Olive Leaf Extract (OLE) Verminderde door vasopressine geïnduceerde Aquaporin-2-transfectie door de activering van de calciumgevoelige receptor

Voor meer informatie. contact:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressine (AVP) verhoogt de waterdoorlaatbaarheid in denierverzamelbuis door de regulering van aquaporine-2 (AQP2) handel. Verschillende aandoeningen, waaronder hypertensie en ongepaste secretie van antidiuretisch hormoon (SIADH), zijn geassocieerd met afwijkingen in de waterhomeostase. Het is aangetoond dat bepaalde fytoverbindingen gunstig zijn voor de menselijke gezondheid. Hier zijn de effecten van het Olive Leaf Extract (OLE) geëvalueerd met behulp van in vitro en in vivo modellen. Confocale onderzoeken toonden aan dat OLE de door vasopressine geïnduceerde AQP2-translocatie naar het plasmamembraan in MCD4-cellen en ratten voorkomtnieren. Incubatie met OLE verlaagt de AVP-afhankelijke toename van de osmotische waterpermeabiliteitscoëfficiënt (Pf). Om de mogelijke effectoren van OLE op te helderen, werd intracellulair calcium geëvalueerd. OLE verhoogt het intracellulaire calcium door de activering van de Calcium Sensing Receptor (CaSR). NPS2143 , een selectieve CaSR-remmer, schafte het remmende effect van OLE op AVP-afhankelijke waterpermeabiliteit af. In vivo-experimenten onthulden dat behandeling met OLE de expressie van het CaSR-mRNA verhoogt en het AQP2-mRNA verlaagt, parallel met een toename van het AQP2-gerichte miRNA-137. Samen suggereren deze bevindingen dat OLE de werking van vasopressine antagoniseert door stimulatie van de CaSR, wat aangeeft dat dit extract gunstig kan zijn voor het verminderen van aandoeningen die worden gekenmerkt door abnormale CaSR-signalering en die de reabsorptie van nierwater beïnvloeden.

Olijfboombladeren zijn op grote schaal gebruikt als traditionele remedies om verschillende ziekten te genezen, vooral in mediterrane landen. Bladeren worden vaak geconsumeerd in het menselijke dieet als een extract of poeder om infusies of kruidenthee te bereiden. Chemische karakteriseringsanalyse onthulde dat olijfboombladeren verschillende bioactieve verbindingen bevatten die gunstige effecten kunnen hebben bij bepaalde morbiditeiten zoals metabool syndroom, dyslipidemie en hypertensie. Bij patiënten met essentiële hypertensie verlaagde OLE de bloeddruk en enigszins verminderde glycemie en calcemie'. Er zijn talrijke polyfenolen gevonden, zoals oleuropeïne, hydroxytyrosol en tyrosol, die zijn verrijkt met een extract van groene olijfbladeren (OLE)5, en het is bekend dat ze betrokken zijn bij de preventie van bepaalde ziekten die worden gekenmerkt door oxidatieve stress. Daarom neemt de interesse in het onderzoeken van de mogelijke gunstige effecten van olijfbladextract de laatste jaren toe onder wetenschappers in verschillende onderzoeksgebieden. OIE vertoonde een significant antiproliferatief effect in kwaadaardige mesothelioomcellen door de intracellulaire calciumdynamiek te veranderen, mogelijk gericht op T- type Ca2 plus kanalen. Interessant is dat OLE antihypertensieve effecten heeft op genetische hypertensie bij spontaan hypertensieve ratten (SHR), gerelateerd aan de verbetering van de vaatfunctie*. Overmatige reabsorptie van water speelt een belangrijke rol bij de pathogenese van verhoogde bloeddruk. Bij hypertensieve patiënten, die werden behandeld met olijfbladextract, werd een significante vermindering van verschillende ontstekingsfactoren gevonden in verband met een verlaging van de bloeddruk. Bovendien kenmerkt overmatige waterretentie verschillende aandoeningen zoals levercirrose, hartfalen en ongepaste secretie van antidiuretisch hormoon (SIADH). De homeostase van het lichaamswater wordt streng gecontroleerd door het antidiuretisch hormoon vasopressine (AVP) dat vrijkomt in de gedehydrateerde toestand. AVP bindt zijn verwante V2R-receptor gelokaliseerd op het basolaterale membraan vannierbelangrijkste cellen waardoor de cAMP-signaalroute wordt geactiveerd die resulteert in de translocatie van de aquaporine-2(AQP2)-dragende blaasjes van een intracellulaire pool naar het apicale plasmamembraan waar waterreabsorptie plaatsvindt. Op moleculair niveau kunnen verschillende factoren de renale waterbalans moduleren. Een verhoogd niveau van luminaal calcium zorgde voor een neerwaartse regulatie van de vasopressine-afhankelijke AOP2-transport op korte termijn door de activering van de calciumgevoelige receptor (CaSR)1,12. Aan de andere kant induceerde CaSR-activering in voorwaardelijk onsterfelijk gemaakte proximale tubulaire epitheelcellen van de nier, geïsoleerd uit de menselijke urine, een significante toename van cytosolisch calcium en verminderde significant de toename van cAMP opgewekt door forskoline (FK), een directe activator van adenylaat cvclase3. , in nierverzamelbuis MCD4-cellen, die het waterkanaal AOP2 stabiel tot expressie brengen, verzwakte stimulatie van de CaSR de cAMP-afhankelijke toename in AQP2-fosforylering bij serine 256, wat een cruciale gebeurtenis is in de signaaltransductiecascade geactiveerd door vasopressine en die uiteindelijk de waterpermeabiliteit verhoogde4 ,15 Verder, innierplakjes van de binnenste medulla-muisnier, veroorzaakte activering van de CaSR met de calcimimetische NPS-R568 een significante toename van de AQP2-targeting miRNA-137, wat een nauw samenspel bevestigt tussen de CaSR-signaalroute en AQP{ {4}}afhankelijke waterpermeabiliteitl.17.In de huidige studie werden de effecten van het olijfbladextract, verkregen van de lokale Coratina-cultivar, geëvalueerd op de door vasopressine geïnduceerde AQP2-functie in MCD4-cellen van de nierverzamelbuis die AOP2 stabiel tot expressie brengen en in dDAVP behandelde ratten geïnjecteerd met het extract. We leveren bewijs dat OLE-behandeling de vasopressinerespons in niercellen tegengaat, wat gedeeltelijk het diuretische effect ervan zou kunnen verklaren. Interessant is dat dit effect verband lijkt te houden met OLE-geïnduceerde activering van de CaSR, een receptor waarvan bekend is dat deze een negatieve wisselwerking heeft met de vasopressinereceptorl2.

Lees meer effecten van cistanche op de nieren

Resultaten

Effecten van OLE op door vasopressine geïnduceerde AQP2-functie in MCD4-cellen. Om de mogelijke betrokkenheid van OLE op de vasopressine-afhankelijke AQP2-functie te onderzoeken,nierverzamelbuis MCD4-cellen, die stabiel de vasopressinereceptor 2 (V2R) en humaan AQP2 tot expressie brengen, werden gebruikt als een experimenteel model . Con-focale studies (Fig. 1A) onthulden dat, vergeleken met met dDAVP behandelde cellen, waarbij AQP2-kleuring gelokaliseerd was op het apicale plasmamembraan, behandeling met OLE de membraanlokalisatie van AOP2 veroorzaakt door stimulatie met dDAVP verhinderde. In overeenstemming met deze waarnemingen verminderde OLE-behandeling de door dDAVP geïnduceerde toename van de temporale osmotische respons (aangegeven als 1/t in Fig.1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 procent, n=292 cellen vs dDAVP=206,8±5,49 procent ,n=186 cellen;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Effecten van OLE op de nieren van ratten die met OLE zijn geïnjecteerd.

Om de werking van OLE verder te onderzoeken, zijn in vivo studies uitgevoerd. In het bijzonder zijn ratten gedurende drie dagen eenmaal per dag met OLE (250 mg/kg/dag) geïnjecteerd. Als alternatief werden ratten gedurende 3 dagen gelijktijdig behandeld met OLE en 30 minuten met dDAVP. Evaluatie van CaSR-mRNA dat werd geïsoleerd uit het nierverzamelkanaal van ratten en verwerkt voor real-time PCR (Fig. 6) onthulde een significante toename van CaSR-mRNA in OLE (OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} ratten versus CTR=1.02±0.17, n=5 ratten; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">nier, Western-blotting-analyse en confocale onderzoeken werden uitgevoerd (Fig.9). Bij OLE/dDAVP-geïnjecteerde ratten was fosforylering van AQP2 bij serine 256 significant verminderd in vergelijking met nierweefsels van met dDAVP behandelde dieren (OLE/dDAVP=0. 77±0.16, n=5 ratten vs dDAVP=2.16±0.25,n=5 ratten; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Discussie

Calcium is een belangrijke intracellulaire boodschapper die een overvloed aan cellulaire functies moduleert. Abnormale calciumsignalering kan leiden tot verschillende ziekten, waaronder hartfalen, kanker en hypertensie23. Specifieke controle van de expressie en de activiteit van eiwitten die meerdere intracellulaire calciumsignalen controleren, is succesvol gebleken om talrijke aandoeningen het hoofd te bieden en is daarom aantrekkelijk voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze studie biedt nieuwe inzichten in het werkingsmechanisme van OLE door aan te tonen dat het in staat is om intracellulaire calciumsignalering te moduleren door de stimulatie van de CaSR die betrokken is bij het verfijnen van de door vasopressine geïnduceerde AQP2-handel en expressie. Onder fysiologische omstandigheden speelt AQP2 een belangrijke rol bij het beheersen van de homeostase van lichaamswater25. Stimulatie van de intracellulaire machinerie, wat leidt tot lokalisatie van AQP2 op het apicale plasmamembraan, resulteert in abnormale waterretentie en daaruit voortvloeiende hyponatriëmie zoals bij het syndroom van ongepaste secretie van antidiuretisch hormoon (SIADH), levercirrose en congestief hartfalen. Bij een muis model van SIADH, geassocieerd met polycystische nierziekte 1 haploinsufficiëntie, was het basale intracellulaire calciumniveau significant verlaagd in vergelijking met het niveau gemeten in de verzamelbuizen van wildtype muizen. Laag intracellulair calcium zorgde voor een neerwaartse regulatie van de activiteit van bepaalde enzymen, waaronder het eiwitfosfatase PP2A, wat resulteerde in de opregulatie van AOP2-fosforylering bij serine 2561. Daarentegen. activering van de CaSR met het calcimimetische NPS-R568 verhoogde de intracellulaire calciumconcentratie en verlaagde het cAMP-niveau in PKD1-deficiënte cellen. Belangrijk is dat cytosolisch calcium het door calcium te remmen geadenyleerde cyclase3 kan neerwaarts reguleren, waardoor het intracellulaire niveau van cAMP wordt verfijnd. cyclase4. In deze studie voorkwam behandeling met OLE de vasopressine-afhankelijke toename van het cAMP en AOP2-pS256, mogelijk secundair aan een toename van de intracellulaire calciumconcentratie. Merk op dat blootstelling aan een externe bron van cAMP met behulp van permeabel 8-Br-cAMP het remmende effect van OLE op de V2R-route significant tegenging.

Een verhoogd niveau van cytosolisch calcium kan leiden tot celdood en apoptose. Een aanhoudende toename van intracellulair calcium van 250 nM tot meer dan 600 nM bevorderde de overleving van neuronen4. In MCD4-cellen geeft behandeling met OLE van 0,1 mg/ml geen een cytotoxisch effect. Bij deze concentratie verhoogde OLE (0,1 mg/ml) het intracellulaire calciumgehalte enigszins. Calciumbeeldvorming onthulde dat acute stimulatie met OLE een voorbijgaande toename van intracellulair calcium veroorzaakte door de activering van de CaSR die wordt opgeheven wanneer cellen werden voorgeïncubeerd met de selectieve CaSR-antagonist NPS2143. In renale proximale tubuluscellen, allosterische activering van de CaSR met I-ornithine verminderde de ROS-productie en verminderde daardoor de mitochondriale oxidatieve stress die celapoptose veroorzaakte356. Bovendien toonde onze vorige studie aan dat de expressie van de gain-of-function-varianten van de CaSR de ROS-afgifte en S-glutathionylering van AQP237 verminderde. Incubatie met OLE verminderde de ROS-generatie in MCD4-cellen, wat zijn antioxidantvermogen aantoont. Desalniettemin is het op dit moment onduidelijk of OLE invloed heeft op AOP2-S-glutathionylering. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat OLE of oleuropeïne, het hoofdbestanddeel van OLE, een beschermende rol kan spelen door celdood te remmen39. Er zijn echter dosisafhankelijke effecten beschreven bij ratten die OLE kregen. Gunstige reacties werden verkregen bij doses van 250 en 500 mg/kg. Daarentegen kan behandeling met OLE bij hogere concentraties schadelijke effecten hebben, mogelijk door de pro-oxidant werking van verschillende fytoverbindingen. In deze studie werden ratten gedurende drie dagen geïnjecteerd met OLE in een dosis van 250 mg/kg, wat een opregulatie van CaSR vertoonde. Het expressieniveau van de CaSR wordt verhoogd door bepaalde verbindingen die werken als allosterische activatoren van de receptor. Calcimimetica verminderden inderdaad de vasculaire calcificaties door de biosynthese van de CaSR in menselijke vasculaire gladde spiercellen te verhogen. In deze wedstrijd kan de mogelijkheid niet worden uitgesloten dat bepaalde verbindingen in OLE kunnen functioneren als allosterische modulatoren van de CaSR. Aan de andere kant kan stimulatie met vasopressine leiden tot IL-6-afgifte die kan bijdragen aan het verhogen van het expressieniveau van de CaSR42.

In de nier wordt stimulatie van de CaSR-signalering geassocieerd met een neerwaartse regulatie van AQP2-expressie, mogelijk via de miR-137-generatie. miRNA's zijn cruciale posttranscriptionele modulatoren. Verschillende vasopressine-afhankelijke miRNA's die gericht zijn op AQP2-expressie zijn ook beschreven . Transfectie met miR-32 en miR-137 verminderde het expressieniveau van AOP2 in mpkCCDc14-cellen aanzienlijk. Interessant is dat OLE ontstekingssignalen kan verzwakken en beschermende effecten kan uitoefenen door het expressieniveau van verschillende miRNA's te moduleren". de Akt/mTOR-signaleringsroute 46. Merk op dat behandeling met oleuropeïne Akt/mTOR-signalering voorkomt door de activering van door calcium geïnduceerd CAMK en AMPK. Activering van CaSR met NPS-R568 activeert AMPK en vermindert de mTOR-activiteit in menselijke proximale tubulaire cellen3. In overeenstemming met deze bevindingen verhoogt incubatie met OLE het cytosolische calcium, verlaagt het de PKA-activiteit en vermindert het de cystegrootte in een 3D-celcultuurmodel . Samen suggereren deze bevindingen dat OLE nuttig kan zijn bij de behandeling van aandoeningen die worden gekenmerkt door ontregeling van de intracellulaire calciumdynamiek die verband houdt met de neerwaartse regulatie van CaSR-signalering.

Olijfbladextract bestaat uit verschillende bioactieve componenten, waaronder polyfenolen, vezels en mineralen49. Op dit moment is het niet duidelijk of één verbinding of een synergetische combinatie van fytoverbindingen in OLE gunstig kan zijn bij het moduleren van intracellulaire reacties. Het extract dat in dit onderzoek is gebruikt, is toegepast als een mogelijk voedingsadditief en het is daarom belangrijk om de fysiologische impact van het extract zelf te definiëren, aangezien verschillende fenolen, waaronder hydroxytyrosol, door de nieren kunnen worden gefilterd en in de urine kunnen worden teruggevonden50. Verdere studies zullen de werkzaamheid opleveren van specifieke componenten die de intracellulaire calciumsignalering via de CaSR actief kunnen reguleren. Concluderend levert deze studie bewijs dat OLE kan worden beschouwd als een nieuw potentieel adjuvans dat nuttig is om aandoeningen te verminderen die worden gekenmerkt door een vermindering van CaSR-expressie, evenals signalering en beïnvloeding van de renale waterpermeabiliteit.

materialen en methodes

Chemicaliën en antilichamen.Alle chemicaliën en antibiotica werden gekocht bij Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). Calcein-AM, Fura-2-AM, celkweekmedia, foetaal runderserum (FBS) en Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). Aquaporin{ {2}}(AQP2) werd gedetecteerd met behulp van specifieke antilichamen (C-tail Ab) opgewekt tegen een synthetisch peptide dat overeenkomt met de laatste 15 C-terminale aminozuren van humaan AQP2!. AQP2-pS256-antilichamen werden vriendelijk geschonken door prof. Peter Deen. Secundaire anti-konijn-mierikswortelperoxidase-gekoppelde antilichamen werden verkregen van Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland). Een secundair geit-anti-konijn antilichaam gekoppeld aan Alexa -488 werd gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS).

Productie van fenolenrijk extract en chemische karakterisering.De productie van een fenolrijk extract van olijfbladeren werd uitgevoerd zoals gerapporteerd in Ranieri et al.35. Na malen met een blender (Waring-Commercial, Torrington, CT, VS), werd ddH2O-water toegevoegd (verhouding 1/20, w/y) en vervolgens driemaal onderworpen aan ultrageluid (CEIA, Viciomaggio, Italië) , gedurende 30 minuten bij 35 ± 5 graden elke keer. Ten slotte werden de extracten gefiltreerd door filtreerpapier, gevriesdroogd en bewaard bij -20 graad C. De verkregen extracten werden gefiltreerd met nylonfilters van 0,45 m（Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland, en gebruikt voor chemische karakterisering. Het totale fenolgehalte, de antioxidantactiviteit en de identificatie van afzonderlijke fenolverbindingen werden uitgevoerd volgens Difonzo et al.. De OLE toonde een gehalte aan polyfenolen, bepaald door Folin-Ciocalteu, gelijk aan 195 mg. galluszuurequivalenten (GAE) en een antioxidantactiviteit, bepaald door ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuurdiammoniumzout）, goed voor 750 μmol TE (Trolox-equivalenten) .

Celcultuur en behandelingen.MCD4-cellen van de corticale verzamelbuis van de muis, die stabiel menselijk AQP2 en de chimere V2R-Rluc tot expressie brengen, werden gebruikt als een experimenteel model . Cellen werden gekweekt in een 1:1 mengsel van met Dalbec-cos gemodificeerd Eagle's medium en F-12 aangevuld met 5 procent (y/y) foetaal runderserum. 1 procent (j/j)L-glutamine en 1 procent penicilline/streptomycine,5 μM dexamethason,400 ug/ml G418（voor AQP2-resistentie） en 1 ug/ml puromycine (voor V2R-Rluc-resistentie) , in een bevochtigde atmosfeer van 5 procent CO, bij 37 graden. MCD4-cellen werden onder basale conditie (CTR) gelaten of langdurig behandeld met OLE bij 0,1 mg/ml O/N, dDAVP bij 100 nM gedurende 30 minuten, of gelijktijdig behandeld met OLE en dDAVP of NPS2143 bij 1 μM O/N Als alternatief werden cellen gedurende 45 minuten blootgesteld aan 8-Br-cAMP bij 500 M, kortetermijnexperimenten werden uitgevoerd met OLE bij 1 mg/ml gedurende 5 minuten en NPS2143 bij 10 μM gedurende 15 minuten. Experimenten werden 3-5 onafhankelijke tijden uitgevoerd met behulp van cellen uit verschillende passages.

Diermodel en behandelingen.Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Deense nationale richtlijnen voor de verzorging en behandeling van proefdieren en de gepubliceerde richtlijnen van de National Institutes of Health. De protocollen werden goedgekeurd door het Institute of Clinical Medicine. Aarhus University, volgens de licenties voor het gebruik van proefdieren die zijn afgegeven door het Deense ministerie van justitie (goedkeuringsnummer 2015-15-0201-00658). Er zijn onderzoeken uitgevoerd bij volwassen mannelijke Wistar-ratten met een startgewicht van 200-225 g. Dieren werden op een standaard knaagdierdieet gehouden (Altromin, Lage, Duitsland) en hadden vrije toegang tot kraanwater. Tijdens de experimenten werden ratten gehuisvest in groepen van twee per kooi, met een licht-donkercyclus van 12:12 uur, een temperatuur van 21 ± 2 ° C en een vochtigheid van 55 ± 2 procent. Vijf ratten werden behandeld met subcutane injectie van 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Denemarken) in 200 ul zoutoplossing/dier, en vijf met drager behandelde ratten dienden als controles. Na 30 min werden de ratten gedood en werden de nieren verwerkt zoals hieronder beschreven.

Cellen en IMCD-lysaten.Cellen werden gekweekt op {{0}} mm schalen en opnieuw gesuspendeerd in een buffer die 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, {{10}} bevatte. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 in aanwezigheid van proteasen (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptine en 2 mg/ml pepstatine A) en fosfatasen (10 mM NaF en 1 mM natriumorthovanadaat)remmers. Als alternatief werden niercoupes van ongeveer 0,5 mm bereid en gedurende 10 minuten geëquilibreerd in een buffer die 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 en 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Nierpapillen werden fijngehakt met een schaar in dezelfde buffer in aanwezigheid van proteasen (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptine en 2 mg/ml pepstatine A) en fosfatasen (10 mM NaF en 1 mM natrium orthovanadaat) remmers. Na sonicatie (60 kHz gedurende 5 s) werden lysaten gecentrifugeerd bij 12, 000 x g gedurende 10 min. De supernatanten werden verzameld en gebruikt voor immunoblotting-onderzoeken'8.

Confocale microscopie.Confocale onderzoeken werden uitgevoerd zoals eerder beschreven . In het kort werden cellen gekweekt op celkweek PET-inserts en behandeld zoals hierboven beschreven. Als alternatief werden niersecties verkregen uit controle, OLE, dDAVP en OLE met met dDAVP behandelde ratten onderworpen aan immunofluorescentie-experimenten zoals eerder beschreven. Beelden werden verkregen met een confocale laser-scanning fluorescentiemicroscoop Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Zwitserland). Gelelektroforese en immunoblotting. Eiwitten werden gescheiden op 12 procent vlekvrije polyacrylamidegels (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, VS.A.) onder reducerende omstandigheden zoals eerder beschreven =5,52. In het kort werden eiwitbanden overgebracht op Immobilon-P-membranen (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) en onderworpen aan immunoblotting met behulp van anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) en anti-AQP2-pS256-antilichamen. Immunoreactieve signalen werden verkregen met behulp van Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates met Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, VS). Banden werden genormaliseerd naar totaal eiwit met behulp van vlekvrije technologie (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, VS). Densitometrie-analyse werd uitgevoerd met ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, VS) en geanalyseerd met GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, VS).

Waterpermeabiliteitstest.Osmotische waterpermeabiliteit werd gemeten zoals eerder beschreven . In het kort werden MCD4-cellen gekweekt op glazen dekglaasjes van 40- mm. Na behandelingen werden de cellen gedurende 45 minuten bij 37 graden, 5% CO, in DMEM/F-12 geladen met 10 μM membraanpermeabele Calcein-AM. Dekglaasjes werden gemonteerd in een perfusiekamer (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, VS). Metingen werden uitgevoerd met behulp van een omgekeerde TE2000-S-microscoop (Nikon Eclipse-microscoop, Tokyo, Japan) uitgerust voor eencellige fluorescentiemetingen en beeldanalyse. De met Calcein-AM geladen monsters werden geëxciteerd bij 490 nm. Fluorescentiemetingen, na isosmotische (140 mM NaCl.5 mM KCl,1 mM MgCl..1 mM CaCl.,10 mM Hepes-sulfonzuur,5 mM Glucose,pH7.4) of hyperosmotische (isosmotische oplossing toegevoegd met 135 mM Mannitol) oplossingen . werden uitgevoerd met behulp van Metafluor-software (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada). Tijdsverloop fluorescentiegegevens na perfusie van cellen met iso- en hyperosmotische oplossingen werden geregistreerd. Het tijdsverloop van celkrimp werd gemeten als de tijdconstante (Ki, uitgedrukt als 1/r, sec), een parameter die gecorreleerd is met de waterdoorlatendheid, verkregen door gegevens uit te rusten met een exponentiële functie geanalyseerd met GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, VS).

Fluorescentie resonantie energieoverdracht metingen.Om intracellulaire cAMP-veranderingen te evalueren, werd fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) -technologie toegepast. Voor FRET-experimenten werden cellen getransfecteerd met een plasmide dat codeert voor de H96-sensor die het cAMP-bindende consensusmotief van EPAC1 bevat ingebed tussen het cyaan fluorescerende eiwit (CFP) en cp173Venus-Venus zoals eerder getoond32.33.54. Het plasmide dat codeert voor de H96-probe was een geschenk van Dr.K. Jalink. Visualisatie van cellen die ECFP en/of EYFP tot expressie brengen en detectie van FRET werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde TE 2000- S-microscoop (Nikon Eclipse-microscoop, Tokyo, Japan). Elke afbeelding werd gecorrigeerd en geanalyseerd zoals eerder getoond55.

Intracellulaire calciummetingen. Intracellulaire calciummetingen werden uitgevoerd zoals eerder getoond . In het kort werden MCD4-cellen geladen met 4 μM Fura -2 AM gedurende 15 minuten bij 37 graden in DMEM / F -12. Ringer's oplossing werd gebruikt om cellen te perfuseren tijdens het experiment dat 140 mM NaCl, 5 mM KC1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM glucose, 1,8 mM CaCl, pH 7,4 bevatte. Bij fluorescentiemetingen werden de dekglaasjes met overbelaste cellen in een perfusiekamer gemonteerd (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, VS). Metingen werden uitgevoerd met behulp van een omgekeerde TE2000-S-microscoop (Nikon Eclipse-microscoop, Tokyo, Japan). De verhouding van fluorescentie-intensiteiten bij 340 en 380 nm werd uitgezet en berekend als de verandering in fluorescentie. In het bijzonder werd stimulatie met OLE（1 mg/ml） of NPS2143 （10 M） vergeleken in hetzelfde celtype met die verkregen na stimulatie met een maximale dosis van de calcium-gemedieerde agonist ATP（100 μM） die werd gebruikt als een interne controle (100 procent).

Het intracellulaire calciumniveau werd gemeten bij steady-state en gekalibreerd zoals beschreven door Grynkiewicz57. OLE en NPS2143 werden langdurig gebruikt bij respectievelijk 0,1 mg/ml en l uM, en elk monster werd gekalibreerd door toevoeging van 5 M ionomycine in aanwezigheid van 1 mM EGTA（Rm.） gevolgd door 5 μM ionomycine in 5 mM CaCl, (RMA).

Realtime PCR-analyse van AQP2- en CaSR-mRNA bij controle- en behandelde ratten.Er werden real-time PCR-experimenten uitgevoerd om de relatieve expressie van mRNA in de binnenste medulla verzamelbuis (IMCD) te meten, geïsoleerd uit controle en behandelde rattennierpapillen. Er werden nierschijfjes van ongeveer 0,5 mm gemaakt en gedurende 10 minuten geëquilibreerd in een buffer met 118 mM NaCl,16 mM HEPES,17 mM Na-Hepes,14 mM glucose, 3,2 mM KCl,2,5 mM CaCl2,1.8 mM MgS04 en 1,8 mM KH2P04 (pH 7,4). De nierpapil werd geïsoleerd onder een stereomicroscoop. Monsters van controle- en behandelde ratten werden vervolgens met een schaar direct in Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) fijngehakt. Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd op 2,5 ug totaal RNA met behulp van SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS), in overeenstemming met de suggesties van de fabrikant (25C gedurende 10 min; 42C gedurende 60 min; 85C gedurende 5 min). Realtime PCR-amplificatie werd uitgevoerd met behulp van TagMan Fast Advanced Master Mix met CaSR-, AOP2- en GAPDH-assays (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) in StepOne Real-Time PCR-systeem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). ), waarbij de thermische cyclusomstandigheden worden ingesteld zoals gespecificeerd door de fabrikant (95 ° C gedurende 20 s; 40 cycli alternatief bij 95 ° C gedurende 1 s en 60 ° C gedurende 20 s). De resultaten werden uitgedrukt als 2- waarden (relatieve kwantificering) met △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) behandeld-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

miRNA-137-evaluatie bij controle- en behandelde ratten.miRNA{{0}} inhoud in controle en behandelde binnenste medulla verzamelbuis van ratten werd geëvalueerd met behulp van TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .USA), die zeer gevoelige en specifieke melding van volwassen miRNA mogelijk maakte met behulp van kwantitatieve PCR. Er werden nierschijfjes van ongeveer 0,5 mm gemaakt en gedurende 10 minuten geëquilibreerd in een buffer met 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 en 1,8 mM KH2PO4(pH7.4). De nierpapil werd geïsoleerd onder een stereomicroscoop. Monsters van controle- en behandelde ratten werden vervolgens met een schaar rechtstreeks in Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) fijngehakt om totaal RNA te extraheren. TaqMan Geavanceerde miRNA cDNA-synthesekit （Catalogus n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS, werd gebruikt om cDNA-synthese te verkrijgen, volgens het protocol van de fabrikant (Poly (A) staartreactie; ligatiereactie; omgekeerde transcriptiereactie; miR-Amp-reactie). Het synthetische RNA (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) met 59-fosfor werd gesynthetiseerd door Thermo Fisher Scientific en gebruikt om een ​​kalibratiecurve uit te voeren om miRNA-monsterwaarden te interpoleren en om een ​​nauwkeurige evaluatie (in nanogram) van het miR-137-gehalte in samples16, met behulp van GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, VS).

Statistische analyse.Alle waarden worden gerapporteerd als gemiddelden ± SEM Statistische analyse werd uitgevoerd door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Newman-Keuls meervoudige vergelijkingstest met *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Verklaringen, ethische goedkeuring en toestemming om deel te nemen.Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de Deense nationale richtlijnen voor de verzorging en behandeling van proefdieren en de gepubliceerde richtlijnen van de National Institutes of Health. De ethische commissie voor dierverzorging van het Institute of Clinical Medicine, Aarhus University keurde de onderzoeksprotocollen goed, volgens de licenties voor het gebruik van proefdieren die zijn afgegeven door het Deense ministerie van Justitie (goedkeuringsnummer 2015-15-0201-00658). De auteurs bevestigen dat alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Bovendien bevestigen de auteurs dat de studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen.

Referenties

1. El, SN & Karakaya, S. Olijfboom (Olea europaea) laat potentiële gunstige effecten op de menselijke gezondheid na. Nutr. Openb. 67, 632-638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Effecten van olijfbladextract op metabole respons, lever- en nierfuncties en inflammatoire biomarkers bij hypertensieve patiënten. PJBS 22, 342-348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive polyfenolen en het metabool syndroom. Moleculen

4. Cherif, S. et al. Een klinische proef van een getitreerd Olea-extract bij de behandeling van essentiële arteriële hypertensie. J. Farm. Belg. 51, 69-71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Groene extracten van de cortina-olijfcultivar laten de karakterisering van antioxidanten en biologische activiteit achter. J. Functie. Voedingsmiddelen 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Nieuwe mogelijkheden voor de valorisatie van bijproducten van olijfolie. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Oleuropeïne-verrijkt olijfbladextract beïnvloedt de calciumdynamiek en schaadt de levensvatbaarheid van kwaadaardige mesothelioomcellen. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Antihypertensieve effecten van met oleuropeïne verrijkt olijfbladextract bij spontaan hypertensieve ratten. Voedselfunctie 7, 584-593.

9. Hall, JE Nierdisfunctie, in plaats van niet-renale vasculaire disfunctie. Bemiddelt door zout veroorzaakte hypertensie. Oplage 133, 894-906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressine en de regulatie van aquaporine-2. clin. Exp. Nefrol. 17, 751-764.