Nieuw recombinant virus van de ziekte van Newcastle, gebaseerd op ovo-vaccins, omzeilen de immuniteit van de moeder om volledige bescherming te bieden tegen vroege virulente blootstelling Deel 1

Abstract:

De ziekte van Newcastle (ND) is een van de economisch meest belangrijke pluimveeziekten. Ondanks intensieve inspanningen met de huidige vaccinatieprogramma's, komt deze ziekte wereldwijd nog steeds voor en veroorzaakt zelfs bij gevaccineerde koppels een aanzienlijke sterfte. Dit wordt gedeeltelijk toegeschreven aan een hiaat in de immuniteit tijdens de periode na het uitkomen als gevolg van de aanwezigheid van maternale antilichamen die een negatieve invloed hebben op de replicatie van de veelgebruikte levende vaccins. In ovo-vaccins hebben meerdere voordelen en bieden een kans om dit probleem aan te pakken.

Momenteel gebruikt in ovo ND-vaccins zijn recombinant herpesvirus van kalkoenen (HVT)-gevectoriseerde vaccins die Newcastle disease virus (NDV) antigenen tot expressie brengen. Hoewel ze efficiënt zijn gebleken, hebben deze vaccins enkele beperkingen, zoals een vertraagde immunogeniciteit en het onvermogen om een ​​tweede HVT-vaccin na het uitkomen toe te dienen. Het gebruik van levende ND-vaccins voor in-ovo-vaccinatie is momenteel niet van toepassing, aangezien deze gepaard gaan met een hoge embryosterfte. In deze studie werden recombinante NDV-gevectoriseerde experimentele vaccins die een antisense-sequentie van aviair interleukine 4 (IL4R) en hun ruggengraat bevatten, in ovo toegediend in verschillende doses in 18-een dag oude commerciële eieren met hoge maternale antilichaamtiters. De uitgekomen vogels werden op een leeftijd van 2 weken geprovoceerd met virulent NDV. Het uitscheiden van het vaccin na het uitkomen, de overleving na de provocatie, het uitscheiden van het provocatievirus en de humorale immuunresponsen werden op meerdere tijdstippen geëvalueerd. Met recombinant NDV (rNDV) gevaccineerde vogels hadden een significant lagere mortaliteit na het uitkomen in vergelijking met het wildtype LaSota-vaccin.

Alle rNDV-vaccins waren in staat om de maternale immuniteit te penetreren en een sterke vroege humorale immuunrespons op te wekken. Verder beschermden de rNDV-vaccins tegen klinische ziekte en verminderden ze de virusuitscheiding aanzienlijk na vroege virulente NDV-uitdaging twee weken na het uitkomen. De post-challenge hemagglutinatie-remming antilichaamtiters in de gevaccineerde groepen bleven vergelijkbaar met de pre-challenge titers, wat suggereert dat de bestudeerde vaccins in staat zijn om efficiënte replicatie van het challenge-virus te voorkomen. De overleving na het uitkomen na vaccinatie met de rNDV-IL4R-vaccins was dosisafhankelijk, met een toename van de overleving naarmate de dosis afnam. Deze verbeterde overleving en de dosisafhankelijkheidsgegevens suggereren dat nieuwe verzwakte in ovo rNDV-gebaseerde vaccins die maternale immuniteit kunnen binnendringen om al 14 dagen na het uitkomen een sterke immuunrespons op te wekken, resulterend in hoge of volledige bescherming tegen virulente provocatie. belofte als een bijdrage aan de bestrijding van de ziekte van Newcastle.

Naast humane vaccinatie kunnen mensen ook voeding en supplementen nemen. Cistanche bevat een verscheidenheid aan chemische stoffen, zoals polysacchariden, steroïden, alkaloïden, flavonoïden, enz. Deze stoffen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van het immuunsysteem. Onder hen kunnen polysacchariden de activering en proliferatie van immuuncellen bevorderen en de immuniteit van het lichaam verhogen; steroïden kunnen de functie van immuuncellen reguleren en de immuunrespons versterken; alkaloïden en flavonoïden zijn bestand tegen oxidatie, ontstekingsremmend, antibacterieel en versterken de immuniteit verder. Daarom heeft Cistanche een aanzienlijk immuunregulerend effect en kan het worden gebruikt als gezondheidsvoeding en medicijn om de immuniteit te verbeteren.

Klik op gezondheidsvoordelen van cistanche

1. Inleiding

Newcastle disease (ND), een verwoestende pluimveeziekte die 100 procent sterfte kan bereiken bij naïeve vogels, wordt veroorzaakt door virulente stammen van het Newcastle disease virus (NDV) [1]. Deze virussoort, onlangs omgedoopt tot Avian orthoavulavirus 1, is een lid van de familie Paramyxoviridae [2,3]. Virussen van de ziekte van Newcastle hebben een enkelstrengs, niet-gesegmenteerd, negatief-sense RNA-genoom dat codeert voor ten minste zes structurele eiwitten (30 - nucleoproteïne [NP] - fosfoproteïne [P] - matrixeiwit [M] - fusie-eiwit [F] - hemagglutinine-neuraminidase [HN]—en groot RNA-polymerase [L]—50 ) en bestaande uit een van de drie genoomgroottes (15.186, 15.192 en 15.198 nucleotiden) [4,5]. De ziekte van Newcastle wordt beschouwd als de op twee na belangrijkste pluimveeziekte ter wereld [6] en blijft endemisch in veel landen in Azië, Afrika en Amerika [7].

De controle van ND omvat strikte bioveiligheid om de introductie van virulent NDV (vNDV) op pluimveehouderijen te voorkomen [8,9] en correcte toediening van vaccins [10]. De meerdere ND-uitbraken die wereldwijd plaatsvinden [11] suggereren echter dat de huidige vaccins en vaccinatieprocedures niet volledig effectief zijn. Naast de conventionele levende en geïnactiveerde vaccins zijn er de afgelopen twee decennia meerdere concepten voor ND-vaccinatie onderzocht, waaronder vaccins met vectoren, antigeen-antilichaamcomplexen, virusachtige deeltjes en tolachtige receptorligandvaccins [1, 8,9]. Er is ook gesuggereerd dat verschillende vogelvaccins, ontwikkeld om immunostimulerende cytokines tot expressie te brengen, de beschermende immuniteit verbeteren [12]. Een andere benadering die is onderzocht, is het gebruik van antigeen gematchte vaccins. Hoewel alle NDV's worden beschouwd als leden van een enkel serotype [3,13], is er antigene variatie tussen stammen [14]. Eerdere studies met kippen van verschillende leeftijden hebben aangetoond dat kippen die werden gevaccineerd met stammen die antigeen overeenkwamen met het challenge-virus, significant minder van het challenge-vNDV afscheidden dan de hoeveelheid die werd uitgescheiden door kippen die waren gevaccineerd met heterologe vaccins [15-17]. Merk op dat passief overgedragen maternale anti-NDV-antilichamen, hoewel ze kippen tijdens de cruciale eerste levensweken beschermen, de ontwikkeling van immuniteit van de gastheer na vaccinatie belemmeren [18].

In ovo-vaccinatie is een aanpak die meerdere voordelen biedt, bijvoorbeeld aanzienlijke kostenbesparing, standaardisatie, massale vaccintoepassing, geautomatiseerde vaccinatie bij de broederij, uniforme toediening van het vaccin in elk ei en geen stress voor vogels [19-21]— en is een aantrekkelijke immunisatiemethode voor de pluimvee-industrie [22]. Tussen 80 en 90 procent van de vleeskuikens die in de VS worden gekweekt, wordt momenteel twee tot drie dagen voor het uitkomen gevaccineerd [23,24], en door de automatisering van het proces kunnen tot 70,000 eieren worden gevaccineerd. per uur gevaccineerd worden [23].

Wereldwijd wordt deze vaccinatiemethode toegepast in 26 van de 30 toonaangevende pluimveeproductielanden ter wereld [23]. Er zijn momenteel enkele in-ovo-vaccins tegen ND beschikbaar, maar ze worden allemaal gegenereerd met behulp van niet-NDV-vectoren. Op vectoren gebaseerde vaccins op basis van kippenpokkenvirus (FPV) die de NDV-F- en HN-eiwitten tot expressie brengen en die in ovo worden toegepast, hebben aangetoond pluimvee te beschermen tegen een uitdaging met vNDV [25,26].

Recombinante FPV-ND-vaccins worden echter niet veel gebruikt vanwege immuuninterferentie door eerdere FPV-vaccinaties of blootstellingen (FPV is vaak aanwezig in het milieu) en gebrek aan optimalisatie voor toepassing via massale methoden [9]. De meest gebruikte vector voor de productie van recombinant ND in ovo-vaccins is het Meleagrid alfaherpesvirus 1, algemeen bekend als herpesvirus van kalkoenen (HVT) of een serotype 3-virus van de ziekte van Marek [12,23]. Alleen al in de VS werden in 2018 8,2 miljard doses recombinant HVT (rHVT)-ND-vaccins geproduceerd, vergeleken met 3,6 miljard doses conventionele ND-vaccins [27].

Naast het voordeel dat ze in ovo worden gebruikt, wekken de rHVT-vaccins die NDV-eiwitten tot expressie brengen sterke en langdurige immuniteit op na een enkele toepassing [28]. Verder worden ze tijdelijk beïnvloed door de aanwezigheid van anti-NDV maternale antilichamen [8]. De rHVT-ND-vaccins hebben echter enkele beperkingen, zoals een vertraagde immuniteit, en een eerdere HVT-vaccinatie lijkt ongevoelig voor het gebruik van booster-HVT-vaccins bij dezelfde vogels [9,29]. De HV-vaccins zijn celgeassocieerd en moeten worden opgeslagen en vervoerd in vloeibare stikstof, wat in veel landen een beperking vormt voor hun gebruik.

Het vooruitzicht op nieuwe in ovo-vaccins groeit [23]. Er zijn verschillende vectoren onderzocht voor de in-ovo-toedieningsroute en er zijn veelbelovende resultaten gerapporteerd met niet-replicerende humane adenovirus-[30] en alfavirus-gevectoriseerde vaccins [31]. Hoewel er geen vooruitgang is geboekt bij routinematig commercieel gebruik, zijn er ook inspanningen geleverd voor de ontwikkeling van nieuwe in ovo niet-HVT NDV-gevectoriseerde vaccins [32-35]. Het gebruik van levende ND-vaccins in ovo is een uitdaging. Hoewel levende ND-vaccins, zoals LaSota, B1, Clone 30 en Ulster, om er maar een paar te noemen, een sterke immuunrespons geven en vaak worden gebruikt voor de vaccinatie van kippen vanaf één dag oud, worden ze in verband gebracht met een hoge embryosterfte wanneer toegediend op 18 dagen na embryonatie. Mortaliteit van wel 100 procent bij gebruik van wild-type laag-virulente virussen en 80 procent bij gebruik van genetisch verzwakte levende virussen is gemeld na in-ovo-gebruik, en er worden momenteel geen levende ND-vaccins gebruikt voor deze methode van vaccintoediening [36,37] .

Een nieuw recombinant NDV (rNDV)-gevectord experimenteel vaccin dat een antisense aviaire interleukine 4 inserts (IL4) bevat, genaamd ZJ1*l-IL4R, bleek onlangs een veelbelovende in ovo-vaccinkandidaat te zijn na evaluatie in specifiek-pathogeenvrij (SPF). ) geëmbryoneerde kippeneieren (ECE) [38]. Deze studie was gericht op het verder evalueren van de toepasbaarheid van dit recombinante NDV-gevectoriseerde vaccin en zijn recombinante ruggengraat (verzwakte splitsingsplaats van wildtype virus) en een recombinant LaSota-IL4R-virus voor in-ovo-vaccinatie van 18-dag-oude commerciële eieren met hoge maternale antilichaamtiters. In de handel verkrijgbare vaccins LaSota en rHVT-ND werden als controles opgenomen. Bovendien was deze studie gericht op het evalueren van de beschermende werkzaamheid van de bestudeerde vaccins tegen vroege provocaties met vNDV. Hier wordt het vermogen van deze recombinante vaccins aangetoond om op efficiënte wijze de maternale immuniteit te overwinnen, zelfs in lage doses, en om een ​​sterke immuunrespons op te wekken. De experimentele rNDV-vaccins vertoonden 100 procent bescherming na vroege provocaties met vNDV.

2. materialen en methoden

2.1. Virussen

De virulente gans/China/ZJ1/2000 (ZJ1, GenBank toegangsnummer AF431744) NDV, lid van subgenotype VII.1.1 (voorheen VIId), werd gebruikt als een challenge-virus in deze studie. Een recombinant ZJ1-virus (verzwakte versie van ZJ1) met een laag virulente splitsingsplaats (ZJ1*L) dat eerder in ons laboratorium werd gegenereerd via omgekeerde genetica [39] werd gebruikt als ruggengraat voor het maken van recombinante ZJ1*L-vaccins en als vaccin virus. De laagvirulente LaSota (LS)-vaccinstam werd gebruikt als vaccincontrole en als ruggengraat om een ​​recombinant LS-IL4R-vaccin te genereren. Alle virussen werden verkregen uit de repository van het Southeast Poultry Research Laboratory (SEPRL) van het United States National Poultry Research Center (USNPRC), US Department of Agriculture (USDA). Bovendien werd ook een in de handel verkrijgbaar rHVT-ND-vaccin (fusie-gen-insert) als controle gebruikt.

De recombinante NDV-experimentele vaccins die in deze studie werden gebruikt, werden gemaakt met behulp van omgekeerde genetica, zoals eerder beschreven [38,39]. In het kort, de coderende sequentie van aviair IL4 werd gekloneerd in de ruggengraat van ZJ1*L en LS in de omgekeerde oriëntatie (IL4R) tussen de P- en M-genen, waarbij twee recombinante verzwakte levende virussen werden gegenereerd, namelijk ZJ1*L-IL4R en LS- IL4R (respectievelijk GenBank-toegangsnummers MM680659 en MM680665). De recombinante virussen werden gered met behulp van het gemodificeerde vacciniavirus Ankara dat het T7-polymerase (MVA/T7) tot expressie brengt, volgens eerder gepubliceerde protocollen [38-41]. Een schematische weergave van de constructen wordt gegeven in aanvullende figuur S1A. Voor de doeleinden van dit werk verwijst de term "DV-vaccins" die hierna wordt gebruikt naar ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R en LS-IL4R.

Werkbestanden van alle NDV's werden vermeerderd in {{0}} tot 11-dag oude SPF geëmbryoneerde kippeneieren (ECE) [42]. Virale voorraden die in dit onderzoek werden gebruikt om eieren te inoculeren, werden verdund in Brain Heart Infusion (BHI) bouillon (BD Biosciences, MD, VS), met 200 µg/ml gentamicine, 2{{22} }00 E/ml penicilline en 4 µg/ml amfotericine B, tot drie verschillende doeltiters, 105,5/0,1 ml, 104,5/0,1 ml en 103,5/0,1 ml embryo-infectieuze dosis (EID50), behalve LS , die werd verdund tot 105,5/0,1 ml en 104,5/0,1 ml EID50. De titers van de verdunde werkvoorraden van de levende vaccins werden bevestigd door terugtitraties in 9- tot 11-dag oude SPF ECE's volgens de standaardprocedures, zoals hierboven vermeld. Het rHVT-ND-vaccin werd direct verdund met behulp van het sucrosefosfaatglutamaatalbumine-verdunningsmiddel voor rHVT-vaccins beschreven in het USDA's Center for Veterinary Biologics Test Protocol [43].

2.2. Eieren

Tweehonderdtweeënzestig commerciële (niet-SPF) eieren van het legkoppel van het Hy-Line Rockside W-36-ras (Mansfield, GA, VS) werden gedoneerd voor dit experiment. De legkippen waren routinematig gevaccineerd met het LaSota-vaccin. De immuniteit van de kudde is regelmatig getest door ELISA en hoewel deze resultaten niet direct kunnen worden vertaald naar hemagglutinatie-inhibitie (HI)-titers, waren de gemiddelde anti-NDV-antilichaamniveaus van de ouderlijke kudde erg hoog (dwz 15.534 met een grenswaarde voor positieve monsters van 1159). De bron van SPF ECE's (42 eieren) was de SEPRL SPF White Leghorn-troep. Alle eieren werden gedurende 18 dagen bij een temperatuur van 37,5 ◦C en een relatieve vochtigheid van 55-60 procent geïncubeerd.

2.3. Vaccinatie

De commerciële (n {{{{10}}}}) en SPF (n=42) eieren, na 18 dagen geëmbryoneerd (DOE), werden gescheiden in 14 groepen met elk 21 eieren groep (behalve BHI- en Hatch-controlegroepen, die elk 26 eieren hadden). Met behulp van 1 ml, 24 G × 1/2 injectiespuiten werd elk ei geïnoculeerd in de allantoïsche holte met 0.1 ml verdund vaccin of BHI, behalve bij de Hatch-controlegroep, waarin de eieren niet werden gemanipuleerd bij alle. Er waren dertien groepen geïnoculeerde eieren, gescheiden in zeven experimentele en zes controlegroepen. De zeven experimentele groepen waren als volgt: ZJ1*L-IL4R 104.5, ZJ1*L-IL4R 105.5, LS-IL4R 103.5, LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5, ZJ1*L 104.5 en ZJ1*L 105.5, die elk de respectieve EID50-dosis inoculum per 0,1 ml zoals vermeld in de groepsnaam. Daarnaast zijn er zes controlegroepen gemaakt. Twee controlegroepen van commerciële eieren werden geïnoculeerd zoals hierboven beschreven met respectievelijk BHI en rHVT-ND. Twee controlegroepen commerciële eieren werden geïnoculeerd zoals hierboven beschreven met LS 104.5 en LS 105.5 EID50 dosis inoculum per 0,1 ml. Twee controlegroepen van SPF-eieren werden geïnoculeerd met ZJ1*L 103.5 en ZJ1*L-IL4R 103.5. Een schematische weergave van het onderzoeksontwerp wordt gegeven in aanvullende figuur S1B, C.

Na inoculatie werden de eieren in Turbofan Hova-Bator Incubators (GQF Manufacturing Company Inc., GA, VS) geplaatst die vervolgens in isolatoren werden geplaatst in een dierlijk bioveiligheidsniveau 2 (ABSL{2}}) faciliteit. De couveuses werden geregeld met thermostaten om een ​​constante temperatuur van 37,5 ◦C en een relatieve vochtigheid tussen 55 en 60 procent te handhaven.

2.4. Uitkomen, bemonstering, sterfte

Nadat ze op 21 DOE uit het ei waren gekomen, werden de kuikens gehuisvest in onderdrukisolatoren (ABSL-2) en kregen ze ad libitum toegang tot voedsel en water. Vijf niet-SPF-kippen van zowel de Hatch-controlegroep als de BHI-groep werden opgeofferd en onmiddellijk na het uitkomen werd bloed afgenomen om de basislijntiter van maternale anti-NDVHI-antilichamen vast te stellen. Alle kippen werden 1, 8 en 13 dagen na uitkomen (DPH) gewogen. Orofaryngeale en cloacale uitstrijkjes werden verzameld in BHI van elke vogel bij 2 en 4 DPH. Klinische symptomen en mortaliteit werden gedurende de periode na het uitkomen tweemaal daags geregistreerd en er werden bloedmonsters verzameld om 13 DPH.

2.5. Uitdaging

Twaalf vogels van elke groep (behalve LS 1{{10}5.5, waarin alle vogels om 6 DPH stierven) werden overgebracht naar de ABSL-3E-faciliteit om 13 DPH. De vogels werden in onderdrukisolatoren geplaatst en mochten 24 uur acclimatiseren vóór de uitdaging. Alle vogels werden geprovoceerd bij 14 DPH met virulent ZJ1 NDV bij 106 EID50/0,1 ml via de oculo-nasale route. Vogels werden dagelijks geobserveerd op klinische symptomen en sterfte. Orofaryngeale en cloacale uitstrijkjes werden 2 en 4 dagen na provocatie (DPC) van elke vogel verzameld. Alle overlevende vogels werden gewogen en ontbloed op 14 DPC en werden geëuthanaseerd door cervicale dislocatie na anesthesie met 0,2 ml ketamine/xylazine-oplossing (66 mg/ml ketamine en 6,6 mg/ml xylazine) intramusculair toegediend met een 25-meternaald.

2.6. Realtime RT-PCR

RNA werd geëxtraheerd uit alle uitstrijkmedia met behulp van de MagMAX 96 AI / ND virale RNA-isolatiekit (Ambion, Inc. Austin, TX, VS) met een KingFisher magnetische deeltjesprocessor (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) volgens de instructies van de fabrikant , met de modificatie voor het verwijderen van de remmer beschreven door Das et al. [44]. Kwantitatieve real-time RT-PCR (rRT-PCR) voor NDV-detectie gericht op het matrixgen (M) werd uitgevoerd met AgPath-ID one-step RT-PCR Kit (Ambion) en de ABI 750{{31 }} Snel real-time PCR-systeem (Applied Biosystems, Waltham, MA, VS) dat primers en probe gebruikt die eerder zijn beschreven door Wise et al. [45]. De testomstandigheden waren reverse transcriptie gedurende 10 min bij 45 ◦C; initiële denaturatie gedurende 10 min bij 95 ◦C; 40 cycli van denaturatie gedurende 10 seconden bij 94 ◦C, primeruitgloeiing gedurende 30 seconden bij 56 ◦C en primerverlenging gedurende 10 seconden bij 72 ◦C. Het totale reactievolume van 25 µL voor elk monster bestond uit water van moleculaire kwaliteit - 2,5 µL; 2X buffer—12,5 µL; voorwaartse primer—0,25 µl (20 pmol/µl); omgekeerde primer—0,25 µL (20 pmol/µL); sonde—0,50 µL (6pmol/µL); 25X enzymmix - 1,0 µL; en RNA-template - 8,0 µL. Voor viruskwantificering werd voor elk virus een standaardcurve opgesteld, waarbij RNA werd geëxtraheerd uit dezelfde getitreerde voorraad van de virussen die werden gebruikt om de eieren te inoculeren (voor de uitstrijkjes die na het uitkomen zijn verzameld) of het challenge-virus (voor de uitstrijkjes die na het uitkomen zijn verzameld). -uitdaging).

De resultaten worden gerapporteerd als EID50/ml. De berekende onderste detectiegrens van de assays lag tussen 101,7 en 101,9 EID50/ml. Het is belangrijk op te merken dat rRTPCR virale nucleïnezuren detecteert en dat de geschatte waarden niet noodzakelijkerwijs infectieuze virussen vertegenwoordigen. De EID50/ml-waarden zijn niet bedoeld om besmettelijkheid weer te geven en worden gebruikt om middelen te verschaffen voor een relatieve vergelijking van virale uitscheiding tussen groepen. Ondanks het gebruik van het protocol voor het verwijderen van nucleïnezuren voor het verwijderen van remmers, kan het grote volume van de RNA-template de berekeningen van de standaardcurve hebben beïnvloed. Merk op dat in alle reacties dezelfde hoeveelheid RNA-template werd gebruikt en dat potentiële residuremmers alle resultaten in gelijke mate zouden hebben beïnvloed.

2.7. HI-analyse

Hemagglutinatie-remming (HI)-test werd gebruikt om de aanwezigheid en titers van antilichamen in de serummonsters die tijdens het experiment werden verzameld, te evalueren. Volgens standaardprocedures [46] werd het virus dat als ruggengraat voor elk vaccin werd gebruikt, gebruikt als een antigeen voor elke respectievelijke groep sera (ZJ1*L voor alle ZJ1-groepen en LS voor alle LS-groepen). Voor de serummonsters die na prikkeling werden verzameld, werd het virulente ZJ1-virus gebruikt als een antigeen in de HI-assay. Titers werden berekend als het omgekeerde van de laatste HI-positieve serumverdunning, en monsters met HI-titers van log2 3 en lager werden als negatief beschouwd.

2.8. Statistische analyse

Prism v.7.03-software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, VS) werd gebruikt om de gegevens te analyseren en uitbijters werden geïdentificeerd met behulp van de ROUT-test. De normaliteitstest van D'Agostino-Pearson werd uitgevoerd om te schatten of de waarden in elke groep afkomstig waren van een Gaussiaanse verdeling. Op basis van de normaliteitsverdeling werd de niet-parametrische Kruskal-Wallis-test met Dunn's post-test gebruikt voor meervoudige vergelijkingen tussen groepen. Voor statistische doeleinden kregen alle uitstrijkjes waaruit geen virussen werden gedetecteerd een numerieke waarde van 1 log onder de detectiegrens voor elk virus. De overlevingscurven werden geanalyseerd met behulp van de Log-rank (Mantel-Cox) -test. Statistische significantie werd vastgesteld op een p-waarde van < 0,05.

3. Resultaten

3.1. Uitkombaarheid, overleving na uitkomen en lichaamsgewicht

De overleving na het uitkomen van alle groepen die zijn uitgebroed uit commerciële eieren wordt afgebeeld als overlevingscurven in figuur 1 (gescheiden in figuren 1A en B voor de duidelijkheid en om congestie van de afbeeldingen te voorkomen). Een gecombineerde grafiek is beschikbaar in aanvullende figuur S2. De Hatch-controlegroep (niet geïnoculeerd) werd in het ontwerp opgenomen om ervoor te zorgen dat er geen abnormale uitkomst of sterfte na het uitkomen was die niet gerelateerd was aan de inoculatie van de eieren.

Zoals verwacht werd bij drie van de controlegroepen zeer lage (rHVT-ND) tot geen (uitgekomen en BHI) mortaliteit na uitkomen waargenomen. Daarentegen hadden de LS-controlegroepen 57,1 procent en 0 procent overleving wanneer respectievelijk de 104,5 en 105,5 doses werden gebruikt, wat eerder is gemeld voor conventionele levende ND-vaccins. Twee eieren kwamen niet uit in de LS-IL4R 105.5-groep en één ei kwam niet uit in de LS 104.5-groep. Variabele mortaliteit werd waargenomen in de andere groepen, afhankelijk van het vaccin en de inentingsdosis. De ZJ1*L-IL4R 104.5- en 105.5-groepen hadden respectievelijk 90,5 procent en 71,4 procent overleving, en de geregistreerde overleving in de ZJ1*L 104.5- en 105.5-groepen was respectievelijk 80,9 procent en 76,2 procent (Figuur 1A), maar de verschillen waren niet statistisch significant. De overleving in de LS-IL4R 103.5-groep was 95,2 procent. De overlevingspercentages die werden waargenomen in de LS-IL4R 104.5- en 105.5-groepen waren respectievelijk 85,7 procent en 66,7 procent (Figuur 1B).

Er waren geen significante verschillen in overleving tussen de experimentele ZJ1*L-, ZJ1*L-IL4R- en LS-IL4R-vaccingroepen en de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen, maar het overlevingspercentage in deze controlegroepen was numeriek hoger , met een negatieve correlatie tussen de vaccindosis en de overleving na uitkomen (de overleving nam toe naarmate de vaccindosis afnam). De LS 1{{10}}5.5-controlegroep had significante verschillen in overleving in vergelijking met de experimentele groepen (p-waarden tussen 0.0001 en 0,02). De LS 104.5-controlegroep, hoewel niet statistisch verschillend, had aanzienlijk lagere overlevingspercentages in vergelijking met de experimentele groepen met dezelfde dosis. De twee LS-controlegroepen hadden significante verschillen in overleving in vergelijking met de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen (p-waarden tussen 0,0001 en 0,04). Na het uitkomen werden in geen van de groepen klinische symptomen waargenomen. In de groepen waar sterfte na uitkomen aanwezig was, werden de vogels dood aangetroffen bij dagelijkse controles.

Alle vogels werden gewogen op dag 1, 8 en 13 na het uitkomen (tabel 1). Bij 1 DPH lag het gemiddelde lichaamsgewicht per vogel in de meeste groepen tussen 38,5 en 42,6 gram (g). Er waren alleen significante verschillen in lichaamsgewicht tussen rHVT-ND en ZJ1*L-IL4R 104.5 groepen van één kant en ZJ1*L 104.5 en controle LS 1{{4{{42} }}}4,5 van een andere (de vogels in de twee eerste groepen wogen meer dan de vogels in de controlegroep) (p-waarden tussen respectievelijk 0.0001 en 0,017). Bij 8 DPH hadden de twee ZJ1*L-groepen en de LS-IL4R 104.5, de LS-IL4R 105.5-groep en de controle LS-groep (gemiddeld gewicht 50-63 g) een aanzienlijk lager lichaamsgewicht in vergelijking met de vogels van de Hatch, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen (gemiddeld gewicht 77-82 g) (p-waarden tussen 0,0001 en 0,03). Dezelfde groepen die significant verschilden van de controles op 8 DPH (behalve LS-IL4R 104.5) hadden ook significant lagere lichaamsgewichten dan de controlegroepen Hatch, BHI en rHVT-ND op 13 DPH (p-waarden tussen 0,0001 en 0,01). De vogels uit de geïnoculeerde SPF-controlegroepen werden niet meegenomen in deze vergelijking, aangezien SPF-eieren (en de vogels die daaruit zijn uitgebroed) traditioneel kleiner en lichter zijn dan commerciële eieren.

Figuur 1. Overleving van kippen na het uitkomen na inoculatie van commerciële eieren na 18 dagen embryonatie met experimentele in ovo NDV-vaccins. Hy-Line Rockside W-36-eieren werden geïnoculeerd met recombinante virussen en LaSota. Drie controlegroepen werden geïnoculeerd met BHI- of rHVT-ND-vaccin, of niet geïnoculeerd (Hatch-controlegroep). De vogels werden 13 dagen na het uitkomen gevolgd. De overlevingscurven worden weergegeven in twee figuren: (A) controlegroepen en ZJ1*L-groepen en (B) controlegroepen en LS-IL4R-groepen. Verschillende superscriptletters duiden op statistisch significante verschillen tussen groepen (p-waarde < 0.05). Groepsafkortingen: HATCH - eieren niet geïnoculeerd; BHI - eieren geïnoculeerd met BHI; rHVT-ND - eieren geïnoculeerd met recombinant HVT-vaccin; ZJ1*L - eieren die zijn geïnoculeerd met het recombinante ZJ1*L-virus waarvan de splitsingsplaats is gemodificeerd om een ​​lage virulentie te hebben; ZJ1*L-IL4R: eieren geïnoculeerd met de recombinante laag-virulente ZJ1*L met het interleukine-4-gen geïnsereerd in omgekeerde oriëntatie; LS - eieren geïnoculeerd met de LaSota-stam; LS-IL4R: eieren geïnoculeerd met het recombinante LaSota-virus met het interleukine-4-gen in omgekeerde richting ingevoegd. De virusdosis die de eieren in elke groep hebben gekregen, wordt weergegeven als een nummer achter de groepsnaam in EID50/per ei.

Tabel 1. Gemiddelde gewichten (en standaarddeviaties) van kippen 1, 8 en 13 dagen na het uitkomen na inoculatie van commerciële eieren na 18 dagen embryonatie met experimentele in-ovo-vaccins en 14 dagen na provocatie met virulente ziekte van Newcastle virus.

3.2. Verspreiding van vaccinvirussen na vaccinatie, zoals aangetoond door rRT-PCR

Bij 2 DPH waren er geen significante verschillen in virale uitscheiding tussen vaccingroepen. (Figuur 2A). Evenzo waren bij 4 DPH de verschillen tussen groepen niet statistisch significant. (Figuur 2B). Bij geen van de Hatch- en BHI-controlevogels werd virusuitscheiding gedetecteerd.

Figuur 2. Gemiddelde vaccinuitscheiding na het uitkomen van kippen die zijn uitgekomen uit commerciële eieren die na 18 dagen embryonatie zijn geïnoculeerd met experimentele in ovo-vaccins. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt één vogel en NDV-titers gedetecteerd in orofaryngeale (OP) en cloacale (CL) uitstrijkjes op verschillende dagen na uitkomen (DPH). Vervelling wordt apart gepresenteerd gedurende 2 dagen na het uitkomen (A) en 4 dagen na het uitkomen (B). Staven vertegenwoordigen standaarddeviaties van het gemiddelde. Alle uitstrijkjes waarvan het virus niet werd gedetecteerd, kregen een numerieke waarde van 1 log onder de detectielimiet voor elk van de respectieve virussen. De detectielimiet van rRT-PCR wordt weergegeven als een horizontale stippellijn (de laagste limiet wordt gebruikt). Groepsafkortingen: HATCH - eieren niet geïnoculeerd; BHI - eieren geïnoculeerd met BHI; rHVT-ND - eieren geïnoculeerd met recombinant HVT-vaccin; ZJ1*L - eieren die zijn geïnoculeerd met het recombinante ZJ1*L-virus waarvan de splitsingsplaats is gemodificeerd om een ​​lage virulentie te hebben; ZJ1*L-IL4R: eieren geïnoculeerd met de recombinante laag-virulente ZJ1*L met het interleukine-4-gen geïnsereerd in omgekeerde oriëntatie; LS - eieren geïnoculeerd met de LaSota-stam; LS-IL4R: eieren geïnoculeerd met het recombinante LaSota-virus met het interleukine-4-gen in omgekeerde richting ingevoegd. De virusdosis die de eieren in elke groep hebben gekregen, wordt weergegeven als een nummer achter de groepsnaam in EID50/per ei.

3.3. Humorale immuunrespons na het uitkomen

Analyse van serummonsters verzameld bij 13 DPH (diagonale streep gevulde staven) door HI-assay (detectie van hemagglutinatie-antilichamen tegen NDV) wordt weergegeven in figuur 3. Om de titer van passief overgedragen anti-NDV maternale HI-antilichamen in de commerciële eieren vast te stellen, tien kippen werden onmiddellijk na het uitkomen verbloed (0 DPH). De HI-titers bij het uitkomen varieerden tussen log2 5 en log2 8, met een gemiddelde van log2 7.17 (Afbeelding 3, gestippelde horizontale rode lijn). De antilichamen bij 13 DPH in de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-groepen (gemiddelde van log2 4.7) zijn residuele maternale antilichamen, aangezien deze groepen ofwel niet waren gevaccineerd ofwel waren gevaccineerd met het rHVT-ND-vaccin, wat wel induceren geen HI-antilichamen tegen NDV. De antilichaamtiters in de ZJ1*L-, ZJ1*L-IL4R- en de LS 104.5-groepen waren significant hoger in vergelijking met de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de verschillende dosisgroepen van de vaccins met dezelfde ruggengraat. De LS-IL4R-groepen hadden lagere HI-titers na vaccinatie in vergelijking met de ZJ1*L-IL4R- en ZJ1*L-groepen, hoewel deze verschillen niet statistisch significant waren. Merk op dat, hoewel numeriek iets hoger, de post-vaccinatie HI-titers van de vogels in alle LS-IL4R-groepen niet significant verschilden van de titers gemeten in de niet-gevaccineerde controlevogels.

Figuur 3. Pre- en post-challenge HI-antilichaamtiters (en standaarddeviatie) van kippen die zijn uitgekomen uit commerciële eieren die na 18 dagen embryonatie zijn geïnoculeerd met experimentele in-ovo-vaccins en vroege challenge met virulent virus van de ziekte van Newcastle 14 dagen na het uitkomen. De met diagonale strepen gevulde staven vertegenwoordigen de pre-provocatietiters 13 dagen na het uitkomen. De met vaste stof gevulde staven vertegenwoordigen de titers na prikkeling 14 dagen na prikkeling. Statistisch significante verschillen tussen de verschillende groepen worden weergegeven met kleine letters boven elke groep (p-waarde<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Klinische symptomen en overleving na vroege uitdaging met CDV

In de controlegroepen waren de eerste klinische tekenen die werden waargenomen in de Hatch- en BHI-groepen op 3 DPC. Drie vogels in de Hatch-groep en één vogel in de BHI-groep hadden moeizame ademhaling. Bij 4 DPC werden gegolfde veren en hoofdtrillingen gezien in de BHI- en hatch-groepen, en bij 5 DPC in de rHVT-ND-groep; in de laatste groep werden ook ataxie en ernstige torticollis waargenomen bij twee vogels. De vogels in de Hatch-controlegroep vertoonden lethargie bij 5 DPC en twee vogels in de BHI-groep vertoonden verlamming. Lethargie en verlammingen werden waargenomen in de rHVT-ND-groep op 6 en 7 DPC. Opisthotonos, torticollis en moeizame ademhaling werden waargenomen in de Hatch- en BHI-controlegroepen vanaf 9 DPC. In de rHVT-ND-groep werd torticollis al waargenomen bij 5 DPC, moeizame ademhaling en ataxie begonnen bij 6 DPC en opisthotonos begon bij 13 DPC. Tegen 14 DPC stierven alle vogels behalve twee Hatch-, één BHI- en twee rHVT-ND-vogels (respectievelijk 83,3 procent, 91,6 procent en 83,3 procent morbiditeit) of ontwikkelden overwegend neurologische klinische symptomen zoals ataxie, opisthotonus, torticollis, tremoren , en verlamt. Vogels die ernstige klinische symptomen vertoonden, stopten met eten of drinken of bleven liggen, werden geëuthanaseerd en de volgende dag als dood gemeld voor de berekening van de overlevingstijden. Er werden geen klinische symptomen waargenomen in een van de ZJ1*L- en ZJ1*L-IL4R-groepen. Lichte klinische tekenen van opisthotonos of torticollis werden waargenomen bij een enkele vogel (8,4 procent morbiditeit) in elk van de LS-IL4R-groepen en de LS 104.5-groep op 14 DPC.

Overleving na provocatie met het virulente ZJ1 NDV wordt weergegeven als overlevingscurven in figuur 4. Terwijl alle groepen die waren geïnoculeerd met de recombinante vaccins en LS 100 procent overleving vertoonden, hadden de vogels in de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-groepen 58,3 procent, respectievelijk 58,3 procent en 66,6 procent overleving. De overleving na blootstelling in de Hatch- en de BHI-controlegroepen was significant lager in vergelijking met de experimentele vaccingroepen. Merk op dat, hoewel het lichaamsgewicht van de vogels in de gevaccineerde groepen na het uitkomen fluctueerde in vergelijking met de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controles, alle rNDV-gevaccineerde vogels (282-328 g) het lichaamsgewicht van de niet-gevaccineerde vogels overtroffen. controle vogels na uitdaging (255-266 g) (Tabel 1). Er werd echter geen significant verschil in lichaamsgewicht waargenomen tussen een van de bestudeerde groepen.

Figuur 4. Overleving van kippen na inoculatie van commerciële eieren na 18 dagen embryonatie met experimentele in ovo-vaccins en vroege blootstelling met virulent virus van de ziekte van Newcastle 14 dagen na het uitkomen. Vogels werden gedurende 14 dagen na prikkeling gevolgd. Verschillende superscriptletters duiden op statistisch significante verschillen tussen groepen (p-waarde < 0.05). Groepsafkortingen: HATCH - eieren niet geïnoculeerd; BHI - eieren geïnoculeerd met BHI; rHVT-ND - eieren geïnoculeerd met recombinant HVT-vaccin; ZJ1*L - eieren die zijn geïnoculeerd met het recombinante ZJ1*L-virus waarvan de splitsingsplaats is gemodificeerd om een ​​lage virulentie te hebben; ZJ1*L-IL4R: eieren geïnoculeerd met de recombinante laag-virulente ZJ1*L met het interleukine-4-gen geïnsereerd in omgekeerde oriëntatie; LS - eieren geïnoculeerd met de LaSota-stam; LS-IL4R: eieren geïnoculeerd met het recombinante LaSota-virus met het interleukine-4-gen in omgekeerde richting ingevoegd. De virusdosis die de eieren in elke groep hebben gekregen, wordt weergegeven als een nummer achter de groepsnaam in EID50/per ei.

3.5. Verlies van post-challenge zoals aangetoond door rRT-PCR

Bij 2 DPC werpen de vogels in de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen hoge virale titers (1{{20}}5,3-5,7 EID50/ml) af via de orale route, terwijl alle vaccingroepen had een gemiddelde uitscheidingstiter van minder dan 104 EID50/ml (Figuur 5A). De resultaten voor virale uitscheiding door de cloaca lagen in alle groepen onder de detectielimiet van de assay. Bij 2 DPC hadden de vogels in alle ZJ1*L- en ZJ1*L-IL4R-groepen en die in de LS-IL4R 105.5-groep significant minder viraal RNA gedetecteerd via de orale route in vergelijking met de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen (p-waarden varieerden tussen 0,001 en 0,02). Bij 4 DPC was de uitscheiding via de orale route in de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-groepen hoog (106,2 − 6,9 EID50/mL) (Figuur 5B).

Daarentegen werd in alle vaccingroepen minder uitscheiding waargenomen bij 4 DPC vergeleken met 2 DPC, met de hoogste gemiddelde titer van 102,9 EID50/ml in de ZJ1*L 104,5-groep en de laagste gemiddelde titer van 101,5 EID50/ml in de ZJ1* l-IL4R 104.5-groep (viraal RNA werd bij sommige vogels niet gedetecteerd). Alle experimentele rNDV-vaccingroepen scheidden significant minder virus af via de orale route in vergelijking met de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen (p-waarden van<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Figuur 5. Gemiddelde post-provocatie virale uitscheiding van kippen na inoculatie van commerciële eieren na 18 dagen embryonatie met experimentele in ovo-vaccins en vroege provocatie met virulent virus van de ziekte van Newcastle 14 dagen na uitkomen. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt NDV-titers gedetecteerd in orofaryngeale (OP) en cloacale (CL) uitstrijkjes op verschillende dagen na provocatie (DPC). Afscheiding wordt afzonderlijk aangeboden gedurende 2 dagen na de uitdaging (A) en 4 dagen na de uitdaging (B). Staven vertegenwoordigen standaarddeviaties van het gemiddelde. Alle uitstrijkjes waarvan het virus niet werd gedetecteerd, kregen een numerieke waarde van 1 log onder de detectiegrens. De detectielimiet van rRT-PCR wordt weergegeven als een horizontale stippellijn.

Statistisch significante verschillen tussen de verschillende groepen worden weergegeven met kleine letters boven elke groep (p-waarde < 0.05). Groepsafkortingen: HATCH - eieren niet geïnoculeerd; BHI - eieren geïnoculeerd met BHI; rHVT-ND - eieren geïnoculeerd met recombinant HVT-vaccin; ZJ1*L - eieren die zijn geïnoculeerd met het recombinante ZJ1*L-virus waarvan de splitsingsplaats is gemodificeerd om een ​​lage virulentie te hebben; ZJ1*L-IL4R: eieren geïnoculeerd met de recombinante laag-virulente ZJ1*L met het interleukine-4-gen in omgekeerde richting ingevoegd; LS - eieren geïnoculeerd met de LaSota-stam; LS-IL4R: eieren geïnoculeerd met het recombinante LaSota-virus met het interleukine-4-gen in omgekeerde richting ingevoegd. De virusdosis die de eieren in elke groep hebben gekregen, wordt weergegeven als een nummer achter de groepsnaam in EID50/per ei.

3.6. Serologie na de uitdaging

Alle vogels in de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen vertoonden verhoogde (meer dan het dubbele) HI-antilichaamtiters bij 14 DPC (boven log2 10) in vergelijking met de pre-provocatietiters bij 13 DPH (log{ {6}}.7). De verschillen in de titers in deze drie groepen vóór en na de provocatie waren significant (p-waarde<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Geïnoculeerde SPF-controlegroepen

De overleving in de SPF-controlegroepen na het uitkomen was 66,7 procent in de groep die was geïnoculeerd met ZJ1*L 103.5 en 57,1 procent in de groep die was ingeënt met ZJ1*L-IL4R 103.5 (aanvullend figuur S3A). Actieve virale uitscheiding werd gedetecteerd bij de vogels in de SPF-controlegroepen via beide routes, met hogere titers gedetecteerd in de orofaryngeale uitstrijkjes (zie aanvullende figuur S3B). De HI-titers na vaccinatie van de geïnoculeerde SPF-controlevogels waren hoger dan de titers in de Hatch-, BHI- en rHVT-ND-controlegroepen en bereikten gemiddelde waarden van log2 7.08 en log2 7. 58 op 13 DPH in respectievelijk de groepen ZJ1 * L-IL4R 103.5 en ZJ1 * L-IL4R 103.5 (zie aanvullende figuur S3C). Er werden geen klinische tekenen of mortaliteit na blootstelling waargenomen in de twee geïnoculeerde SPF-controlegroepen (zie aanvullende figuur S3D voor overlevingscurven). De vogels uit de geïnoculeerde SPF-controlegroepen scheidden significant minder virus af via de orale route bij 2 DPC en 4 DPC in vergelijking met de controlegroepen (p-waarden van<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com