Neuroprotectieve voordelen van lichaamsbeweging en MitoQ op de geheugenfunctie, mitochondriale dynamiek, oxidatieve stress en neuro-ontsteking bij door D-galactose geïnduceerde ouder wordende ratten Deel 2

2.6. Weefselvoorbereiding

Na het voltooien van 8 weken TE- en geheugengedragstesten werden alle ratten geëuthanaseerd door CO2-inhalatie, en werd hersenweefsel geoogst van 7 dieren in elke behandelingsgroep.

Geheugengedragstest is een effectief hulpmiddel voor het evalueren van geheugen. Met de toenemende sociale en werkdruk wordt het geheugen van mensen steeds belangrijker. Daarom kan het doen van een geheugengedragstest ons helpen ons geheugenniveau te begrijpen en effectieve maatregelen te nemen om ons geheugen te verbeteren en te behouden op basis van de testresultaten.

Concreet kunnen geheugengedragstests het vermogen van mensen evalueren om informatie te ontvangen, verwerken, opslaan en ophalen. Door verschillende soorten informatie te testen, zoals taal, cijfers, afbeeldingen, enz., kan het geheugen van mensen volledig worden getest. De testresultaten zullen verschillende scores opleveren om ons te helpen onze zwakke en sterke punten te begrijpen, en hoe we ons geheugen kunnen versterken.

In de praktijk leveren veel geheugengedragstesten ook professionele tips en suggesties op. Goede slaap, een uitgebalanceerd dieet, goede lichaamsbeweging en regelmatige hersenoefeningen zijn bijvoorbeeld allemaal gunstig voor het verbeteren van het geheugen van mensen. Via deze methoden kunnen we onze geheugenretentietijd, ons geheugenreproductievermogen en andere aspecten verbeteren, zodat we ons beter kunnen aanpassen aan de behoeften van het dagelijks leven of op het werk.

Kortom, een geheugengedragstest is zeer nuttig voor het begrijpen, evalueren en verbeteren van het geheugen. We moeten ook passende methoden toepassen om ons geheugen te versterken, afhankelijk van onze feitelijke situatie, om een ​​solide basis te leggen voor een vervullender en rijker leven. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche een traditioneel Chinees medicinaal materiaal is met veel unieke effecten, waarvan er één het verbeteren van het geheugen is. Het effect van Cistanche komt van de verschillende actieve ingrediënten die het bevat, waaronder looizuur, polysachariden, flavonoïde glycosiden, enz. Deze ingrediënten kunnen op verschillende manieren de gezondheid van de hersenen bevorderen.

Klik op Weet hoe u uw kortetermijngeheugen kunt verbeteren

Na het scheiden van de hersenschors en de hippocampus werd hersenweefsel snel ingevroren in vloeibare stikstof en tot analyse bij -80 ◦C bewaard. De overige 5 dieren werden gebruikt voor immunohistochemische (IHC) analyse.

Na het openen van de borstholte werd 50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 10 minuten door de linker hartkamer gevoerd en vervolgens werd het dier geperfuseerd met 4% paraformaldehyde (PFA) in 100 mM PBS.

Na perfusiefixatie werden de hersenen geoogst, in 4% PFA geplaatst en gedurende 4 uur bij 4 °C gefixeerd. Het gefixeerde hersenweefsel werd gedurende 2 dagen ondergedompeld in 30% sucrose-oplossing en vervolgens in plakjes van 40 µm dik gesneden met behulp van een cryostaat ( Leica Microsystems, Nussloch, Duitsland).

2.7. Isolatie van mitochondriën

Om de mitochondriën te isoleren, gebruikten we een Mitochondria Extraction Kit (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Voor elke 100 mg hippocampusweefsel werd 1 ml homogeniserende buffer toegevoegd.

Na homogenisatie werd het weefsel gedurende 10 minuten bij 900 x g bij 4 ◦C gecentrifugeerd, en het supernatant werd verzameld en opnieuw 30 minuten bij 15,000 x g bij 4 ◦C gecentrifugeerd.

Door gebruik te maken van de gecentrifugeerde cytosolfractie werd het cytosol gescheiden en werd de resterende pellet grondig gemengd in 1 ml suspensiebuffer, alvorens 10 minuten bij 4 ◦C te centrifugeren bij 15,000× g.

Het supernatant werd verwijderd en nog eens 1 ml suspensiebuffer werd toegevoegd alvorens grondig te mengen en opnieuw 10 minuten bij 15,000× g en 4 ◦C te centrifugeren.

Het supernatant werd verwijderd en de resterende pellet werd gedurende 30 minuten bij 4 °C opgelost in 1 ml volledige mitochondriale lysisbuffer. Het mitochondriale extract werd vervolgens 5 minuten bij 4◦C gecentrifugeerd bij 15,{4}}× g, en het supernatant (mitochondriale fractie) werd verzameld.

2.8. Western-blotting
Het totale eiwit verkregen door mitochondriale isolatie werd gekwantificeerd met behulp van de Bradford-methode. Een gelijke hoeveelheid mitochondriale eiwitten (30 µg per baan) werd op natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) (8% of 12%) geladen.

Na elektroforese werden eiwitten overgebracht naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Millipore, Boston, MA, VS).

Het blokkeren werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd met behulp van 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing die Tween-20 (TBS-T)-oplossing met 5% BSA bevatte, en vervolgens liet men het membraan een nacht bij 4 °C reageren met primaire antilichamen.

De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalase en -actine (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS, verdunning: 1 :1000); en TNF- (Abcam, Cambridge, VK, verdunning: 1:1000).

De membranen werden vervolgens gewassen met een wasbuffer (PBS met 0.1% Tween 20), waarna ze werden geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde geit-anti-konijn secundaire antilichamen voor p22 phox, gp91 phox en TNF. - (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS, verdunning: 1:5000).

HRP-geconjugeerde geit-anti-muis secundaire antilichamen werden gebruikt voor Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, catalase en -actine (Santa Cruz Biotechnology, verdunning: 1:5000).

Eiwitexpressieniveaus werden gedetecteerd met behulp van het ECL Western blotting-detectiesysteem (Santa Cruz Biotechnology). De dichtheden van de ontwikkelde eiwitbanden werden geanalyseerd met behulp van het ChemiDoc XRS-gelbeeldvormingssysteem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS).

2.9. Immunohistochemie (IHC)
Voor IHC-analyse werd de vrij zwevende methode gebruikt voor het geselecteerde weefsel in elke behandelingsgroep. Na het weefsel 3x gedurende 10 min elk in 0.01 M PBS te hebben gewassen, werd het weefsel gedurende 60 minuten bij 80 ◦C geïncubeerd in een bekerglas met 0,01 M natriumcitraat, gevolgd door blokkeren in 10% normaal ezelserum (Millipore Sigma, Burlington, MA, VS).

Het weefselmonster werd vervolgens gedurende 12 dagen gereageerd met primaire antilichamen anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, verdunning: 1:500) en anti-Glial fibrillary acidic Protein (GFAP) (Abcam, verdunning: 1:500). u bij 4 ◦C. De volgende dag werd het weefsel elk 3 x gedurende 5 minuten gewassen in 0,01 M PBS en vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gereageerd met HRP-geconjugeerd geit-anti-muis secundair antilichaam (Santa Cruz Biotechnology, verdunning: 1:5000).

Ten slotte werd het weefsel bij kamertemperatuur geïncubeerd met behulp van een Vectastain-Elite ABC-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, VS) oplossing, en de resultaten werden gevisualiseerd met behulp van de DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories).

Elke weefselplak werd met behulp van een montagemedium (Vector Laboratories) op een objectglaasje gemonteerd en geïnspecteerd met behulp van een lichtmicroscoop (Leica Microsystems).

2.10. Statistische analyses

Gegevens werden geanalyseerd met SPSS voor Windows versie 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, VS). Alle waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM. De statistische significantie werd bepaald met behulp van eenwegs-ANOVA. Voor meerdere vergelijkingen werden post-hoctests van Bonferroni gebruikt. Verschillen werden als statistisch significant beschouwd bij p < 0.05.

3. Resultaten

3.1. Effecten van loopbandoefeningen en MitoQ op de expressie van aan mitochondriale dynamiek gerelateerde eiwitten in de hippocampus van door D-Gal geïnduceerde verouderingsratten

We hebben geverifieerd dat TE en MitoQ mitochondriale fusiegerelateerde factoren (Mfn1, Mfn2, Opa1) en splijtingsgerelateerde factoren (Drp1, Fis1) in de hippocampus van ouder wordende ratten beïnvloedden (Figuur 1).

De expressieniveaus van aan mitochondriale fusie gerelateerde factoren verschilden significant tussen de behandelingsgroepen (Mfn1, F4,34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4,34=80. 816, p < 0,001;Opa1, F4,34=51.456, p=0.001).

De expressieniveaus van factoren die verband houden met mitochondriale splijting verschilden ook aanzienlijk tussen de behandelingsgroepen (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 .313, p < 0,001). De post-hoctestresultaten worden weergegeven in Figuur 1.

Vergeleken met de Y-CON-groep nam de expressie van mitochondriale fusiegerelateerde factoren af ​​in de D-CON-groep en vertoonde toenemende trends in de D-TE-, D-MI- en D-COMBI-groepen.

Aan de andere kant nam de expressie van de mitochondriale splijtingsgerelateerde factor Drp1 toe in de D-CON-groep vergeleken met de Y-CON-groep. Terwijl de signalen van mitochondriale splijting afnamen door de combinatiebehandeling met TE, veroorzaakte behandeling met MitoQ alleen geen significante verandering.

De andere factor die verband houdt met mitochondriale splijting, Fis1, vertoonde dezelfde dalende trends als Drp1, maar werd ook verlaagd door alleen MitoQ-behandeling.

Figuur 1. Effect van loopbandoefeningen en mitoquinon (MitoQ) op de expressie van aan de mitochondriale dynamiek gerelateerde eiwitten in de hippocampus van door D-galactose (D-gal) geïnduceerde verouderende ratten. (A) Representatieve Western-blots van mitochondriale fusie en splijtingsgerelateerde eiwitten. (B – F) Densitometrische analyse van de Western-blotbanden genormaliseerd op -Actine. De in de Western blot getoonde gegevens zijn gemiddelden van zeven rattenhersenen.

-Actine werd onderzocht als interne controle. Bonferroni post hoc-test werd gebruikt na ANOVA. Waarden zijn gemiddelden ± SEM.

a Geeft het statistische verschil aan met de jonge controlegroep (Y-CON). b Geeft het statistische verschil aan met de D-galactosegroep (D-CON) -groep. c Geeft het statistische verschil aan met de groep met D-galactose plus loopbandtraining (D-TE).

d Geeft het statistische verschil aan met de D-galactose plus MitoQ (D-MI)-groep (p < 0.05). D-COMBI; D-galactose plus TE en MitoQ-groep.

3.2. Effecten van loopbandoefeningen en MitoQ op de expressie van NADPH-oxidase-subeenheden in de hersenschors en de hippocampus van door D-Gal geïnduceerde verouderingsratten

We hebben significante verschillen tussen de behandelingsgroepen waargenomen in de immuunreactiviteit van p22 phox in de hersenschors en de hippocampus van oudere ratten (Figuur 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0.{{11 }}01; cortex, F4,24=12.662, p < 0,001).

In de cortex vertoonde de D-CON-groep een verhoogde immunoreactiviteit van p22 phox vergeleken met de Y-CON-groep, die aanzienlijk afnam in de D-TE-, D-MI- en D-COMBI-groepen.

In CA3 was de verhoogde immunoreactiviteit van p22 phox verlaagd in de D-TE- en D-COMBI-groepen vergeleken met D-CON. De eiwitexpressieniveaus van NOX-subeenheden p22 phox, gp91 phox en p47phox verschilden aanzienlijk tussen de groepen (p22 phox, F4,{{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p < 0,001; p47 phox, F4,34=69.249, p< 0,001).

De resultaten van de post-hoctest lieten een significante toename zien van de niveaus van NOX-subeenheden in de D-CON vergeleken met de Y-CON. De NOX-subeenheidniveaus waren echter lager in alle interventiegroepen vergeleken met de D-CON-groep.

In het bijzonder was de expressie van p22 phox en gq91 phox significant verlaagd in de D-TE vergeleken met de D-MI-groep. Deze bevindingen impliceren dat lichaamsbeweging en MitoQ afzonderlijk door veroudering veroorzaakte oxidatieve stress in de hersenen voorkomen, maar dat hun combinatie geen extra effecten oplevert.

Figuur 2. Effecten van loopbandoefeningen en MitoQ op de expressie van NADPH-oxidase-subeenheden in de hersenschors en de hippocampus van door D-gal geïnduceerde verouderingsratten. (A1) Microfoto's die de immunoreactiviteit van NAPDH p22 phox in de hersenschors en de hippocampus van door D-gal geïnduceerde verouderingsratten in elke groep tonen. Zwarte rechthoeken in A1 geven het gedeelte van de afbeeldingen aan zoals weergegeven in f–i enp–t. (A2, A3) Kwantificering van de optische dichtheid van NADPH p22 phox-kleuring in de hersenschors en de hippocampus.

Bonferroni post-hoctest na ANOVA. Waarden worden weergegeven als gemiddelden ± SEM.(n=5 dieren). (a–e en k–o) Schaalbalk=100 µm, (f–j en p–t) Schaalbalk=50 µm. (B) Representatieve Western-blot-afbeeldingen voor NADPH-oxidase-subeenheden in de hippocampus.

(C – E) Kwantificering van NADPH-oxidase-subeenheden in de hippocampus. De in de Western blot getoonde gegevens waren gemiddelden van zeven rattenhersenen. -Actine werd onderzocht als interne controle. Bonferroni post-hoc-test werd gebruikt na ANOVA. Waarden zijn gemiddelden ± SEM.

a Geeft het statistische verschil met de Y-CON-groep aan. b Geeft het statistische verschil met de D-CON-groep aan. c Geeft het statistische verschil met de D-TE-groep aan. (p < 0.05).

3.3. Effect van loopbandtraining en MitoQ op GFAP-expressie in de hersenschors en hippocampale dentate gyrus van door D-Gal geïnduceerde verouderingsratten

We hebben significante verschillen tussen de behandelingsgroepen waargenomen in de GFAP-immunoreactiviteit in de hersenschors en de hippocampale dentate gyrus (DG) van oudere ratten (Figuur 3)(Cortex, F4,24=13.524, p < 0.001 ; DG, F4,24=30.364).

De resultaten van de post-hoctest toonden aan dat behandeling met D-gal de GFAP-immunoreactiviteit in zowel de cortex als het DG aanzienlijk verhoogde.

Vergeleken met de D-CON-groep waren de GFAP-niveaus in de cortex verlaagd in alle interventiegroepen, en waren de GFAP-niveaus in DG verlaagd in de D-TE- en D-COMBI-groepen, terwijl de D-MI-groep alleen verschillen in GFAP-immunoreactiviteit vertoonde. in de cortexregio.

Dus hoewel TE- of MitoQ-behandeling de door D-gal geïnduceerde neuro-ontsteking in de cortex verminderde, produceerde alleen TE-interventie positieve effecten bij DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com