Gemedieerde anti-verouderingseffecten van Cistanche-extract

EG cultuur

Menselijke endotheelcellen van de navelstrengader werden verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas VA, VS). Cellen werden gekweekt bij 37°C met 5% C02-endotheliaal groeimedium-2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, VS) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). EC's werden 48 uur gekweekt bij 37°C met 5 procent CO, in EGM-2 (controle) of HG 30 mM medium, met of zonder toevoeging van verschillende concentraties Cistanche (1040 ug/mL).

Cel-levensvatbaarheidstest

Cellen werden 72 uur gekweekt bij 37°C in een EGM{2}}-medium aangevuld met 2 procent FBS en verschillende concentraties Cistanche, en werden 4 uur behandeld met MTT-oplossing. De resulterende afzettingen van formazan werden opgelost met dimethylsulfoxide, waarbij de absorptie werd gemeten bij 570 nm met behulp van een VersaMax ELISA-microplaatlezer (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, VS).

Kraswond-migratietest

Cellen raakten gewond en vervolgens werden kweekmedia vervangen door verse media die verschillende concentraties Cistanche bevatten. Cellen werden 24 tot 48 uur bewaard. Bij volledige migratie werden cellen afgebeeld met behulp van een microscoop (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Japan). De gemigreerde cellen werden geteld met behulp van een optische microscoop bij een vergroting van 200x en handmatig gekwantificeerd

SA-P-gal kleuring

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 cellen geteld met behulp van drie onafhankelijke velden.

Western blot-analyse

Cellen werden geoogst en gelyseerd in eiwitextractie-oplossing (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Korea) die protease- en fosfataseremmers bevatte (10 min bij 4°C). Totale eiwitconcentraties in de supernatanten werden gemeten met behulp van Bradford-assays. Na 5 minuten verhitten op 95 graden werden eiwitmonsters (30 ug) gescheiden door 8-12 procent natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Eiwitten werden vervolgens overgebracht op polyvinylideenfluoridemembranen (MilliporeBedford, MA, VS) bij 100 V gedurende 60 minuten. Membranen werden geïncubeerd in 5 procent runderserumalbumine (BSA) in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) aangevuld met 0,05 procent TBS met Tween-20 (TBST) (30 min bij kamertemperatuur), vervolgens geïncubeerd in 5 procent BSA in TBST aangevuld met primaire antilichamen (1:200 tot l,000) (overnacht bij 4°C). Vervolgens werden membranen geïnoculeerd met HRP-geconjugeerde geit-anti-konijn- of anti-muis-antilichamen (1:5,000) gedurende h, en eiwitbanden werden gedetecteerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit (Intron Biotechnology, Inc. ) en een LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan). Semi-kwantitatieve analyse van de densitometrieresultaten werd uitgevoerd met behulp van Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, VS).

Meting van NO-productie NO-concentraties werden bepaald door de concentratie van nitriet te detecteren met behulp van NO-assaykits, volgens de instructies van de fabrikant. Optische dichtheden werden bepaald bij 560 nm met behulp van een microplaatlezer en concentraties werden berekend met behulp van een kalibratiecurve

statistische analyse

Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde plus standaarddeviatie (SD). De statistische significantie werd bepaald door eenwegs variantieanalyse (ANOVA). Post-hoc vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van Bonferroni meervoudige vergelijkingstests. Alle berekeningen zijn uitgevoerd met behulp van SPSS in Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) en P-waarden<0.05 were considered statistically significant.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

Cistanche cytotoxiciteit

Om de cytotoxiciteit van Cistanche op EC's te bepalen, werden cellen gedurende 72 uur geïncubeerd met verschillende concentraties Cistanche (0 tot 100 ug/ml). Cistanche vertoonde significante cytotoxiciteit (P<0.05) at concentrations >50 µg/ml op alle tijdstippen van de behandeling (fig. 1). Daarom Cistanche concentraties van<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

De mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK)-route reguleert sleutelprocessen die betrokken zijn bij vasculaire EC-ontwikkeling, zoals celproliferatie, invasie, metastase en overleving, en angiogenese (Pišlar et al., 2015). De MAPK omvat ERK, c-Jun N-terminale kinase en p38 (Kim en Choi, 2010). ERK en p38 zijn belangrijke signaaleiwitten die betrokken zijn bij wondgenezing, terwijl ERK een belangrijke rol speelt bij het beheersen van celmigratie, proliferatie, differentiatie en overleving (Roskoski, 2012). In een recente studie werd gesuggereerd dat de p38 MAPK-signaalroute betrokken is bij wondgenezing (Loughlin en Artlett, 2011; Kim et al., 2019; Wang et al., 2019). In de huidige studie hebben we de eiwitexpressie van ERK en p38 onderzocht om de signaalroutes te identificeren die betrokken zijn bij door Cistanche gereguleerde EC-migratie. Cistanche-behandeling (40 µg/ml) verhoogde EC-migratie 1,5-voudig ten opzichte van de controle (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-voudig hoger dan de controle (P<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Figuur 1.Effecten vanCistanche(Cistanche) over de levensvatbaarheid van cellen. Cellen werden behandeld met Cistanche (0 tot 100g/ml) gedurende 72 uur. Levensvatbaarheid van de celwerd berekend als het percentage levensvatbare cellen gekweekt in deafwezigheid van Cistanche. Resultaten tonen gemiddelde ± SD. *P<0.05.