formazanprecipitaten opgelost met zure isopropanol (0,04-0,1 N HCl in absolute isopropanol). De absorptie van geconverteerde kleurstof werd gemeten bij een golflengte van 570 nm met achtergrondaftrekking bij 630-690 nm. De absorptie van de onbehandelde kweken werd ingesteld op 100 procent.

Om de resultaten van de MTT-test te bevestigen, werd de celdood ook beoordeeld door de afgifte van het cytosolische enzym lactaatdehydrogenase (LDH) aan het kweekmedium te meten met behulp van een colorimetrische LDH-testkit (Roche, Indianapolis, IN) volgens de instructies van de fabrikant. . LDH-lekkage werd gedefinieerd als de verhouding van LDH-activiteit in het kweekmedium tot de totale activiteit per putje (3100). Met beide methoden werden vergelijkbare gegevens verkregen.

Bereiding van celextracten en Western-blot-analyse.

Na experimentele behandelingen werden de cellen (gekweekt in schalen van 60- mm) tweemaal gespoeld met koude PBS en verwijderd door ze te schrapen en vervolgens 5 minuten bij 4 ° C bij 900 3 g gecentrifugeerd. Cellen werden gelyseerd in een buffer met 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mMNaCl, 1 procent Triton X -100, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMNa3VO4 en Protease-remmercocktail (Sigma, St. Louis, MO). Cellen werden 5 min bij 4°C bij 13,000 3 g gecentrifugeerd. Supernatanten werden bij 80°C bewaard tot analyse met Western-blot. Eiwitconcentratie werd gemeten volgens Bradford (1976) met BSA als standaard.

Gelijke hoeveelheden eiwitten (10 LG per aandoening) werden opgelost in 12 procent SDS-gelelektroforese en overgebracht naar PVDF-membranen volgens conventionele gedeeltelijk gemodificeerde methoden (Fuentes et al., 2000). In het kort werden eiwitten overgebracht (250 mA gedurende 60 min) naar PVDF-membranen met behulp van Mini Trans-Blot Cell-apparatuur (Bio-Rad, Hercules, CA). De procedure voor immunodetectie omvat de overdracht en blokkering van het membraan (60 min bij kamertemperatuur) met TTBS (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl en 0,2 procent Tween-20) die 10 procent magere melkpoeder bevat. Membranen werden vervolgens gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met polyklonale primaire antilichamen van konijn (allemaal van Cell Signalling, Beverly, MA, 1:1000 verdund) in TTBS þ 10% magere melkpoeder of 5% BSA. Na wassen (gedurende twee 5-min perioden met TTBS), werden de membranen geïncubeerd (60 min bij kamertemperatuur) met peroxidase-geconjugeerde anti-konijn secundaire antilichamen (1:5000 in TTBS met 10% magere melkpoeder). Na wassen (gedurende twee 5-min-periodes en één 10-min-periode), werd de detectie van gebonden antilichamen gevisualiseerd door chemiluminescentie met behulp van het ECL-plus-reagens (Amersham Biosciences, Orsay, Frankrijk) en geanalyseerd op Hoeveelheid Eén software (Bio-Rad). Het actinegehalte werd geanalyseerd als een controle met behulp van een polyklonaal konijnenantilichaam (van Sigma) 1:2500 verdund in TTBS met 10% magere melkpoeder).

Statistische analyse.

Elk experiment werd ten minste drie keer herhaald met een bevredigende correlatie tussen de resultaten van individuele experimenten. De getoonde gegevens zijn die van een representatief experiment; elke groep bestond uit gemiddeld drie tot vier kweekschotels. Alle gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM. De resultaten werden geanalyseerd door ANOVA. De p-waarden kleiner dan 0.05 werden als significant beschouwd.

Ziekte van Parkinson:Cistanche-extract

RESULTATEN

Cytotoxische effecten van paraquat in E18-cellen

Zoals eerder gemeld (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), zijn verschillende cellijnen gevoelig voor de toxische eigenschappen van paraquat. Blootstelling aan paraquat veroorzaakte een dosisafhankelijke vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. (Fig. 1.) In deze studie vertoonden E18-cellen die gedurende 24 uur met 25 µM paraquat waren behandeld, een verlies van 50 procent aan cellevensvatbaarheid. De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd door de transformatie naar MTT te meten in een formazankleurstof die licht absorbeert bij 570 nm. Deze test wordt uitgebreid gebruikt om celdood in verschillende cellijnen te volgen, waaronder E18-cellen (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001), en verschillende beledigingen, waaronder paraquat (Chun et al., 2001; Gonzalez -Polo et al., 2004).

Door paraquat geïnduceerde activering van ERK1/2 in E18-cellen

Verhogingen van ERK1/2-activering in E18-cellen die met paraquat waren behandeld, werden gevolgd door Western-blotting met behulp van een fosfospecifiek ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antilichaam. De blootstelling van E18neuroblastcellen met 25 µM paraquat produceerde een duidelijke toename in de fosforyleringsstatus (Thr202/Tyr204) van ERK1/2 (44/42 kDa) (Fig. 2A). Maximale verhogingen van de fosforylering traden op na 5 minuten, waarna de fosforyleringsniveaus langzaam afnamen tot bijna basale niveaus. Verder waren de verhogingen in ERK1/2-fosforylering geïnduceerd door paraquat niet concentratie-afhankelijk (Fig. 2B). Voorbehandeling met de theMEK1-remmer, PD(ziekte van Parkinson)98059 (50 µM; Dudley et al., 1995) remde volledig door paraquat geïnduceerde verhogingen in ERK1/2-fosforylering (Fig. 3).

Door paraquat geïnduceerde activering van PKB in E18-cellen

PKB-activering in E18-cellen werd gedetecteerd door Western-blotting met behulp van een fosfo-specifiek (Ser473) antilichaam. Stimulatie van E18-cellen met 25 µM paraquat produceerde een duidelijke toename in PKB-fosforylering (Fig. 4A). Deze toename treedt op na 20 minuten, vergelijkbaar met die van ERK1/2-fosforylering nadat de fosforylatieniveaus langzaam waren gedaald tot bijna basale niveaus (Fig. 4A). Verder waren door paraquat gemedieerde verhogingen in PKB-fosforylering concentratieafhankelijk met een maximum bij 25 M paraquat (Fig. 4A). Omdat PI-3K vereist is voor PKB-activering, werd de rol van PI-3K bij paraquat-geïnduceerde PKB-activering in E18-cellen daarom onderzocht met behulp van de PI-3K-remmers wortmannine en LY 294002.

Door paraquat gemedieerde verhogingen in PKB-fosforylering werden volledig geblokkeerd na voorbehandeling (30 min) van E18-cellen met 100 nM wortmannine en 30 µM LY 294002 (Fig. 5). Deze waarnemingen tonen aan dat een PI-3K-afhankelijke route door paraquat geïnduceerde verhogingen in PKB-fosforylering in E18-cellen medieert.

Door paraquat geïnduceerde activering van JNK1/2 in E18-cellen

Eerdere studies hebben aangetoond dat paraquat JNK1 / 2 in neuronen activeert (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) en niet-neuronale cellen (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). De gebruikte concentraties zijn echter veel hoger dan die welke in dit werk worden gebruikt. Bovendien zijn de tijden die zijn geselecteerd om JNK1/2-activering te visualiseren ook langer. JNK1/2-activering in E18-cellen werd gedetecteerd door Western-blotting met behulp van een fosfospecifiek JNK (Thr183/Tyr185) antilichaam. Stimulatie van E18-cellen met 25 µM paraquat produceerde een duidelijke en vroege toename in JNK (46/54 kDa) fosforylering (Fig. 6A). Deze verhogingen waren maximaal na 5 minuten, waarna de fosforyleringsniveaus afnamen in de richting van basale niveaus (Fig. 6A). Paraquat-gemedieerde verhogingen in JNK1/2-fosforylering waren echter niet concentratie-afhankelijk (Fig. 6B). Paraquat-gemedieerde verhogingen in JNK1/2-fosforylering waren gevoelig voor de JNK1/2-remmer SP 600125 (10 M; Fig. 7; Bennett et al., 2001). Ten slotte stimuleerde paraquat (25 M) geen meetbare toenames in p38-MAPK-fosforylering in E18-cellen in dezelfde tijdsverloopexperimenten (gegevens niet getoond). Deze experimenten werden uitgevoerd met behulp van een fosfospecifiek p38 MAPK(Thr180/Tyr182) antilichaam.

Meting van de levensvatbaarheid van cellen na behandeling van E18-cellen met paraquat- en kinaseremmers

Nadat we hebben aangetoond dat paraquat in alle gevallen een vroege activering ERK1/2, PKB en JNK1/2 in E18-cellen produceert, hebben we vervolgens de rol bepaald van de snelle activering van deze kinase-routes in celdood veroorzaakt door lage concentraties paraquat met behulp van farmacologische specifieke remmers. Zoals getoond in figuur 1 induceerde blootstelling van E18-cellen aan 25 µM paraquat een significante vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen (ongeveer 50 procent). Om de rol van ERK1/2, PKB en JNK1/2 bij paraquat-geïnduceerde celdood te onderzoeken, werden E18-cellen gedurende 30 minuten voorgeïncubeerd met de volgende kinaseremmers: PD(ziekte van Parkinson)98059 (50 µM; MEK1/2-remmer), LY 294002 (30 µM; PI-3K-remmer), wortmannine (100 nM; PI-3K-remmer) en SP 600125 (10 µM; JNK1/2-remmer). Zoals getoond in Figuur 8 (en het is samengevat in Tabel 1), hadden wortmannine, LY 294002 en PD 98059 geen significant effect op het verlies aan cellevensvatbaarheid geïnduceerd door 25 µM paraquat.

DISCUSSIE

Onlangs hebben verschillende onderzoeken de belangstelling vergroot voor de mogelijkheid dat omgevingsneurotoxinen zoals pesticiden mogelijk verband houden met de ontwikkeling van niet-genetische PD(ziekte van Parkinson)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz en Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ is een van de mogelijke herbiciden die betrokken zijn bij PD, vanwege een vergelijkbare chemische structuur met MPPþ en de sterke correlatie tussen de incidentie van de ziekte en de hoeveelheid PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz en Yu, 2000). Het mechanisme van de neuronale toxiciteit die optreedt bij onderblootstelling aan lage niveaus van paraquat is echter niet vastgesteld. In ieder geval zijn eerdere werken niet geïnteresseerd in het vroege proces dat blijkt uit de expositie aan paraquat. De belangrijkste bevinding van de huidige studie is dat we hebben aangetoond dat E18-neuroblastcellen blootgesteld aan lage concentraties paraquatrapidisch de geactiveerde fosforylering van de over het algemeen anti-apoptotische signaalroutes PI-3K/PKB en MEK ERK en ook de over het algemeen pro-apoptotische JNK1/ 2 MAPK. Daarentegen stimuleerde paraquat geen tijd- of concentratieafhankelijke meetbare toenames in p38-MAPK-fosforylering. Zoals hierboven aangegeven, gebruikten we een lage concentratie paraquat. De relevantie van het feit of paraquat in de hersenen kan komen of niet omdat het een geladen molecuul is, is gedebatteerd. Recente bevindingen (Shimizu et al., 2001) onthulden echter dat paraquat de neutrale aminozuurpomp kan gebruiken om in de hersenen te komen. De bevindingen die in dit werk worden gepresenteerd, geven aan dat slechts een lage concentratie paraquat in de cel nodig is om snel verschillende signaalroutes te stimuleren, waaronder NK, dat betrokken is bij celdoodprocessen. Deze vroege activeringen als gevolg van de lage concentratie paraquat worden voor het eerst in dit werk voorgesteld.

Er is weinig aandacht besteed aan het bestuderen van de veranderingen in fosforyleringsniveaus van PKB of ERK1/2 geïnduceerd door paraquat (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Hoe dan ook, eerdere rapporten (Peng et al., 2004) gebruiken relatief hoge concentraties paraquat (400 lM), waarmee de fosforyleringsgraad van ERK wordt gemeten na 12-18 uur blootstelling. Op deze momenten observeerden ze geen veranderingen in de p-ERK-niveaus. In ons werk hebben we een vroege (5-10 min) en belangrijke activering van ERK1 / 2 gedetecteerd (Fig. 2A). Deze activering neemt langzaam af tot de basale niveaus. In onze omstandigheden zijn de niveaus van gefosforyleerd ERK1 / 2 (na 12-18 uur) hetzelfde als in de controle, wat aangeeft dat deze route op deze momenten niet actief is (gegevens niet getoond) zoals beschreven door Peng et al. (2004). Deze activering is niet afhankelijk van de concentratie, wat het resultaat aangeeft dat de robuuste stimulatie van ERK wordt verkregen en gehandhaafd met zeer lage concentraties paraquat. Veranderingen in gefosforyleerde PKB-spiegels zijn nog steeds niet beschreven na blootstelling aan paraquat. We laten in figuur 4 zien dat de resultaten tijd- en concentratie-afhankelijk zijn en een maximaal effect laten zien na een blootstelling van 20-min met 25lM paraquat. Dat wil zeggen, vroege door paraquat gemedieerde verhogingen van PKB-fosforylering zijn vergelijkbaar met die waargenomen voor ERK1/2. Deze gegevens onthullen een vroege toename in het activeren van de fosforylering van zowel PKB- als ERK-overlevingsroutes. Er zijn geen gegevens over vroege activering van PKB of ERK bij door paraquat geïnduceerde celdood. Eerdere studies (Halvorsen et al., 2002) beschrijven echter een vergelijkbare vroege toename van beide routes in neuroblastoom SH-SY5Y-cellen die zijn blootgesteld aan MPPþ. In dit geval nemen de fosforyleringsniveaus niet af naar het basale niveau. Deze gegevens zijn met name interessant vanwege de eerder verwante vergelijkbare structuur tussen paraquat en MPPþ, wat wijst op een ander begin van de cellulaire machinerie die betrokken is bij het effect van beide moleculen.

Er is meer aandacht besteed aan de rol van JNK1 / 2pathway bij het mediëren van signalen die bijdragen aan de door paraquat geïnduceerde celdood. In deze studie hebben we aangetoond dat lage concentraties (25 M) paraquat significante verhogingen van gefosforyleerd JNK1/2 veroorzaakten (Fig. 6). Zoals gebeurt in PKBor ERK1/2, is deze activering tijdsafhankelijk met een zeer vroege start (5 min) en met een langzame terugkeer naar de basale niveaus. Eerdere werken (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) tonen late (12-18 uur) activeringen van JNK1/2pathway die in ieder geval worden geproduceerd door relatief hoge concentraties paraquat (van 400 lM [Peng et al., 2004] tot 800 lM [Chunet al., 2001]). In onze omstandigheden is de fosforyleringsgraad van JNK1/2 op de aangegeven tijden vergelijkbaar met de controle. Over het algemeen geven deze resultaten voor het eerst aan dat celblootstelling aan een zeer lage concentratie paraquat een vroege activering van PKB-, ERK1/2- en JNK1/2-routes veroorzaakt.

Nadat we hadden vastgesteld dat paraquat vroege PKB-, ERK1/2- en JNK1/2-activering in E18-cellen veroorzaakt, onderzochten we vervolgens de rol van deze proteïnekinaseroutes in door paraquat geïnduceerde celdood met behulp van verschillende farmacologische remmers. De levensvatbaarheid van de cellen werd gevolgd door de transformatie naar MTT te meten in een formazankleurstof die licht absorbeert bij 570 nm. MTT-assay is gebruikt om neuronale schade nauwkeurig te meten na een verscheidenheid aan beledigingen, waaronder MPPþ of paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004 ), en het is de meest gebruikte methode om celdood te bepalen. Zoals getoond in Figuur 8, verminderde voorbehandeling met de selectieve JNK1/2-remmer SP 600125 significant de door paraquat geïnduceerde celdood. Deze concentratie van SP 600125 blokkeerde volledig paraquat-geïnduceerde activering van JNK1/2 (Fig. 7). Deze gegevens suggereren dat remming van de vroege activering van de JNK1/2-route cellen beschermt tegen door paraquat geïnduceerde celdood. Deze gegevens zijn in overeenstemming met eerdere studies (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), die hebben aangetoond dat JNK1/2 betrokken is bij neuronale celdood veroorzaakt door paraquat. In deze onderzoeken wordt echter tussen de 15 en 30 keer meer paraquat gebruikt dan in deze studie. We tonen ook aan dat lage concentraties paraquat niet alleen activatie kunnen veroorzaken, maar ook een vroege activatie van deze route. De bescherming die werd waargenomen met SP600125 geeft ook aan dat de JNK1/2-route betrokken is bij celdood geïnduceerd door paraquat. Bovendien is JNK1/2-remming ontworpen als een mogelijke strategie bij de behandeling van PD(ziekte van Parkinson)in verschillende modellen, zowel in vivo als in vitro (Wang et al., 2004).

neuroprotectief effect van cistanche

Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel PKB als ERKpathways betrokken zijn bij neuronale overleving (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). In deze studie hebben we aangetoond dat lage concentraties paraquat zowel PKB- als ERK-routes produceren en vroeg stimuleren. Deze waarnemingen suggereren dat door paraquat geïnduceerde PKB- en ERK-activering betrokken kan zijn bij het beschermen van cellen tegen door paraquat geïnduceerde celdood. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, gebruikten we de structureel niet-gerelateerde PI-3K-remmers wortmannine en LY 294002 en de ERK1/2-remmer PD(ziekte van Parkinson)98059. Interessant is dat zowel PKB- als ERK-remming de levensvatbaarheid van cellen in aanwezigheid van paraquat niet veranderde, wat suggereert dat, in onze omstandigheden, verhoogde PKB- en ERK-activering niet essentieel is voor overleving in door paraquat geïnduceerde celdood in E18-cellen.

Het is bekend dat het mechanisme van paraquat-neurotoxiciteit onder andere wordt gemedieerd via oxidatieve stress (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). In die zin is recentelijk een zeer snelle cytosolische oxidatieve stress beschreven bij vroege apoptotische gebeurtenissen die betrokken zijn bij paraquat-geïnduceerde celdood (Gonzalez-Polo et al., 2004). Omdat oxidatieve stress leden van de MAPK-familie activeert (zoals ERK1/2 en JNK1/2) en PKB (Kamata en Hirata, 1999), kan deze vroege activering van ERK1/2, JNK1/2 en PKB worden toegeschreven aan de snelle oxidatieve stress-geïnduceerd na paraquat-expositie.

Samenvattend laten onze resultaten voor de eerste keer zien dat lage concentraties paraquat zeer vroege en robuuste verhogingen van PKB-, ERK1/2- en JNK1/2-fosforylering in E18-cellen stimuleren. Bovendien hebben we aangetoond dat remming van de vroege activering van de JNK1/2-route E18-cellen beschermt tegen door paraquat geïnduceerde celdood. Dit resultaat wijst op het bestaan ​​van enkele vroege gebeurtenissen (zoals snelle JNK1/2-activering) die een essentiële rol spelen bij de celdood die wordt veroorzaakt door lage concentraties paraquat. Dit resultaat opent ook een nieuwe en opwindende lijn in de studie van paraquat-toxiciteit en de mogelijke implicatie ervan bij de ontwikkeling van PD(ziekte van Parkinson).

OPMERKING: Cistancheis een traditioneel Chinees kruid dat effecten heeft op neuronen en hersencellen. cistanche is ook bekend als de woestijn ginseng, het is een mogelijke behandeling voor neuro-aandoeningen zoals:ziekte van Parkinsongebaseerd op de moderne farmacologische studie