Mitochondriale membraanstabilisatie door Angelica Sinensis Polysaccharide bij aplastische anemie bij muizen

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstract

Om het mechanisme van mitochondriale membraanstabilisatie door Angelica Sinensis polysaccharide (ASP) in muizen aplastische anemie (AA) te onderzoeken, werden ICR-muizen willekeurig verdeeld in controle. AA- en ASP-behandelde groepen De AA-groep muizen werden behandeld met 60Co Y en intraperitoneale injecties van cyclofosfamide en chlooramfenicol. De controledieren werden behandeld met bestraling met loodafscherming en injectie met zoutoplossing. De behandelde AA-muizen werden gedurende 2 weken met ASP gevoed. Mitochondriale ultrastructuur van het beenmerg werd waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie, en het transmembraanpotentieel van beenmerg-nucleaire cellen (BMNC) werd onderzocht met fluorescentiespectrofotometrie. De Cox- en MDH-inhoud van het medium werden ook bestudeerd in de drie groepen. Het mitochondriale aantal en transmembraanpotentieel van BMNC in het beenmerg nam af in de AA-groep in vergelijking met de controlegroep, maar verbeterd in de met ASP behandelde groep in vergelijking met de AA-groep. Volledige mitochondriale splitsing in de met ASP behandelde groep was significant vertraagd (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Trefwoorden: aplastische anemie, Angelica Sinensis-polysaccharide, mitochondriën, membraanpotentiaal, ICR-muizen

cistanche-extract: stimuleert de botvorming en verhoogt de botdichtheid

Achtergrond

Aplastische anemie (AA) is een bloedziekte waarbij het beenmerg en de bijbehorende bloedstamcellen beschadigd zijn, waardoor er een tekort aan rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes ontstaat. Deze tekortkomingen zijn afzonderlijk bekend als respectievelijk anemie, leukopenie en trombocytopenie, en gezamenlijk bekend als pancytopenie. Blootstelling aan chemicaliën, medicijnen, straling, radioactieve materialen, stralingsproducerende apparaten, infectie. immuunziekte, erfelijkheid (in 50 procent van de gevallen) en onbekende etiologie kunnen ook leiden tot de ontwikkeling van AA.

Mitochondriën worden beschouwd als de "krachtcentrales van de cel" omdat ze adenosinetrifosfaat (ATP) produceren door systematisch energie te extraheren uit voedingsmoleculen (substraten) [1]. Bovendien wordt mtDNA met een hoge mutatiesnelheid gerepliceerd omdat het geen beschermende histonen en een effectief DNA-reparatiesysteem heeft. Mutaties in mtDNA zijn geassocieerd met hematologische ziekten zoals verworven sideroblastische anemie, myelodysplastische syndromen en verworven AA [2-4]. Onze eerdere studie 5] toonde aan dat functionele verslechtering van de mitochondriale ademhalingsketen veroorzaakt door mutaties mogelijk betrokken is bij hematopoëtisch falen bij AA-patiënten. Ongeacht de morfologische kenmerken van celdood in het eindstadium (apoptotisch, necrotisch, autofagisch of mitotisch), is mitochondriale membraanpermeabilisatie (MMP) vaak de beslissende gebeurtenis tussen overleving en dood [6]

Volgens de traditionele Chinese geneeskunde helpt Angelica Sinensis bij het verenigen van het bloed en het bevorderen van de bloedsomloop [7]. Recente studies hebben aangetoond dat extracten van Angelica Sinensis anti-oxidatieve en neuroprotectieve effecten hebben [8,9]. De anti-oxidatieve functie van ASP blijft echter onduidelijk. Deze studie onderzocht de vroege celbeschadiging met behulp van de mitochondriale lysistijdcurve en het mitochondriale membraanstabiliserende effect van ASP in AA.

cistanche-supplement verhoogt de botdichtheid en stimuleert de botvorming

Materialen en methodes

Groeperen van dieren

Gezonde mannelijke ICR-muizen, met een gewicht van 18-22 g, met een leeftijd van 6-8 weken, werden geleverd door het Experimental Animal Centre van de Shandong University (China). De dieren werden gehuisvest in een warme, rustige omgeving met vrije toegang tot voedsel en water. en geacclimatiseerd gedurende een week voor het begin van de experimenten.

De muizen werden willekeurig verdeeld in drie groepen: respectievelijk normale groep, AA-groep en behandelde groep. Het aplastische anemiemodel werd gegenereerd zoals eerder beschreven [10].

In het kort werden de muizen bestraald met 2.0Gy 60Coy en vervolgens behandeld met dagelijkse intraperitoneale injecties van 40 mg/kg/dag cyclofosfamide en 50 mg/kg/dag chlooramfenicol gedurende de volgende drie dagen. De behandelde groep werd intragastrisch gevoed met ASP (200 mg/kg/d, volgens de Chinese Medical Dictionary). De controlegroep en de AA-groep muizen werden intragastrisch gevoed met fysiologisch zout (10 ml/kg/d) aangevuld dieet. Bovendien kregen alle muizen tijdens het onderzoek een standaarddieet. Na behandeling met ASP of fysiologische zoutoplossing gedurende 2 weken werden de muizen opgeofferd door cervicale dislocatie.

Hematologisch onderzoek

De staartbloedmonsters van de drie groepen werden respectievelijk op de eerste en veertiende dag verzameld. WBC en bloedplaatjes werden geteld in de perifere bloedmonsters en Hb-spiegels werden bepaald. Na voltooiing van de experimenten werden de muizen opgeofferd en werden femur-uitstrijkjes voorbereid voor differentiële telling van beenmerg-nucleaire cellen (BMNC's) (Figuur 1).

Transmissie elektronenmicroscopie

Het dijbeenmerg werd uitgesmeerd en in ultradunne plakjes gesneden. Mitochondriën van hematopoëtische cellen in het dijbeenmerg werden geanalyseerd en geteld door transmissie-elektronenmicroscopie (JEM-2000EX, Japan) onder 50 gezichtsvelden.

Mitochondriale lysistijdcurve

Mitochondriën werden geëxtraheerd uit muizen-BMNC's volgens het protocol van de fabrikant van de mitochondria-isolatiekit (Pierce Biotechnology Inc., VS). De concentratie van monoamineoxidase (MAO) geeft de concentratie van mitochondriën aan en werd bepaald met behulp van 200 U/ml mitochondriale suspensies van 20 serumkweken, binnen 12 uur op verschillende tijdstippen (intervallen van 30 minuten). Ook werd het gehalte aan cytochroomoxidase (Cox) en malaatdehydrogenase (MDH) in het medium bepaald. De piektijdanalyse van het mitochondriale membraan en matrixspecifieke enzymconcentratie-tijdcurves toonde de mate van mitochondriale membraanlysis.

Mitochondriaal membraanpotentiaal

Na pre-incubatie met MAO of ASP werden de geïsoleerde mitochondriën van de drie groepen geresuspendeerd in 0,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., China) en 10 ul rhodamine 123 werkoplossing ( Sigma-Aldrich, VS) werd toegevoegd en geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 15 min. Het mitochondriale membraanpotentieel werd geanalyseerd door flowcytometrie met behulp van een excitatiegolflengte van 490 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.

statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 19.0-software. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden en standaarddeviaties. De t-toets van de student werd gebruikt om de verschillende groepen met elkaar te vergelijken. P < 0,05="" werd="" als="" statistisch="" significant="">

cistanchekruid: voor een betere botkwaliteit

Resultaten

Perifere bloed- en BMC-tellingen

Met behulp van een volautomatische bloedcelanalysator bleek het aantal perifere bloedcellen en BMC's in de AA-muizen aanzienlijk te zijn afgenomen (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Mitochondriale ultrastructuur bij muizen met aplastische anemie

Transmissie-elektronenmicroscopie van het beenmerg van AA-muizen toonde aan dat de mitochondriale ultrastructuur significant verbeterde met ASP in de behandelde groep (Tabel 2 en Figuur 1), wat aangeeft dat ASP de mitochondriën in AA-muizen stabiliseert. De grootte en vorm van de mitochondriën van de controlegroep waren normaal. In tegenstelling tot. de mitochondriën van de AA-groep hadden bolvormige structuren vergroot, samen met de verstoring of verdwijning van cristae (Figuur 1A-C).

Mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP) bij muizen met aplastische anemie

Omdat transmissie-elektronenmicroscopie mitochondriale schade aan het licht bracht, bepaalden we het effect van ASP op de MMP in AA-muizen door de relatieve verschillen in de fluorescentie van Rh 123 tussen de drie groepen te meten met behulp van een fluorescentiespectrofotometer.

De resultaten toonden aan dat de Rh 123-fluorescentie van beenmergcellen in de AA-groep (19,6 ± 3,03) lager was dan die in de controlegroep (31,7 ± 2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Vroege celbeschadiging mitochondriale lysistijdcurve

In de controlegroep had de inhoud van de mitochondriale in vitro kweek Cox en MDH 3,5 uur nodig om de piek te bereiken. Het MAO-gehalte in de kweek veranderde in de loop van de tijd niet significant, maar het COX- en MDH-gehalte nam met de tijd geleidelijk toe, bereikte een piek en nam vervolgens geleidelijk af. Dus de volledige mitochondriale inhoud die door cellen werd vrijgegeven, duurde ongeveer 3,5 uur om de splitsingspiek te bereiken.

De COX- en MDH-pieken in de AA-groep waren respectievelijk 1,5 uur, 1,375 U/, 36,732 U/l. De COX- en MDH-pieken in de behandelde groep waren respectievelijk 5,5 uur, 6,5 uur, 1,341 U/l, 33,994 U/. Twee sets gegevens op elk tijdstip werden gebruikt voor statistische analyse. Na 1,5 uur waren de COX- en MDH-spiegels in de AA-groep significant hoger dan in de behandelde groep (P <0.05). daarom="" werd="" de="" volledige="" mitochondriale="" splitsing="" in="" het="" serum="" aanzienlijk="" vertraagd="" na="" de="" toevoeging="" van="" asp="" (p=""><0,05), met="" een="" lichte="" afname="" van="" de="" piek="" (figuur="">

Discussie

Aplastische anemie (AA) is een beenmergfalensyndroom dat wordt gekenmerkt door perifere pancytopenie en merghypoplasie. Mutaties en instabiliteit van mtDNA zijn aangetoond bij verschillende ziekten. Mitochondriale disfunctie en een afname van het aantal mitochondriën kan resulteren in de vermindering van mtDNA. Er is gevonden dat verworven deleties van mtDNA in het hematopoëtische compartiment optreden bij ernstige pancytopenie en reticulocytopenie [11]. Op basis van ons eerdere onderzoek [5] hebben we onderzocht of ASP het mitochondriale membraan van AA-muizen kan stabiliseren.

Angelica Sinensis polysaccharide-ijzercomplex (APIC) heeft niet alleen een superieur therapeutisch effect op IDA, maar ook op het aanvullen van bloed en het bevorderen van de bloedcirculatie [12]. ASP kan nuttig zijn voor de behandeling van ziekten die worden veroorzaakt door overexpressie van hepcidine door het voorkomen van de Janus-kinase (JAK), zoon van moeders tegen extracellulaire decapentaplegische (SMAD) en 1-signaal-gereguleerde kinase (ERK)-routes om de hepcidine-expressie in IDA-ratten te downreguleren [13 ]. Qin J ontdekte dat ASP de proteoglycan (PG) synthese van chondrocyten in rat OA-model in vivo en IL-1B-gestimuleerde chondrocyten in vitro kan verbeteren door de expressie van aggrecan en GT's die betrokken zijn bij PG-synthese te bevorderen [14].

In onze studie werd het AA-muismodel geïnduceerd door een combinatie van acetylfenylhydrazine, röntgenstralen en cyclofosfamide. De AA-muizen vertoonden statistisch significante reducties in perifere bloedleukocyten, Hb en bloedplaatjes (Tabel 1), en ernstige reducties in humerusmergcellen en merg-gecommitteerde progenitorcellen, die klinische kenmerken zijn van AA. De met ASP behandelde AA-muizen vertoonden een progressieve toename van BM-cellen in vergelijking met de AA-groep. Bovendien werd ook het aantal mitochondriën in de hematopoëtische cellen beïnvloed. ASP resulteerde in een significant hoger aantal mitochondriën in de behandelde groep in vergelijking met de AA-groep (Figuur 1). Deze resultaten toonden aan dat ASP de proliferatie van celkernhoudende mergcellen kan bevorderen, het aantal mitochondriën kan verhogen en het mitochondriale membraan in AA-muizen kan stabiliseren.

Mitochondriaal letsel wordt weerspiegeld door mtDNA-schade en een afname van de niveaus van mtRNA-transcripten, eiwitsynthese en mitochondriale functie, wat zou kunnen resulteren in verminderde cellulaire energie, verstoring van celsignalering en interferentie met cellulaire differentiatie en apoptose. Bovendien kan een gebrekkige mitochondriale ATP-productie chromosomale instabiliteit bevorderen [15]. Aangezien mtDNA codeert voor componenten van vier van de vijf mitochondriale ademhalingscomplexen, leiden veranderingen in mtDNA tot mitochondriale ziekte [16-18]. Afgezien van mitochondriale ziekte, zijn mutaties in mtDNA gekoppeld aan kanker, diabetes. hart-en vaatziekten. neurodegeneratieve aandoeningen, hematologische ziekten zoals leukemie en het normale verouderingsproces [19]. Belangrijk is dat mtDNA-mutaties, evenals een vermindering van het aantal mtDNA-kopieën, pathogeen kunnen zijn [20, 21]. Het begrijpen van cellulaire mechanismen voor het behoud van mtDNA-integriteit en het aantal kopieën is van het grootste belang, omdat het doelen kan bieden voor klinische interventies gericht op de preventie en behandeling van hematologische ziekten zoals AA. Deze factoren kunnen ook resulteren in een verminderd energiemetabolisme, wat de zelfvernieuwing en differentiatie van de hematopoëtische stamcellen zal beïnvloeden.

De bevindingen van de huidige studie tonen aan dat ASP de mitochondriale ultrastructuur kan verbeteren en de neerwaartse regulatie van transmembraanpotentieel en apoptose van myeloïde elementen kan onderdrukken om beenmergfalen te genezen.

Cistanche & cistanche-extract: past bij botten

Referenties

1 Chinnery PF, Schön EA. Mitochondriën. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mitochondriale DNA-mutaties in het hematopoëtische systeem. Leukemie 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Heteroplasmatische puntmutaties van mitochondriaal DNA die subeenheid I van cytochroom c-oxidase beïnvloeden bij twee patiënten met verworven idiopathische sideroblastische anemie.Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. mitochondriaal

4 . DNA-afwijkingen van beenmergcellen van patiënten met aplastische anemie. Koreaans Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Volledige reeks

5. analyse van mitochondriaal DNA en telomeerlengte bij aplastische anemie.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA induceert apoptose in menselijke longkanker A549-cellen door de inductie van reactieve zuurstofsoorten en het verminderen van het mitochondriale membraanpotentieel. Int J Mol Med 2010,25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Hematopoëtisch effect van in water oplosbare polysachariden van Angelica Sinensis op muizen met acuut bloedverlies. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Neuroprotectieve rol 8F van Z-ligustilide tegen ischemische schade aan de voorhersenen bij ICR-muizen. Hersenonderzoek 2006,1102:145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al.Radi Angelica Sinensis die de component Z-ligustilide bevat, bevordert de neurogenese bij volwassenen om herstel van cognitieve stoornissen te bemiddelen. Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Expressieniveau van IL-6 uitgescheiden door beenmerg-stromacellen bij muizen met aplastische anemie.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole voor mitochondriaal DNA in de pathogenese van stralingsgeïnduceerde myelodysplasie en secundaire leukemie.Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Effect van Angelica Sinensis polysaccharide-ijzercomplex op bloedarmoede door ijzertekort bij ratten. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. De werking van JAK-, SMAD- en ERK-signaalroutes op hepcidine-onderdrukking door polysachariden van Angelica Sinensis bij ratten met bloedarmoede door ijzertekort. Voedselfunctie2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Effect van Angelica Sinensis-polysacchariden op artrose in vivo en in vitro: een mogelijk mechanisme om de synthese van proteoglycanen te bevorderen. Op bewijs gebaseerde aanvulling Alternate Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mitochondriale DNA-mutaties in het hematopoëtische systeem. Leukemie 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Deleties van spier mitochondriaal DNA bij patiënten met mitochondriale myopathieën. Natuur 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayre-syndroom met mitochondriale DNA-deletie in de spieren. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mitochondriale DNA-mutatie geassocieerd met erfelijke optische neuropathie van Leber.Science 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Een mitochondriaal paradigma van metabole en degeneratieve ziekten, veroudering en kanker: een dageraad voor evolutionaire geneeskunde. Jaarverslag Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Aantal zaken: controle van mitochondriaal DNA-kopienummer van zoogdieren. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Genetische oorzaken van mitochondriale DNA-uitputting bij mensen. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

cistanche-extract: stimuleert de botvorming en verhoogt de botdichtheid