MiR-199-3p verbetert spierregeneratie en verbetert oude spier- en spierdystrofie

Neem contact op met oscar.xiao@wecistanche.com voor meer informatie

Parabiose-experimenten suggereren dat moleculaire factoren die verband houden met verjonging en veroudering in het bloed circuleren. Hier laten we zien dat miR-199-3p, dat in het bloed circuleert als een celvrij miRNA, significant lager is in het bloed van oudere muizen dan bij jonge muizen; en miR-199-3p heeft het vermogen om myogene differentiatie en spierregeneratie te verbeteren. Toediening van miR-199-nabootsers, die miR-199-3p leveren, aan oude muizen resulteerde in hypertrofie van de spiervezels en vertraagd verlies van spierkracht. Systemische toediening van miR-199-nabootsers aan mdx-muizen, een bekend diermodel van Duchenne-spierdystrofie (DMD), verbeterde de spierkracht van muizen aanzienlijk. Alles bij elkaar genomen kan celvrij miR-199-3p in het bloed een anti-verouderingseffect hebben, zoals een ahypertrofisch effect in verouderde spiervezels, en zou het potentieel kunnen hebben als een nieuw RNA-therapeutisch middel voor DMD en leeftijdsgerelateerde ziekten. De bevindingen geven ons nieuwe inzichten in bloedcirculerende miRNA's als leeftijdsgebonden moleculen.

Klik hier om meer te weten

Vitale functies, zoals spierkracht, werking van het zenuwstelsel, ademhalingsfunctie, afweer tegen infectie en weerstand tegen ziekten, nemen af ​​met het ouder worden. Ziekten en disfuncties die gepaard gaan met een dergelijke functionele achteruitgang nemen toe en worden grote problemen in vergrijzende samenlevingen. Verschillende veranderingen, zoals veranderingen in de stofwisseling en genregulatie, treden in het lichaam op bij het ouder wordenl-3; en het bestuderen van dergelijke veranderingen kan helpen om vergrijzing te begrijpen en strategieën aan te reiken om de problemen aan te pakken waarmee vergrijzende samenlevingen worden geconfronteerd. Biomoleculen (inclusief genen) gerelateerd aan veroudering zijn geïdentificeerd en kunnen nuttig zijn bij verouderingsonderzoek; bijv. -galactosidase en plonk4a-expressie zijn geassocieerd met cellulaire veroudering4-6, en een muismodel zonder het klotho-gen staat bekend als een verouderingsmodel met een aantal fenotypen, dat lijkt op menselijke vroegtijdige veroudering.

Parabiose is de verbintenis tussen twee individuen die een gemeenschappelijk vasculair systeem delen, en kan experimenteel worden gegenereerd door chirurgie8. Experimenten met parabiose, waarbij jonge en oude knaagdieren werden samengevoegd om een ​​gemeenschappelijk vasculair systeem te delen, toonden aan dat het verouderingsproces bij jonge dieren werd versneld, terwijl oude dieren verjongd werden9-12. De bevindingen suggereren sterk dat bepaalde factoren die verband houden met verjonging en veroudering aanwezig zijn en met bloed in het vasculaire systeem circuleren; dergelijke circulerende factoren zijn echter nog niet volledig begrepen.

Cistanche kan anti-aging

MicroRNA's (miRNA's) zijn 21-23-nucleotide-lange kleine niet-coderende RNA's, die worden verwerkt van langere transcripten (primaire miRNA's) door spijsvertering, met een microprocessorcomplex in de kern en Dicer in het cytoplasma, en opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing-complex (RISC)14,15.MiRNA in RISC functioneert als een bemiddelaar bij gen-uitschakeling, waarbij de translatie van boodschapper-RNA's (mRNA's) met gedeeltelijke complementariteit aan het miRNA wordt geremd of mRNA's die bijna complementaire sequenties aan het miRNA dragen verteerd14,15.Cistanche-extract tegen stralingZo spelen miRNA's een belangrijke rol in de genregulatie door hun doelgenexpressie te onderdrukken. In dieren en planten zijn duizenden miRNA-genen gevonden [zie de microRNA-database (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Het expressieprofiel van miRNA's is onderzocht en weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifieke expressie en ziekte-geassocieerde expressie van miRNA's zijn gedetecteerdl6-21. Genregulatie waarbij miRNA's betrokken zijn, hangt nauw samen met verschillende vitale functies en levensverschijnselen, waaronder ziekten14,16,21-24

MiRNA's zijn zowel buiten als in de cellen aanwezig25. MiRNA's zijn bijvoorbeeld in het bloed aanwezig als celvrije nucleotiden en circuleren in het vasculaire systeem2627. Dergelijke celvrije miRNA's (cf-miRNA's) worden opgenomen in kleine blaasjes die extracellulaire blaasjes worden genoemd of zijn geassocieerd met eiwitten, waardoor ze worden beschermd tegen extracellulaire nucleasen25,28. De aanwezigheid van sommige cf-miRNA's kan significant zijn; er zijn bijvoorbeeld significante associaties tussen cf-miRNA's en bepaalde ziekten gedetecteerd26,27,29-31. Cf-miRNA's kunnen veranderingen in de fysieke toestand weerspiegelen; dus kunnen dergelijke miRNA's potentiële biomarkers zijn voor het bewaken van levensonderhoudssystemen, evenals voor ziekten.

De huidige studie werd uitgevoerd om associaties tussen cf-miRNA's en veroudering te onderzoeken, en cf-miRNA's in het bloed van jonge en oude muizen werden onderzocht. De resultaten onthulden veranderingen in cf-miRNA's tussen jong en oud muizenbloed. Van dergelijke miRNA's was miR-199-3p aanzienlijk verlaagd in oud bloed in vergelijking met jong bloed. Interessant is dat miR-19-3p de mogelijkheid heeft om spierdifferentiatie en -regeneratie te verbeteren, en de toediening ervan aan oude muizen resulteerde in de uitbreiding van de spiervezels. Toen miR-199-3p werd geïntroduceerd in mdx-muizen, een diermodel van Duchenne-spierdystrofie (DMD), werd de spierkracht van muizen aanzienlijk verbeterd. De huidige studie biedt nieuwe inzichten in bloedcirculerende cf-miRNA's in termen van veroudering, latent vermogen en medische toepassingen.

Resultaten

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-maanden oude) C57BL/6J-muizen, die DNA-microarray gebruiken om leeftijdsgerelateerde verschillen te identificeren. Het profiel van cf-miRNA's vertoonde duidelijke verschillen tussen jonge en oude muizen, dat wil zeggen, cf-miRNA's die bevooroordeeld zijn in de richting van jong en oud muizenbloed werden gedetecteerd (Tabel 1). Van dergelijke miRNA's waren myogene miRNA's (bijv. miR-1 en miR-133)1833 aanwezig in de miRNA-groep die overvloedig aanwezig is in jong bloed; met andere woorden, myogene miRNA's waren aanzienlijk minder in oud bloed (tabel 1).cistanche kruidenHet verschil in de miRNA's tussen jong en oud bloed werd bevestigd door kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR; Fig. la), en verder gereproduceerd met behulp van RNA-bronnen geëxtraheerd uit kleine blaasjes, zogenaamde exosomen, geïsoleerd uit het plasma ( Aanvullend Fig.1).

Celkweekexperimenten onthulden daarentegen dat jong muizenserum het vermogen had om myogene differentiatie te induceren, en het vermogen was sterker dan dat van oude muizen (figuur 1b). Insuline-achtige groeifactor I (IGF-I), een belangrijke factor die myogene differentiatie in het bloed kan induceren34,35, werd onderzocht; er werd echter geen significant verschil waargenomen tussen jong en oud bloed (Fig. lc). Andere factoren dan IGF-I in jong bloed kunnen dus betrokken zijn bij myogene differentiatie.

miR-199-3p is in staat om myogene differentiatie sterk te induceren. We onderzochten de effecten van miRNA's die overvloedig aanwezig zijn in jong bloed op myogene differentiatie. Synthetische miRNA-nabootsers werden geïntroduceerd in C2C12-cellen, een muizenmyoblastcellijn, en de expressie van myogene differentiatiemarkers, de myogenine (Myog) en myosine zware keten 1 (Myh1) genen, werd onderzocht. De resultaten waren onverwacht en trokken onze interesse: miR -199-3 p, dat werd voorspeld als een negatief miRNA vanwege de weinige informatie over myogene differentiatie, induceerde duidelijk de expressie van Myog en Myh1 (Fig. 2a, b). Bovendien was de inductie van miR -199-3 p sterker dan die van conventionele myogene miRNA's: de expressie van de zware keten van myosine in de aanwezigheid van miR -199-3 p was bijzonder opmerkelijk (Fig. 2b, c).

Om de relatie tussen miR-199-3p en myogene differentiatie te verduidelijken, onderzochten we cellulaire en extracellulaire (exosomale) miR-199-3p tijdens myogene differentiatie, en ook de effecten van miR-199-3p-remmers op de differentiatie. De expressie van endogene (cellulaire) miR-199-3p werd opgereguleerd na de start van differentiatie. Exosomaal miR -19-3p werd eenmaal verhoogd en daarna verlaagd (aanvullend in figuur 2a). Behandeling met remmers onderdrukte de expressie van myogene differentiatiemarkers, Myog, Myh1 en creatinekinase (Ckm) (aanvullende figuur 2b).cistanche penisgroeiDe bevindingen suggereren dus dat miR-199-3p deelneemt aan myogene differentiatie.

Het ontwerpen van miR-199 bootst na. We hebben miR-199-nabootsers zo ontworpen dat de nabootsers miR-199-3p efficiënt kunnen produceren als een functionele mediator (gidsstreng) bij het uitschakelen van genen. De ontworpen miRNA-nabootsers werden gescreend en miR199 # 4 werd geselecteerd als een competente miR -199-nabootser (aanvullende figuur 3). Vervolgens werd miR199#4 gebruikt in zowel in vivo als in vitro experimenten.

Doelgenen van miR-199-3p in myogene differentiatie. Om doelgenen voor miR-199-3p onder myogene differentiatie te identificeren, hebben we gezocht naar kandidaatgenen uit de TargetScan-database en ons gericht op de Lin28b- en Suz12-genen, die beide tot expressie worden gebracht in C2C12-myoblasten. Lin28b en Suz12 bezitten vermeende miR -199-3p-bindingssequenties in hun 3'-niet-vertaalde regio (UTR; Fig. 3a). We hebben aangetoond dat de vermeende sequenties authentieke bindingsplaatsen zijn voor miR -19-3p, met behulp van de Luciferase-reportergenen die de bindingssequenties en overeenkomstige niet-overeenkomende sequenties dragen (Fig. 3a, b). De Luciferase-genen die de vermeende bindingssequenties dragen, werden significant onderdrukt door miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) en pSuz12-(973)], terwijl de niet-overeenkomende sequenties, die basesubstitutiemutaties in het zaad [pLin28b-(81)mut, regio bezitten, deden het onderdrukkingseffect ervan teniet [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, en wanneer miR-199-nabootsers werden geïntroduceerd in C2Cl2-cellen, werd de expressie van Lin28b en Suz12 consequent onderdrukt (Fig. 3c). Om te beoordelen of de onderdrukking van Lin28b en/ of Suz12 draagt ​​direct bij aan myogene differentiatie, specifieke remming van Lin28b en Suz12 werd uitgevoerd door gen-uitschakeling, met behulp van RNA-interferentie (RNAi; Fig. 3d, e). Zoals verwacht werd de expressie van myogene differentiatiemarkers, zoals Ckm, Myh1 en Myog opgereguleerd onder Lin28b- en Suz12-genuitschakeling (Fig. 3f, g).

Omdat Lin28b een RNA-bindend eiwit is dat betrokken is bij de verwerking van miRNA's3637, hebben we de effecten onderzocht van miR-19-nabootsingen via Lin28b op myogene miRNA-verwerking. Het niveau van miR-1, een belangrijk myogeen miRNA, werd onderzocht omdat de verwerking van zijn voorloper wordt gereguleerd door Lin28b37. Gerijpte miR-1 was significant verhoogd door miR-199-nabootsingsbehandeling (Fig. 3h), wat suggereert dat miR-199-3p de functionele expressie van miR-1 kan reguleren door middel van onderdrukking van zijn doel Lin28b. Alles bij elkaar genomen suggereren de bevindingen dat miR-199-3p betrokken is bij myogene differentiatie door onderdrukking van zijn doelgenen, Lin28b en Suz12.

Verbetering van spierregeneratie door miR199 # 4 bij muizen met spierletsel.Cistanche salsa voordelenWe onderzochten de effecten van een miR-199-nabootsing (miR199 # 4) in vivo met behulp van spierletselmodellen (Fig. 4a, b). Acht weken oude C57BL/6J-muizen werden geïnjecteerd met BaClz in de tibialis anterior (TA) om spierbeschadiging te veroorzaken, en miR19#4 werd 24 uur later op de beschadigde plaatsen toegediend. Twee dagen na toediening van miR199#4 werd de expressie van myogene markergenen onderzocht. Myog-expressie was significant verhoogd en myogene differentiatie 1 (Myod1) en myogene factor 5 (Myf5) werden ook opgereguleerd door miR199 # 4-toediening (figuur 4c). De gegevens zijn consistent met de hierboven beschreven in vitro resultaten (Fig. 2).

Immunohistochemische analyse van regenererende spieren werd 9 dagen na toediening van miR199#4 uitgevoerd. De dwarsdoorsnedegebieden van regenererende spiervezels (myovezels), gekenmerkt door centrale kernen, werden onderzocht (figuur 4b). Het gemiddelde dwarsdoorsnede-oppervlak van regenererende myovezels behandeld met miR199 # 4 was groter dan die van controle myovezels behandeld met een niet-silencing controle RNA-duplex (nsCont; Fig. 4d), waarbij het verschil de statistische significantie naderde. Naast het gemiddelde dwarsdoorsnede-oppervlak vertoonde het in grootte verdeelde histogram van het dwarsdoorsnede-oppervlak een toename van vergrote spiervezels in aanwezigheid van miR199 # 4 (Fig. 4e).

Hypertrofisch effect van miR199#4 op verouderde spiervezels. We onderzochten de effecten van miR199#4 op oude muizen (~24 maanden oud). Oudere muizen vertoonden een significante afname in spier miR-199-3p (Fig. 5a), zoals in bloedcirculerende cf-miR-19-3p, vergeleken met jonge muizen. We hebben miR199 # 4 toegediend aan de TA-spieren van oude muizen en 2 dagen later werden de TA-spieren onderzocht door middel van immunohistochemische analyse (Fig. 5b). Het gemiddelde dwarsdoorsnede-oppervlak van myovezels behandeld met miR199 # 4 was significant groter dan die van controle myovezels behandeld met nsCont (figuur 5c). In overeenstemming hiermee onthulde de in grootte verdeelde histogramanalyse een duidelijke toename van vergrote spiervezels in aanwezigheid van miR199 # 4 (Fig. 5d).

Omdat de bloedcirculatie cf-miR-199-3p verminderd is bij oudere muizen, hebben we miR199#4 via de staartader in het circulerende bloed van oude muizen geïntroduceerd. Na intraveneuze toediening van miR19#4 werd het dwarsdoorsnede-oppervlak van myovezels onderzocht en geanalyseerd, zoals hierboven beschreven. De resultaten, zoals getoond in Fig. 5e, zijn consistent met de resultaten van de lokale toediening van miR199 # 4 aan verouderde spieren (Fig. 5c, d).

Opgemerkt moet worden dat er een verschil is in vergrote spiervezels tussen het spierletselmodel en oude muizen. Centrale kernen worden gezien in regenererende spiervezels (Fig. 4b), maar dergelijke myovezels werden nauwelijks gedetecteerd in oude muizen die waren behandeld met miR199 # 4 (Fig. 5b). Dit suggereert dat reeds bestaande spiervezels vergroot kunnen worden bij oudere muizen na behandeling met miR199#4. We veronderstelden dat een ander mechanisme anders dan spierregeneratie betrokken zou kunnen zijn bij de vergroting van de myovezels bij oudere muizen, en stelden de betrokkenheid van de spieratrofie-route voor.cistanche tubulosa dosering redditDe Atroginl- en MuRFI-genen zijn nauw verwant aan spieratrofie en hun expressieniveaus zijn significant verhoogd in oudere spieren in vergelijking met jonge spieren (Fig. 6a). We onderzochten het niveau van Atroginl en MuRFI in spieren van oude muizen na systemische toediening van miR199#4. Atroginl en MuRFI waren aanzienlijk verminderd in verschillende spieren door toediening van miR19 # 4 (Fig. 6b), wat suggereert dat onderdrukking van de spieratrofie-route door miR199 # 4 myofiber-expansie bij oudere muizen kan veroorzaken.

MiR199#4 vertraagt ​​het verlies van spierkracht bij oudere muizen. Het effect van miR199#4 op de spierfunctie bij oude muizen is interessant. De grijpkrachttest werd uitgevoerd op oude muizen voor en na systemische toediening van miR199#4. Het experiment werd dubbelblind uitgevoerd; RNA-injectie en de 100 procent griptest werden uitgevoerd door verschillende onderzoekers zonder i-informatie te delen. C57BL/6-muizen (80-week oud) mannetje werden getest op grip, en 1 week later werden ze intraveneus geïnjecteerd met miR199#4 en nsCont en opnieuw op grip getest. De verandering in spierkracht na injectie met miR199#4 was dat MiR199#4 de spierkracht van mdx-muizen verbetert. Omdat miR199#4 een positieve invloed heeft op spieren, hebben we een experiment uitgevoerd om het effect van miR199#4-toediening bij mdx-muizen, een bekend DMD-diermodel32, te beoordelen. Acht weken oude mdx-muizen werden intraveneus geïnjecteerd met miR199#4 (1,6 mg/kg) tweemaal (interval van 1 week) en de griptest werd 1 week na de laatste toediening uitgevoerd. Het experiment werd uitgevoerd op een dubbelblinde manier zoals getoond in Fig.7. De resultaten (Fig. 8a) tonen een significante verbetering in spierkracht bij mdx-muizen behandeld met miR199#4 in vergelijking met mdx-muizen behandeld met nsCont. Bovendien werden significante afnames in creatinekinase (CK)-activiteit en celvrije miR-1 waargenomen in het bloed van mdx-muizen die werden behandeld met miR199#4 (Fig. 8b, c), wat mogelijke tekenen van de ziekte zijn. verbetering.

Als reagens voor medicijnafgifte is atelocollageen stroperig en moeilijk te hanteren, en de met atelocollageen behandelde muizen leken negatieve effecten te ondervinden als gevolg van het vehikel. We zochten dus naar alternatieven voor atelocollageen om ons medicijnafgiftesysteem (DDS) te verbeteren en vonden DC-CHOL / DOPE-kationische liposomen als een nieuw DDS-reagens dat gelijk is aan of superieur is aan atelocollageen (aanvullende figuur 4). De geneesmiddelverdeling van miR199#4 met de kationische liposomen toonde aan dat de toegediende miR19#4 aan de spier werd afgegeven en consequent in grote hoeveelheden in de lever werd opgenomen (aanvullende figuur 5). Extracellulair miR199#4 dat aan de spier wordt afgegeven, kan fungeren als een mediator bij het uitschakelen van genen en bijdragen aan de genregulatie die betrokken is bij de verbetering van spierkracht.

We hebben geprobeerd biomoleculen te identificeren die verband houden met de verbetering na toediening van miR199 # 4. Verschillende aan DMD gerelateerde polypeptiden werden onderzocht door western blotting; in dit onderzoek werden echter geen duidelijke signalen met betrekking tot de verbetering gedetecteerd (aanvullende figuur 6). We zullen dit punt verder bespreken in de volgende paragraaf.

Discussie

Biomoleculen veranderen kwalitatief en kwantitatief met het ouder worden--3. Het vastleggen van dergelijke veranderingen en het bestuderen ervan is van vitaal belang voor het begrijpen van vergrijzing en kan strategieën onthullen voor het omgaan met problemen in vergrijzende samenlevingen. Parabiose-onderzoeken waarin jonge en oude dieren zijn samengevoegd om een ​​gemeenschappelijk vasculair systeem te delen, hebben belangrijke inzichten opgeleverd in veroudering en verjonging9-l2. De bevindingen suggereren sterk dat er verjongende en verouderingsfactoren zijn in respectievelijk jong en oud circulerend bloed. Eerdere studies meldden verschillende moleculen als kandidaten die verband houden met verjonging en veroudering, maar de resultaten zijn controversieel3.

Onze in vitro celcultuurexperimenten met jonge en oude sera zijn vergelijkbaar met parabiose-experimenten (Fig. lb), en we vonden miR-199-3p, dat verandert met de leeftijd, in circulerend bloed; van het miRNA werd vastgesteld dat het significant afnam in oud bloed (tabel 1 en figuur la). 5a); dus cf-miR-199-3p in het bloed kan correleren met spier-miR-199-3p. De afname van de expressie van miR-199-3p bij veroudering wordt ook waargenomen in mesenchymale stamcellen die zijn afgeleid van het beenmerg van de rhesusmakaak39. Daarom kan de expressie van cellulair miR-19-3p onder leeftijdsgebonden controle staan. In tegenstelling tot miR-19-3p blijft de expressie van cellulaire myogene miRNA's, zoals miR-1 en miR-133, onveranderd in jonge en oude spieren (Fig. 5a), maar het niveau van hun extracellulaire miRNA's in het bloed is aanzienlijk verminderd bij oudere muizen (Fig. la). Het verschil tussen miR-199-3p en myogene miRNA's (miR-1 en -133) kan het verschil weerspiegelen in cf-miRNA-verwerking en/of in leeftijdsgerelateerde controle van cf-miRNA's daartussen . Om dit verschil op te helderen, moet in de toekomst meer onderzoek worden gedaan.

Eerdere studies suggereerden dat miR-199-3p deelneemt aan verschillende cellulaire functies en vitale fenomenen via onderdrukking van zijn doelgenen; het miRNA kan bijvoorbeeld de proliferatie en migratie van endotheelpuntcellen bevorderen en het begin van de puberteit moduleren, respectievelijk door downregulatie van het beoogde semaphorine-3A-gen40 en door onderdrukking van doelgenen (Cdc42,Map3k2,Map3k4,en Taok1) betrokken bij de p38MAPK-route41. De huidige studie heeft aangetoond dat miR-19-3p betrokken is bij myogene differentiatie door onderdrukking van zijn doelgenen, Lin28b en Suz12 (Fig. 3). Lin28b is een RNA-bindend eiwit en remt de rijping van miRNA's, waaronder miR-1, dat een spierspecifiek miRNA is en myogenese bevordert37. Onderdrukking van Lin28b door miR-19-3p veroorzaakt een toename van gerijpte miR-1 (Fig. 3), waardoor myogene differentiatie kan doorgaan.

Suzl2 is een kernsubeenheid van polycomb-repressief complex 2 (PRC2), dat deelneemt aan het onderdrukken van chromatine42. Genregulatie van PRC2 is betrokken bij stamcelonderhoud, embryonale ontwikkeling, celproliferatie en differentiatie, inclusief myogene differentiatie42.PRC2 is aanwezig op stille spierspecifieke loci, zoals Myog en spiercreatinekinase (MCK) in ongedifferentieerde myoblasten, maar is gedissocieerd van dergelijke loci in gedifferentieerde myotubes . Gen-uitschakeling tegen Suz12 door RNAi veroorzaakt de versterking van myogene genexpressie (Fig. 3). Onderdrukking van de versterker van het zeste homolog 2 (Ezh2) -eiwit, een andere kernsubeenheid van PRC2, veroorzaakt ook myogene differentiatie . Deze bevindingen suggereren dat remming van PRC2-vorming als gevolg van onderdrukking van de kernsubeenheden de creatie van een genomische toestand voor spierdifferentiatie kan veroorzaken. Onderdrukking van Suz12 door miR-199-3p kan dus myogene differentiatie induceren. Alles bij elkaar genomen kan miR-19-3p een belangrijke rol spelen bij myogene differentiatie door remming van twee onafhankelijke routes waarbij Lin28b en Suzl2 betrokken zijn, die elk betrokken zijn bij het in stand houden van de ongedifferentieerde toestand van myoblasten.

Het effect van miR-199-3p op myogene differentiatie is ook in vivo aangetoond (Fig. 4). Spierbeschadiging veroorzaakt celproliferatie en differentiatie als gevolg van spierregeneratie. Introductie van miR199#4, dat miR-199-3p levert, op beschadigde plaatsen verbeterde spierregeneratie en uitgebreide regenererende spiervezels (Fig. 4). Myogene genexpressie werd consequent opgereguleerd onder miR199 # 4-behandeling (Fig. 4). Vanuit praktisch oogpunt kan miR199#4 effectief en nuttig zijn voor chirurgische behandelingen.

Toen miR199#4 werd toegediend aan bejaarde muizen zonder bloedcirculerend miR-199-3p, vertoonden de muizen duidelijk vergrote spiervezels (Fig. 5) en vertraagd verlies van spierkracht bij veroudering (Fig. 7). De uitgebreide myovezels bij oude muizen verschillen van regenererende myovezels, die vergroot zijn in aanwezigheid van miR199#4; de eerste is afgeleid van reeds bestaande myovezels, en de laatste is van neo-myovezels (pasgeboren myovezels). Er zijn dus verschillende, onafhankelijke mechanismen in de spiervezelvergrotingen. Onze studie suggereert dat (i) in het eerste geval remming van spieratrofie als gevolg van onderdrukking van Atroginl en MuRFI door behandeling met miR199#4 leidt tot vergroting van verouderde spiervezels, en (ii) in het laatste geval onderdrukking van doelgenen, Lin28b en Suz12, veroorzaakt vergroting van regenererende spiervezels. In totaal kunnen verschillende (meerdere) genen die worden gereguleerd door miR-19-3p in verschillende situaties betrokken zijn bij spierhypertrofie. De bevindingen suggereren ook dat miR-199-3p op zijn minst een antiverouderingseffect op spieren kan hebben, en dat miR199#4 die miR-199-3p levert, potentieel kan hebben als een nieuw RNA-medicijn voor leeftijdsgebonden spierziekten, zoals sarcopenie.

Op basis van de hoge werkzaamheid van miR199#4 op spieren, hebben we miR199#4 toegediend aan mdx-muizen, een bekend DMD-model, en hebben we opmerkelijke resultaten behaald: systemische toediening van miR199#4 verbeterde de spierkracht bij de muizen met ~20 procent ( Afb.8a). Om het mechanisme van het herstel van spierkracht te begrijpen, hebben we geprobeerd biomoleculen te identificeren die zijn verbeterd (of beïnvloed) door miR-199-3p. Met uitzondering van verbeteringen van bloed-CK en cf-miR -1 (Fig. 8b, c), waren we echter niet in staat om dergelijke verbeteringen op moleculair niveau te detecteren. Deze moeilijkheid om te detecteren kan te wijten zijn aan de complexe celpopulatie, die bestaat uit een mix van regenererende en verstorende spiercellen in mdx-muizen. Zelfs als miR199#4 in de verbetering resulteert, zou het hoge achtergrondgeluid veroorzaakt door de complexe celpopulatie bewijs van de verbetering maskeren. Om dit probleem op te lossen, moeten meer uitgebreide studies worden uitgevoerd met behulp van een homogene spiercelpopulatie afgeleid van mdx-muizen of gericht op verschillende weefsels, waaronder spieren.

Hoewel het moleculaire mechanisme van het spierkrachtherstel door miR199#4 onbekend blijft, is de dosis miR19#4 voor verbeterde spierkracht opmerkelijk. Tweemaal toediening van ~1.6 mg/kg miR199#4 verbeterde de spierkracht bij mdx-muizen. De effectieve dosis lijkt lager te zijn dan die van antisense-oligonucleotiden voor exon-skipping tegen mutante dystrofine-genen in vivo45-47. De reden waarom miR199#4 in staat is om de spierkracht bij zulke lagere doses te verbeteren, kan te wijten zijn aan het andere werkingsmechanisme in vergelijking met antisense-oligonucleotiden. Het werkingsmechanisme van miR19#4 is katalytische genuitschakeling. Daarentegen is het mechanisme van antisense oligonucleotiden gebaseerd op fysieke hybridisatie. Daarom kunnen verschillen in de juiste doses om de werkzaamheid van het geneesmiddel aan te tonen, worden toegeschreven aan de verschillende werkingsmechanismen.

Het mechanisme waarmee organen, weefsels of cellen miRNA's afgeven in het circulerende bloed is nog niet volledig begrepen, en de leeftijdsgerelateerde regulering van de afgifte van dergelijke miRNA's is ook onduidelijk. De huidige studie toonde aan dat myogene cf-miR-NA's, waaronder cf-miR-199-3p met het bloed in het vasculaire systeem circuleren en afnemen met het ouder worden. Dergelijke cf-miRNA's kunnen aanwezig zijn in exosomen, dwz het zijn exosomale miRNA's.

Myogene miRNA's nemen deel aan de myogene differentiatie, spierregeneratie en het onderhoud van spierhomeostase . Eerdere studies meldden dat myogene miRNA's, zoals miR-1 en miR-133, in het bloed toenamen als reactie op lichamelijke inspanning4849. Op basis van deze rapporten kunnen actieve jonge muizen meer myogene miRNA's in het bloed afgeven dan oude, langzaam bewegende muizen, en dergelijke extracellulaire miRNA's, waaronder cf-miR-199-3p, kunnen door autocriene werking bijdragen aan het in stand houden van spierhomeostase bij jonge muizen. . Het niveau van extracellulair (exosomaal) miRNA correleert echter niet altijd met het cellulaire miRNA-niveau, en er zijn verschillen waargenomen in myogene miRNA's en miR-199-3p tussen jonge en oude muizen (Fig. la en 5a) en tijdens myogene differentiatie (aanvullende figuur 2a). Als een andere mogelijkheid is het dus denkbaar dat leeftijdsgerelateerde en differentiatiegerelateerde regulatie van exosoomvorming de cf-miRNA-productie kan beïnvloeden; in het bijzonder kunnen er verschillen zijn in exosoomvorming tussen jonge en oude muizen. In de context van deze hypothesen is verder onderzoek nodig om de leeftijdsgerelateerde afgifte van myogene miRNA's in het bloed op te helderen.

Afgezien van het afgiftemechanisme, kunnen de cf-miRNA's, wanneer jonge myogene cf-miRNA's die cf-miR-199-3p bevatten in het verouderde bloedcirculatiesysteem stromen vanuit een jong vasculair systeem door parabiose, spieractivering en remming van spier teweegbrengen. atrofie aan de oude kant; dit concept wordt ondersteund door bewijs van oude muizen die intraveneus zijn geïnjecteerd met miR19 # 4 in deze studie (Fig. 5-7). Cf-miRNA's in het bloed kunnen verband houden met leeftijdsgebonden homeostatische functie en kunnen veranderde homeostase vertegenwoordigen. Wanneer dergelijke cf-miRNA's ectopisch aanwezig zijn, bijvoorbeeld wanneer cf-miRNA's in jong bloed worden overgebracht naar het verouderde bloedcirculatiesysteem, kunnen sommige cf-miRNA's verjongende effecten vertonen op de verouderde kant, dwz ze kunnen antiverouderingseffecten veroorzaken. Daarentegen kunnen cf-miRNA's in oud bloed een veranderde homeostase met veroudering vertegenwoordigen. Wanneer dergelijke cf-miRNA's worden overgebracht naar het jonge bloedcirculatiesysteem, kunnen sommige cf-miRNA's verouderingsgerelateerde achteruitgang veroorzaken en vroegtijdige veroudering aan de jonge kant veroorzaken. Cf-miRNA's die aanzienlijk zijn verhoogd in oud bloed, vertegenwoordigen kandidaten die gedetailleerde mechanistische analyse vereisen om veroudering te begrijpen en te voorkomen.

Concluderend heeft onze huidige studie nieuwe inzichten opgeleverd in cf-miRNA's als leeftijdsgerelateerde moleculen en een nieuwe onderzoeksrichting onthuld om de relatie tussen veroudering en celvrije functionele RNA's, waaronder cf-miRNA's, te verduidelijken.

Dit artikel is afkomstig uit COMMUNICATIONS BIOLOGY|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio