Meta‑analyse van NAD(P)(H)-kwantificeringsresultaten vertoont variabiliteit tussen zoogdierweefsels Ⅱ

Het effect van premortale versus postmortale weefselverzameling op NAD(P)(H)-niveaus.

We voorspelden dat er een waarneembaar verschil zou kunnen zijn in de NAD(P)(H)-redoxtoestand dat afhankelijk is van weefseloogstprocedures. Om deze vraag te beantwoorden, onderzochten we het effect van pre- versus postmortale procedures voor het verzamelen van weefsels op de NAD(P)(H)-redoxstatus. Voor deze analyse hebben we de waarden van leverweefsels van ratten vergeleken, gezien het grotere aantal onderzoeken dat hun opofferingsprotocol definieert. Bij onthulling verklaarden alle beoordeelde onderzoeken dat de weefselmonsters koud werden gehouden en onmiddellijk op ijs werden geëxtraheerd of ingevroren bij -80 graden voorafgaand aan NAD (P) (H) -metingen. Deze analyse stelde vast dat er geen significant verschil was in NAD plus concentraties in rattenlever (Fig. 6a) tussen weefsels die voor of na euthanasie waren geëxtraheerd. De gerapporteerde NADH-niveaus in rattenlever zijn echter significant hoger in post-mortemmonsters (Fig. 6b). Er werden geen verschillen in totale NAD(H)-niveaus (Fig. 6c) waargenomen, maar de NAD plus/NADH-ratio was lager in weefsels die werden verzameld na euthanasie (Fig. 6d), wat consistent is met de waargenomen variatie in NADH-niveaus. NADP plus, NADPH en de resultaten van de NADP plus /NADPH-ratio in rattenlever gegroepeerd op tijdstip van weefseloogst worden getoond in aanvullende figuur 9; het onvoldoende aantal post-mortemmonsters stelt ons echter niet in staat om het effect van het tijdstip van weefseloogst op NADP(H)-niveaus te interpreteren. In muizenlever was er geen verschil tussen pre- en post-mortem NAD plus niveaus, maar het aantal rapportagestudies was beperkt (Fig. 6e). NeeNADH,NADP plus, ofNADPHpostmortale gegevens binnenmuis leverter vergelijking beschikbaar was.

Klik hier om Hebrs Cistanche te krijgen

Discussie

Veel recente onderzoeken hebben aangetoond dat NAD(P)(H)-regulatie essentieel is voor cellulaire homeostase en redoxstatus. Gegevens verkregen van knaagdieren hebben geleid tot onderzoeken naar NAD plus-niveaus in menselijk bloed, als een minder invasieve indicator van NAD plus-niveaus in het hele lichaam. Recente klinische onderzoeken toonden aan dat NAD plus-niveaus werden verlaagd in ziektetoestanden23,47 en verhoogd na NAD plus boosting-strategieën23,44,48,49. We hebben een meta-analyse uitgevoerd van alle onderzoeken die tussen 1946 en 20 juni 2021 zijn gepubliceerd en die kwantitatieve gegevens bevatten voor NAD(P)(H)-niveaus bij zoogdiersoorten met een speciale focus op muizen, ratten en mensen, aangezien zij het meest vertegenwoordigen bestudeerde soorten op biomedisch gebied. Deze analyse werd gedeeltelijk uitgevoerd om het gemiddelde standaardniveau van NAD(P)(H)-concentraties in normale weefsels van zoogdieren te bepalen, gezien de welbekende variantie in deze metingen tussen studies. We hopen dat deze gegevens kunnen worden gebruikt om gestandaardiseerde protocollen op het gebied van NAD plus-onderzoek te stimuleren en om het gebruik van NAD(P)(H)-niveaus en redox-ratio's als betrouwbare biomarkers voor ziekte- en behandelingsregimes te bevorderen.

Ondanks de aanzienlijke variabiliteit in metingen in weefsels van knaagdieren, vertoonde deze meta-analyse vergelijkbare gemiddelde NAD plus-niveaus in weefsels, met enkele uitzonderingen. Interessant is dat de skeletspier van de muis lagere mediane NAD plus-niveaus vertoonde (Fig. 2a) dan andere sterk metabole weefsels (dwz lever, nier, hart en hersenen). Dit kan duiden op verschillende NAD(H)-redoxstatussen in skeletspieren of kan wijzen op grotere problemen met de extractie van metabolieten in fibreus weefsel. Deze waarnemingen konden echter niet worden geverifieerd bij mensen vanwege een gebrek aan bemonsterde weefsels buiten bloed en spieren.

Er zijn veel potentiële factoren die de nauwkeurigheid van fysiologische NAD(P)(H)-metingen in weefselmonsters kunnen beïnvloeden. Bij rapportage beschreven alle studies weefsels als zijnde geoogst en direct ondergedompeld in vloeibare stikstof, of op ijs bewaard vóór bevriezing of verwerking om de warmtegevoelige fracties te behouden (NAD plus en NADP plus). Het effect van de pH op de verschillende NAD(P)(H)-fracties, zoals de zuur-labiele aard van de gereduceerde NAD(P)H-vormen, heeft door het merendeel van de onderzoeken geleid tot het gebruik van pH-neutrale extractiemiddelen . Gezien de snelle onderlinge omzetting van de gereduceerde en geoxideerde metabolieten en het effect van anoxie op NAD(H)50-53, is het echter ook belangrijk om te zorgen voor een snelle extractie van weefselmetabolieten en de juiste procedures voor het doven van cellulair NAD(P)(H). )-redox/consumptie-enzymen, zoals door middel van eiwitverwijdering. In deze zin geeft onze analyse van pre- versus postmortale weefselverzameling aan dat postmortemanalyse de vermindering van NAD plus bevordert. De vermindering van weefsel-NAD plus is eerder in vivo beschreven in de hersenen, het hart en de lever van ratten die werden blootgesteld aan een verlengde 2.{10}}h hypoxische atmosfeer54, een omgeving die gedeeltelijk kan worden gerecapituleerd door langere periodes van post- offer weefselverzameling op voor snel invriezen. Dit kan erop wijzen dat het extraheren van weefsels onder verdoving of het prioriteren van de onmiddellijke oogst van weefsels die bedoeld zijn om te worden gebruikt voor metabolietanalyse na opoffering, moet plaatsvinden om representatieve NAD(P)(H)-metingen te verkrijgen.

Er is ook het potentieel voor verschillende kwantificeringsmethoden, elk met verschillende beperkingen, om bij te dragen aan de algehele intra-onderzoeksvariabiliteit van NAD(P)(H)-metingen. In de afgelopen twee decennia waren de meest gebruikte methoden enzymcyclusassays, LC-MS en HPLC. Elk van deze methoden wordt beïnvloed door metabolietextractietechnieken, kwantificeringsparameters en de implementatie van de juiste kwaliteitscontroles. Met behulp van LC-MS, Lu et al. hebben aangetoond dat de interconversie tussen gereduceerde en geoxideerde vormen van NAD(P)(H)-metabolieten met verschillende snelheden plaatsvindt in verschillende extractiebuffers of oplosmiddelen met het acetonitril:methanol:water met 0.1 M mierenzuurmengsel dat de hoogste herstel met de minste onderlinge conversies31. Bij gebruik van LC-MS kan deze interconversie echter worden gecontroleerd tussen individuele monsters van een onderzoek door te verrijken met interne controles zoals NAD(P)(H)-isotopen, wat een voordeel is van de LC-MS-techniek ten opzichte van die van HPLC en enzym. fietstesten31,33,55. Desalniettemin kunnen verschillende factoren, zelfs met goed gecontroleerde LC-MS-technieken, het gemeten signaal verstoren, waaronder matrixeffecten en variaties in ionisatie-efficiëntie. Sommige onderzoeken gebruiken bijvoorbeeld 13C-gelabelde gistextracten als interne standaarden in op LC-MS gebaseerde metabolomics. Het verrijken van de geëxtraheerde monstermetabolietmatrix met een 13C-gelabelde metabolietmatrix uit gistextract kan echter verschillende gevolgen hebben, zoals ionenonderdrukking, waardoor het signaal van gelabelde en/of niet-gelabelde metabolieten wordt verminderd, en kan leiden tot fouten in de absolute kwantificering als dit niet het geval is. ontdekt door een grondige kwaliteitsbeoordeling56. Hoewel LC-MS-technieken in theorie de meting van meerdere NAD(P)(H)-metabolieten in één experiment mogelijk maken, zijn er nog steeds beperkingen aangezien optimale verdunningen moeten worden uitgevoerd als de metabolieten van belang grote verschillen in concentraties hebben. Dus ondanks hun voordelen ten opzichte van de eenvoudigere enzymcyclische assays, dwingt de complexiteit van LC-MS-methoden tot een grondige optimalisatie. Onlangs zijn nieuwe analytische methoden ontwikkeld, zoals NAD plus biosensoren en op beeldvorming gebaseerde massaspectrometrie, maar er zijn nog steeds onvoldoende kwantitatieve gegevens gegenereerd uit deze technieken om in een meta-analyse op te nemen. Hoewel één studie in onze meta-analyse een op papier gebaseerde bioluminescente biosensor gebruikte om NAD plus niveaus in muizenlever en andere monstertypes te meten. Deze studie werd opgenomen in de bioluminescente testgroep vanwege de vergelijkbare detectiemethode (Fig. 1a).

methoden

Data-extractie.

Numerieke gegevens voor NAD(P)(H)-metabolieten werden ofwel direct verkregen uit de artikelen of geëxtraheerd uit artikelcijfers met behulp van een semi-automatische data-extractiesoftware (WebPlotDigitizer58). Daarnaast werden, indien van toepassing, de tijdstippen voor weefselbemonstering met betrekking tot opoffering en/of methoden voor weefsel-/bloedmonstername (dwz methode van anesthesie en/of euthanasie, weefselhantering en opslagtemperatuur) geregistreerd. Voor diermodellen werden de soort, kenmerken (bijv. stam, genotype, leeftijd en gewicht) en omgevingsomstandigheden (bijv. slaapcyclus, type dieet, voedingsfrequentie en voedingstoestand ten opzichte van weefselmonsters) geregistreerd. Bovendien werden voor alle studies behandelingen (bijv. farmacologische behandelingen, operaties, bestraling, tumorinductie en andere procedures toegepast op de proefpersonen) en alle informatie over de studiegroep (bijv. behandelings- of ziektegroepen en overeenkomstige controles) geëxtraheerd. Ten slotte, de methode van NAD(P)(H)-kwantificeringsmethode (bijv. Enzymatische assays, op massaspectrometrie gebaseerd, HPLC, NMR, bioluminescentie) en publicatiespecificaties (dwz publicatietitel, referentiecode [DOI, Medline UI, PMID] of hyperlink en jaar van publicatie) werden genoteerd (aanvullend materiaal 2).

Gegevens analyse. Voorafgaand aan de analyse werden alle concentraties omgerekend naar nmol/g weefsel of nmol/g eiwitten voor weefselmonsters of nmol/ml voor bloedfracties. Vanwege het lage aantal resultaten genormaliseerd naar eiwitgehalte, tonen we alleen resultaten genormaliseerd naar weefselgewicht en bloedvolume. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism versie 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, Californië, VS,Beschikbaarheid van dataAlle gegevens die tijdens deze studie zijn geëxtraheerd en geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en het aanvullende artikelinformatieflessen.Ontvangen: 29 april 2022; Geaccepteerd: 7 februari 2023

Referenties

10. Liefs, NR et al. NAD-kinase regelt de biosynthese van NADP bij dieren en wordt gemoduleerd via evolutionair uiteenlopende calmoduline-afhankelijke mechanismen. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. 112, 1386-1391 (2015).

Vraag voor meer:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950