MiR-214 verbetert door sepsis veroorzaakt acuut nierletsel via PTEN/AKT/mTOR-gereguleerde autofagie
Feb 28, 2022
Abstract. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat oxidatieve stress en autofagie leiden tot acutenierbeschadiging (AKI) tijdens sepsis en microRNA (miR)-214 speelt een vitale rol bij de bescherming vannierenblootgesteld aan oxidatieve stress. De huidige studie was bedoeld om te testen of de renoprotectie van miR-214 gerelateerd is aan autofagie bij sepsis. De rol van autofagie werd onderzocht in een muismodel van cecale ligatie en punctie (CLP). Omgekeerde transcriptie-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) werd gebruikt om de expressie van miR-214 te analyseren. De structuur en functie vannierengeoogst van de muizen werden geëvalueerd.Nierautofagieniveaus werden gedetecteerd met immunohistochemische, immunofluorescente en western blotting. Er werd vastgesteld dat miR-214 AKI bij septische muizen kon verlichten door het niveau van te remmennierautofagie. Bovendien remde miR-214 autofagie door PTEN-expressie in denierweefsels van septische muizen. Deze bevindingen gaven aan dat miR-214 CLP-geïnduceerde AKI verbeterde door oxidatieve stress te verminderen en autofagie te remmen door de regulatie van de PTEN/AKT/mTOR-route.
trefwoorden:microRNA-214, sepsis, acuut nierletsel, autofagie, nier
Invoering acuutnierbeschadiging(AKI) is een van de meest voorkomende complicaties van sepsis en komt voor bij 40-50 procent van de septische patiënten, met een sterftecijfer van maar liefst 60 procent (1). De pathogenese van sepsis-geïnduceerde AKI blijft echter onduidelijk. Van autofagie is gemeld dat het een sleutelrol speelt bij sepsis-geïnduceerde AKI en de remming van autofagie resulteert in de ontwikkeling van AKI tijdens sepsis (2,3). Eerdere studies (4,5) hebben bevestigd dat sepsis autofagie veroorzaakt in meerdere organen, waaronder denier(6) en autofagische processen zijn betrokken bij de verwijdering van beschadigde mitochondriën en oxidatieve stress (7). Overmatige autofagie kan echter ongewenste en schadelijke celdood veroorzaken (8). Daarom is een gematigd niveau van autofagie de sleutel tot het verminderen van door sepsis veroorzaakte AKI. Eerdere studies hebben gemeld dat miR-214 ischemie-reperfusie-geïnduceerde AKI verbetert door apoptose te remmen (9) en miR-214 oxidatieve stress onderdrukt bij diabetische nefropathie via de reactieve zuurstofspecies (ROS)/AKT/mTOR-signaleringsroute (10). Uit de huidige studie bleek dat miR-214 door sepsis geïnduceerde myocardiale disfunctie bij muizen kan verzwakken door autofagie te remmen (11). Of miR-214 door sepsis veroorzaakte AKI kan verbeteren, moet echter nog worden opgehelderd. In de huidige studie werd verondersteld dat miR-214 door CLP geïnduceerde AKI verzwakt door oxidatieve stress te verminderen en autofagie te remmen door de regulatie van de PTEN/AKT/mTOR-route.
CISTANCHE ZAL NIER/NIIERZIEKTE VERBETEREN
materialen en methodes
Dieren.Een totaal van 100 Kunming mannelijke muizen (gewicht, 20,40 ± 2,92 g; leeftijd, 6-8 weken), geleverd door het Medical Laboratory Animal Center van de Hebei Medical University (Shijiazhuang, China) werden in de huidige studie gebruikt. Alle muizen werden geacclimatiseerd aan een 12-uurs licht/donker cyclus bij 24˚C met een luchtvochtigheid van 50 procent en kregen vrije toegang tot voedsel en water bij groter dan of gelijk aan 1 week voor de experimenten. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH-publicatie nr. 85‑23, herzien in 1996) en met goedkeuring door de institutionele dierenzorg- en gebruikscomités van het Cangzhou Central Hospital (goedkeuringsnr. 2017‑020‑ 01). Alle operaties werden uitgevoerd onder verdoving en er werd alles aan gedaan om het lijden tot een minimum te beperken.
Cecal ligatie en punctie (CLP).CLP werd uitgevoerd op muizen om een murine sepsismodel te creëren, zoals eerder beschreven (12). Na verdoving door inhalatie van isofluraan (geïnduceerd met 3 procent en gehandhaafd op 0,5 procent), werd een incisie van 1 cm in de middellijn gesneden. De blootgestelde blindedarm (1 cm afstand van het uiteinde) werd afgebonden met twee puncties met een 23-gauge naald. De blindedarm extrudeerde voorzichtig een kleine hoeveelheid uitwerpselen en werd teruggeplaatst in zijn anatomische positie. De buikwand werd in lagen gehecht met een 3-0 zijden vlecht. Na de procedure werd subcutaan 1 ml 0,9 procent zoutoplossing geïnjecteerd. De muizen kregen gratis toegang tot alleen water. Sham-modelmuizen werden op dezelfde manier gebruikt als het CLP-model zonder CLP.
Experimenteel ontwerp. Muizen (n=6 voor schijnchirurgie en CLP) werden willekeurig toegewezen aan zeven groepen: schijngroep, CLP-groep, adenovirus (Ad)-groen fluorescerend eiwit (GFP) plus CLP-groep, Ad-miR-214 plus CLP-groep , anti‑miR‑214 plus CLP-groep, PTEN-remmer plus CLP-groep en Ad‑miR‑214 plus PTEN-remmer plus CLP-groep. De muizen van de Sham-groep werden blootgesteld aan dezelfde procedure, maar zonder ligatie en punctie van de blindedarm. Muizen in de andere groepen kregen cecale ligatie en perforatie. Alle muizen werden snel verdoofd door inhalatie van isofluraan om bloed, urine enniermonsters 24 uur na de laatste behandeling.
Adenovirus-gemedieerde Ad-miR-214, anti-miR-214 of Ad-GFPgenoverdracht in vivo en injectie van PTEN-remmer. Ad‑miR‑214, anti‑miR‑214 of Ad‑GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) werd 4 dagen voorafgaand aan CLP in de buikholte van muizen afgeleverd. In het kort werden muizen verdoofd door inademing van isofluraan. Een katheter met 200 µl adenovirus (2x1011 pfu, die miR-214, anti-miR-214 of Ad-GFP tot expressie brengt) werd toegediend aan normale muizen via intraperitoneale injectie. De PTEN-remmer (VO‑OHpic, intraperitoneaal, Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) werd toegediend aan CLP-muizen die anti‑miR‑214 hadden gekregen via intraperitoneale injectie in een enkele dosering van 10 µg/kg 30 min voorafgaand aan de toediening van adenovirus .
Beoordeling van de nierfunctie. Bloedmonsters werden geoogst uit het hart van de muis, gevolgd door centrifugatie (bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 3,000 xg) voor het verzamelen van serum. De serumniveaus van bloedureumstikstof (BUN) en serumcreatinine (Cr) werden bepaald met behulp van een Hitachi 7600 automatische analysator (Hitachi, Ltd.). ELISA werd gebruikt om niveaus vannierbeschadigingmolecule-1 (KIM-1; cat. no. RKM100; R&D Systems, Inc.) en neutrofiel gelatinase-geassocieerde lipocaline (NGAL; cat. no. DY3508; R&D Systems, Inc.) in urinemonsters.
Assay voor cytokine van serumontsteking.Serum TNF‑ (cat.nr. H052) en IL‑6 (cat.nr. H007) werden onderzocht met behulp van commerciële ELISA-kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) volgens de instructies van de fabrikant.Meting van markers voor oxidatieve stress. De bijbehorende testkit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) werd gebruikt om de niveaus van malondialdehyde (MDA) te meten en de activiteit van superoxide-dismutase (SOD) te testen in overeenstemming met de instructies van de fabrikant.
Histologie en tubulaire letselscore. Alle muizen werden onderworpen aannierperfusie onder verdoving 24 uur na CLP. Deniermonsters werden 72 uur bij 4 ° C in 4 procent paraformaldehyde gefixeerd. De weefselmonsters werden vervolgens gedehydrateerd in een gegradeerde reeks ethanoloplossingen, ingebed in paraffine en in coupes van 4 µm gesneden. Secties (4 µm) werden gesneden met behulp van een microtoom en de weefselsecties werden gekleurd met hematoxyline (5 min) en eosine (1 min) bij kamertemperatuur voor histologisch onderzoek. De objectglaasjes werden geëvalueerd en beoordeeld met behulp van een microscoop (BX51, Olympus Corporation).niertissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 procent (13).
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).Versnierenwerden gewassen in met fosfaat gebufferde zoutoplossing en in blokjes van 1 mm gesneden en achtereenvolgens gefixeerd in 2,5 procent glutaaraldehyde gedurende 24 uur bij 4 ° C. De coupes werden gedurende 2 uur bij 4°C ondergedompeld in 1 procent osmiumtetroxide, gedehydrateerd in ethanol en ingebed in epoxyhars. Ten slotte werden de ultradunne coupes (60 nm) verdubbeld gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat bij 20 ° C gedurende 60 minuten. De waarneming werd uitgevoerd op een transmissie-elektronenmicroscoop (Tecnai; Hitachi, Ltd.) bij 80 kV met behulp van elektronenmicroscopiefilm 4489 (ESTAR dikke basis; Kodak).
Immunohistochemie (IHC).Versnierweefsels werden gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde (gedurende 72 uur bij 4 ° C) en ingebed in paraffine. Monsters werden in coupes van 4 µm dik gesneden en gedeparaffineerd in xyleen. Nadat weefselcoupes waren gewassen met PBS, werden ze gedurende 4 minuten gekookt in 10 mM citraatbuffer (pH 6.0) voor het ophalen van antigeen en vervolgens geblokkeerd met 10 procent geitenserum in PBS bij kamertemperatuur voor 1 u. Het primaire antilichaam (anti-LC3B; 1:400; cat. no. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) werd toegevoegd in overeenstemming met de instructies en gedurende 12 uur bij 4 C geïncubeerd. Het secundaire antilichaam (geitenantikonijn HRP; 1:2, 000; cat. nr. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) werd toegevoegd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. DAB (100 µl) werd toegevoegd en gedurende 5 minuten tegengekleurd, waarbij de kleuring werd waargenomen onder een lichtmicroscoop (model CX31-P; Olympus Corporation). De intensiteit van positieve kleuring, die bruin leek, werd bepaald met behulp van Image‑Pro Plus 6.0 beeldanalysesoftware (Media Cybernetics, Inc.). De integrale optische dichtheid (IOD) werd berekend om de intensiteit weer te geven. IOD-waarden namen toe naarmate de eiwitexpressie toenam.
Omgekeerde transcriptie-kwantitatief(RT‑q) PCR. Totaal RNA werd geëxtraheerd uitnierweefselna de inductie van het model met behulp van TRIzol-reagens (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Volgens de instructies van de TaqMan reverse transcriptiekit (cat. nr. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), werd RNA omgekeerd getranscribeerd in cDNA. De volgende thermocycling-omstandigheden werden gebruikt (miR-214): initiële denaturatie bij 95˚C gedurende 5 minuten; gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95˚C gedurende 30 seconden, uitgloeien bij 60˚C gedurende 30 seconden en verlenging bij 72˚C gedurende 30 seconden. RT‑qPCR werd uitgevoerd met behulp van een ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) en een standaard SYBR Green PCR-kit (Toyobo Life Science). U6 werd gebruikt als interne controle voor miR-214. De primersequenties waren als volgt: miR-214, forward, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' en reverse, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, vooruit, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' en achteruit, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Deze experimenten werden zes keer herhaald. De resultaten werden geanalyseerd met behulp van de 2-ΔΔCq-methode (14). De mRNA-expressieniveaus van LC3, p62, PTEN, AKT en mTOR werden geëvalueerd via RT-qPCR. Met ‑actine als interne referentie van deze genen, werd de 2-ΔΔCq gebruikt om de relatieve expressie van doelgenen te meten. De in tabel I getoonde primersequenties werden gesynthetiseerd door Sangon Biotech Co., Ltd.
Western-blotting. Nierweefsel werd gemengd met RIPA-lysaat (Beyotime Institute of Biotechnology) om het homogenaat te maken en de lysis werd gestopt toen er geen zichtbaar weefsel werd waargenomen. De monsters werden gedurende 10 minuten bij 13,000 xg bij -4 °C gecentrifugeerd en het supernatant werd teruggewonnen voor de western-blot-analyse. In het kort werden eiwitconcentraties bepaald met behulp van de micro BCA-eiwittestkit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eiwitmonsters (80 µg per monster) werden gescheiden door 12 procent natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese te reduceren en vervolgens overnacht bij 4˚C op polyvinylideendifluoridemembranen overgebracht. Gescheiden eiwitten werden overgebracht naar PVDF-membranen. Na blokkering van 5 procent magere melk bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, werden de membranen een nacht (bij 4°C) geïncubeerd met primaire antilichamen. De volgende primaire antilichamen (allen Cell Signaling Technology, Inc.) werden gebruikt: lichte keten 3B (1:1,000; cat. no. 4412), p62 (1:1,000; cat. nr. 4412), Anti-PTEN (1:1,000; cat.nr. 9188), anti-gefosforyleerd (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; cat .nr. 4060), anti-AKT (1:1,000; cat.nr. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat.nr. . 5536), anti‑mTOR (1:1,000; cat.nr. 2972) en ‑actine (1:2,000; cat.nr. 4970). Na het wassen werden de membranen geïncubeerd (bij kamertemperatuur gedurende 2 uur) met de HRP-geconjugeerde anti-konijn secundaire antilichamen (1:3,000; cat. nr. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Eiwitbanden werden gedetecteerd met Immobilon Western (MilliporeSigma) en geanalyseerd met behulp van Total-Lab TL120-software (Nonlinear Dynamics, 2.01). De expressie van eiwit werd genormaliseerd naar -actine.
Statistische analyse. Statistische analyse werd uitgevoerd met de GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviatie of medianen (interkwartielbereiken) voor continue variabelen, afhankelijk van hun distributies. Basislijnkenmerken en uitkomsten werden vergeleken met behulp van one-way ANOVA gevolgd door Tukey's posthoc-test, of Kruskal-Wallis-test gevolgd door Dunn's test, indien van toepassing. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultaten
Tijdstip 24 uur na CLP. Eerdere studies hebben gemeld (6,15,16) dat biochemische (dwz LC3- en p62) analyse onthult dat autofagieflux wordt onderdrukt met progressie van sepsis na 6-8 uur CLP. In de huidige studie is het aantal autolysosomen in deniervan met CLP behandelde muizen nam binnen 24 uur na de operatie toe. Daarnaast is de analyse van markers vannierbeschadigingliet zien datnierfunctiewerd het meest ernstig beschadigd 24 uur na CLP. Daarom werd het tijdstip 24 uur na CLP gekozen voor de volgende experimenten.
Regelgevend effect op miR-214 in nierweefsel. RT-qPCR-analyse werd gebruikt om miR-214-expressie te detecteren in met CLP behandelde muizen. Er werd gevonden dat miR-214-expressie enigszins opgereguleerd was in denierweefsels na CLP-operatie 24 uur, in vergelijking met de sham-groep (1,47-voudig, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">nierweefsel, in vergelijking met de schijngroep (beide P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE ZAL NIER-/NIERSTORING VERBETEREN
Effect van miR-214 op nierdisfunctie bij septische muizen.Alle muizen werden opgeofferd om bloed, urine enniermonsters 24 uur na de CLP-operatie. BUN en Cr zijn belangrijke indicatoren voor de ernst vannierbijzondere waardevermindering (17). Verder zijn NGAL en KIM-1 geïdentificeerd als specifieke biomarkers vannierbeschadigingen hun verhoogde expressie wordt geassocieerd met vroegeniertubulair letsel bij AKI (17). Zoals getoond in Fig. 2A-D waren de niveaus van BUN, Cr, KIM-1 en NGAL significant verhoogd na CLP-chirurgie in vergelijking met de sham-groep. Ad‑miR‑214 verlaagde de BUN-, Cr-, KIM‑1‑ en NGAL-niveaus echter aanzienlijk in vergelijking met de CLP-groep (alle P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">nierfunctieparameters. Na voorbehandeling met PTEN-remmer werden de beschermende effecten van Ad‑miR‑214 echter versterkt. De resultaten laten zien dat miR-214 nierdisfunctie bij septische muizen vermindert.
Effect van miR-214 op nierontsteking en oxidatieve stress.Zoals getoond in Fig. 3A en B, verhoogde CLP de niveaus van TNF‑ en IL‑6 significant, terwijl Ad‑miR‑214 de niveaus van deze markers significant verlaagde. Vergeleken met de
Effect van miR-214 op renale autofagie bij septische muizen.De huidige studie onderzocht de veranderingen in LC3 innierweefsels via IHC-kleuring. Zoals getoond in Fig. 6, nam de LC3-intensiteit van positieve kleuring significant toe in de CLP-groep vergeleken met de schijngroep (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 activeert de AKT/mTOR-route om te remmenautofagie door PTEN in nierweefsels tot zwijgen te brengen.Het effect van CLP op autofagie innierweefsels werd onderzocht door de niveaus van LC3-II/I en p62 te bepalen. De PTEN/AKT/mTOR-signaleringsroute speelt een belangrijke rol bij autofagie (18). Om het effect van miR-214 op de PTEN-AKT/mTOR-route te onderzoeken, werden de eiwitniveaus van LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR en PTEN geanalyseerd door middel van western blotting en RT- qPCR-analyse. Zoals getoond in Fig. 7A-C, vindt modificatie in deze eiwitten snel plaats, met een toename van de snelheid van LC3-II/LC3-I en verlaging van de niveaus van p62 (beide P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">nier tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Deze resultaten toonden aan dat autofagie werd geïnduceerd door CLP en dat de overexpressie van miR-214 dit gedeeltelijk zou kunnen remmen.
Zoals getoond in Fig. 7A en D-F, is het expressieniveau van PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">nier tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Deze bevindingen suggereren dat CLPnierweefselautofagie door de AKT / mTOR-route te remmen. Ad‑miR‑214 activeerde de AKT/mTOR-route door PTEN in . uit te schakelennierweefsels. In vergelijking met de CLP-groep remde anti-miR-214 echter niet significant de expressie van mTOR. Daarom werd RT-qPCR verder gebruikt om de expressie van mRNA van genen gerelateerd aan de PTEN/AKT/mTOR-signaleringsroute te bepalen. Volgens de resultaten van RT-qPCR (Fig. 8) waren de mRNA-expressieniveaus van p62, LC3 en PTEN in vergelijking met de Sham-groep aanzienlijk verhoogd, terwijl de mRNA-expressie van AKT en mTOR in de CLP-groep was verlaagd. Vergeleken met de CLP-groep, de Ad‑miR‑214, PTEN
remmer- en Ad-miR-214 plus PTEN-remmergroepen vertoonden verminderde mRNA-expressie van LC3 en PTEN, maar verhoogde mRNA-expressie van p62, AKT en mTOR (alle P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Het effect van p62 op autofagie kan dus optreden op transcriptioneel niveau in plaats van op posttranscriptioneel niveau. De huidige resultaten toonden aan dat miR-214 de expressie van PTEN downreguleerde en de AKT/mTOR-signaleringsroute activeerde.
Discussie
Uit de huidige studie bleek dat overmatige autofagie schadelijk was voor:nierfunctiebij septische muizen. Eerdere studies hebben aangetoond dat miR-214 geassocieerd is met verhoogde proliferatie, metastase, invasie en functioneert als een oncogen voor cellen en weefsels (19-22). Studies melden dat miR-214 een beschermende rol speelt tegen AKI door apoptose, oxidatieve stress en downregulerende ontstekingsfactoren te verminderen (21,23). De huidige studie onderzocht verder de mechanismen die ten grondslag liggen aan het beschermende effect van miR-214 op sepsis-geïnduceerde AKI door te focussen op de mogelijke betrokkenheid van miR-214 bij de modulatie van autofagie. De resultaten toonden aan dat oxidatieve stress optrad in denierna de toediening van een CLP-operatie. Ondertussen vindt de activering van autofagie plaats in denier.Verhoogde LC3 II/I en de reductie van p62 in denierwerd waargenomen na behandeling met CLP-chirurgie. Zoals verwacht nam de overexpressie van miR-214 aanzienlijk afnierpathologische verwondingen ennierdisfunctie veroorzaakt door sepsis. De remming van miR-214 vertoonde echter een tegenovergestelde neiging tot renoprotectie. Bovendien werd het beschermende effect van Ad‑miR‑214 versterkt door PTEN-remmer.
in een septicnierOvermatige ontsteking gaat gepaard met een enorme toename van de productie van ROS en een groot aantal ROS veroorzaakt veranderingen in de mitochondriale structuur en schaadt de mitochondriale functie, waardoor het lichaam in een vicieuze cirkel terechtkomt die verergertnierschade (24,25). Daarom kan oxidatieve stress een van de belangrijkste pathologische mechanismen zijn van door sepsis geïnduceerde AKI. De huidige studie leverde verder bewijs dat overmatige oxidatieve stress aantoonde, wat werd aangegeven door verhoogde MDA-productie en verminderde SOD-activiteit in denierweefsels na een CLP-operatie. Bovendien bleek dat de overexpressie van miR-214 deniertegen CLP-geïnduceerde oxidatieve schade, die betrokken is bij autofagische remming. Dit komt overeen met de eerdere onderzoeken dat miR-214 verschillende cellen en weefsels beschermt tegen oxidatieve stress (26,27).
Autofagie dient als een 'tweesnijdend zwaard' bij de ontwikkeling van sepsis: basale autofagie kan beschermende effecten uitoefenen door toxische oxidatieve eiwitten te verwijderen, maar overmatige autofagie kan leiden tot autofagische celdood onder ernstige stress, zoals ROS-uitbarsting (28,29) . Het is aangetoond dat autofagie aanvankelijk wordt geactiveerd bij sepsis, gevolgd door een volgende fase van disfunctie als gevolg van autofagische celdood (30), wat door sepsis veroorzaakte oxidatieve schade verergert. In de huidige studie vertoonde PTEN-remmer of overexpressie van miR-214 antioxidatieve renoprotectie bij met CLP behandelde muizen. De remming van miR-214 vertoonde echter een tegengestelde neiging tot antioxidatieve renoprotectie. Dus overmatige of ontoereikende autofagie kan leiden tot:nierschade; beide zijn onaangepast en veroorzaken uiteindelijk celdood. Daarom is het behouden van gematigde niveaus van autofagie de sleutel om oxidatieve schade in septische toestand te verminderen.
CISTANCHE ZAL NIER/NIERENPIJN VERBETEREN
Er is steeds meer bewijs dat miR-214 autofagie in verschillende cellen en weefsels remt (31-33). In de huidige studie bleek de overexpressie van miR-214 door CLP geïnduceerde autofagie te remmennier weefsels,zoals aangegeven door de veranderingen in eiwitmarkers, zoals LC3-II/I en p62. Bovendien toonden de resultaten aan dat overexpressie van miR-214 door CLP geïnduceerde oxidatieve schade verzwakte door overmatige autofagie te remmen. De huidige studie onderzocht ook de moleculaire mechanismen waarmee miR-214 moduleertnierautofagie bij sepsis-geïnduceerde AKI. PTEN/AKT/mTOR is een belangrijke signaalroute die denierautofagie (34,35) en dat een sleutelrol speelt bij sepsis-geïnduceerde AKI, en PTEN is een negatieve remmer van de PI3K/AKT/mTOR-signaleringsroute. Eerdere studies meldden dat miR-214 autofagie kan reguleren via de PI3K/AKT/mTOR-signaleringsroute in verschillende modellen (36-38). Ma et al (39) ontdekten dat miR-214 autofagie in diabetische nieren kan neerwaarts reguleren. Daarom werd verondersteld dat de effecten van miR-214 op CLP-geïnduceerde AKI betrokken zouden kunnen zijn bij de regulatie van de PTEN/AKT/mTOR-route. De resultaten van de huidige studie toonden met name aan dat CLP-chirurgie de niveaus van PTEN significant verhoogde, maar de niveaus van p-AKT en p-mTOR verlaagde, wat aangeeft dat CLP-chirurgie de AKT/mTOR-route inactiveerde. Bovendien activeerde de overexpressie van miR-214 de AKT/mTOR-route door het tot zwijgen brengen van PTEN in CLP-geïnduceerde autofagie innierweefsels. Anti-miR-214 remde echter niet significant de expressie van mTOR in western-blot-analyses. Zo werd RT-qPCR verder gebruikt om de expressie van mRNA van genen gerelateerd aan de PTEN/AKT/mTOR-signaleringsroute te bepalen. De huidige studie identificeerde dat miR-214 de expressie van PTEN neerwaarts reguleerde en de AKT / mTOR-signaleringsroute activeerde om autofagie te remmen. Er moeten echter verdere uitgebreide studies worden uitgevoerd om aanvullende details te verkrijgen met betrekking tot het mechanisme vannierautofagie in septische toestand.
Concluderend suggereerden de resultaten van de huidige studie dat miR-214 een beschermende rol speelde tegen sepsis-geïnduceerdenierbeschadigingdoor oxidatieve stress te verminderen en autofagie te remmen door regulatie van de PTEN/AKT/mTOR-route. De huidige bevindingen suggereerden dat miR-214 een potentieel therapeutisch doelwit kan zijn voor sepsis-geïnduceerde AKI. De huidige studie gebruikte echter muizen van 6-8 weken oud, dus verder onderzoek naar het mechanisme van miR-214 is nodig bij volwassen muizen.