Deel 1: Acteoside gaat interleukine--1 -geïnduceerde katabole processen tegen door de modulatie van mitogeen-geactiveerde eiwitkinasen en de NFκB cellulaire signaleringsroute

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang

Artrose (OA) is de meest voorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening met chronische gewrichtspijn veroorzaakt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen bij synoviale gewrichten.Acteoside, een caﬀeoylfenylethanoïde glycoside, heeft verschillende biologische activiteiten zoals antimicrobiële, ontstekingsremmende, kankerbestrijdende, antioxidatieve, cytoprotectieve en neuroprotectieve effecten. Verder orale toediening vanacteosidebij een hoge dosering veroorzaakt geen genotoxiciteit. Daarom is het doel van de huidige studie om de antikatabole effecten vanacteosidetegen artrose en zijn antikatabole signaalroute.Acteosideverminderde de levensvatbaarheid van muizen-fibroblast-L929-cellen die werden gebruikt als normale cellen en primaire rattenchondrocyten niet.Acteosideging het door IL-1 -geïnduceerde proteoglycaanverlies in de chondrocyten en gewrichtskraakbeen tegen door de expressie en activering van een kraakbeenafbrekend enzym zoals matrixmetalloproteïnase- (MMP-) 13, MMP-1 en MMP{ te onderdrukken {6}}. Bovendien onderdrukte acteoside de expressie van ontstekingsmediatoren zoals induceerbare stikstofmonoxidesynthase, cyclo-oxygenase-2, stikstofmonoxide en prostaglandine E2 in de primaire rattenchondrocyten die met IL-1 werden behandeld. Vervolgens werd de expressie van pro-inflammatoire cytokinen verlaagd door acteoside in de primaire rattenchondrocyten die waren behandeld met IL-1 . Bovendien onderdrukte acteoside niet alleen de fosforylering van door mitogeen geactiveerde eiwitkinasen in primaire rattenchondrocyten die met IL-1 waren behandeld, maar ook de translocatie van NFκB van het cytosol naar de kern door onderdrukking van de fosforylering ervan. Orale toediening van 5 en 10 mg/kg acteoside verzwakte de progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen in het osteoartritische muismodel, gegenereerd door destabilisatie van de mediale meniscus. Onze bevindingen geven aan datacteosideis een veelbelovend potentieel antikatabool middel of supplement om progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen te verminderen of te voorkomen.

cistanche-acteoside

1. Inleiding

Artrose (OA) is de meest voorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening met chronische gewrichtspijn veroorzaakt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen ter hoogte van synoviale gewrichten [1]. Vanwege de toename van de levensverwachting wordt de prevalentie van artrose met verlies van mobiliteit en chronische gewrichtspijn veroorzaakt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen ter hoogte van synoviale gewrichten geschat op respectievelijk 18 procent en 9,6 procent bij vrouwen na de menopauze en bij mannen [2. ]. Hoewel de wereldwijde prevalentie van artrose jaarlijks toeneemt, is de pathofysiologische etiologie van artrose nog onbekend. Het kan worden veroorzaakt door zeer complexe en multifactoriële risicofactoren zoals veroudering, geslacht, genetische overerving, traumatisch gewrichtsletsel en ernstige mechanische gewrichtsbelasting. Bovendien zijn de neuropathologische relaties tussen progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen en de ontwikkeling van chronische gewrichtspijn onbekend [3]. Daarom is het doel van klinische behandeling voor patiënten met artrose het behoud van de mobiliteit van het lichaam en de mechanische gewrichtsfunctie door verlichting van chronische gewrichtspijn, met behulp van farmacologische en niet-farmacologische benaderingen en gewrichtsvervangende chirurgie. De vraag naar de ontwikkeling van eectieve interventie of suppletie, met biologische veiligheid op lange termijn, om artrose te voorkomen of te verminderen om de levenskwaliteit te behouden door het behoud van de mechanische gewrichtsfunctie bij de oudere populatie neemt toe.

Zoals weergegeven in figuur 1, is acteoside (CAS-nr. 61276-17-3; C29H36O15) een caﬀeoylfenylethanoïde glycoside geïsoleerd uit verschillende kruidenplanten zoals Verbascum-chloriden [4], Buddleja globosa [5] en Plantago australis [6]. Acteoside heeft verschillende biologische activiteiten zoals antimicrobieel [5], ontstekingsremmend [7], antikanker [8], antioxidatief [9], cytoprotectief [9] en neuroprotectief effect [10]. Verder veroorzaakt orale toediening van acteoside in een hoge dosering geen genotoxiciteit [11].

Daarom veronderstelden we dat acteoside met anti-inflammatoire biologische veiligheid antikatabole effecten heeft die verband houden met de bescherming van gewrichtskraakbeen tegen progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen door onderdrukking van katabole factoren zoals de pro-inflammatoire cytokines, ontstekingsmediatoren en kraakbeenafbrekende enzymen in synoviale gewrichten . Daarom was het doel van deze studie om de door acteoside geïnduceerde antikatabole effecten en de cellulaire signaalroute ervan te onderzoeken, zowel in vitro, met behulp van primaire chondrocyten geïsoleerd uit het gewrichtskraakbeen van rattenkniegewricht, als in vivo, met behulp van een OA-diermodel gegenereerd door chirurgische destabilisatie van de mediale meniscus in het kniegewricht van muizen.

cistanche-acteoside

acteoside vancistanche

2. Methoden:

2.1. Cel cultuur. Primaire rattenchondrocyten werden geïsoleerd uit het gewrichtskraakbeen van de kniegewrichten van ratten (5-een dag oud; Sprague-Dawley), in overeenstemming met het protocol (CIA-CUC2019-A0027) dat is goedgekeurd door de Institutionele Animal Care and Use Committee van Chosun University, Gwangju, Republiek Korea. Geïsoleerde primaire rattenchondrocyten werden aangehouden in Dulbecco's Modiﬁed Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientiﬁc, Rockford, IL, USA) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, VS), antibiotica (50 E/ml penicilline en 50 ug/ml streptomycine) en 50 ug/ml ascorbinezuur. De normale muis fibroblast L-929 cellijn werd gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC). Volgens de instructies van ATCC werden L-929-cellen gekweekt in Eagle's minimaal essentieel medium, dat 10 procent FBS bevatte, en gekweekt in een bevochtigde incubator bij 37 graden met 5 procent CO2.

2.2. Levensvatbaarheidstest van de cel. De dimethylthiazolyldifenyltetrazoliumzout (MTT) -test werd uitgevoerd om de levensvatbaarheid te beoordelen van muizenfibroblastcellijn L929-cellen die werden gebruikt als een normale cel en primaire rattenchondrocyten behandeld met acteoside. Korte, L929-cellen en primaire rattenchondrocyten werden 24 uur gekweekt bij een celdichtheid van 8 x 105 cellen/ml in kweekplaten en vervolgens 24 uur behandeld met 2,5, 5, 10, 25, 50 en 100 μM acteoside. Na behandeling met MTT-oplossing werden zowel L929-cellen als chondrocyten gedurende 4 uur verder gekweekt. Na incubatie werden de gevormde MTT-kristallen volledig gesuspendeerd in dimethylsulfoxide en gemeten op absorptie bij 570 nm met behulp van een spectrometer (Epoch microplaat-spectrofotometer, BioTek®, Winooski, VT, VS) om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen.

2.3. Cell Live/Dead Assay. Celoverleving werd uitgevoerd met behulp van Cell Live / Dead-assaykit (Molecular Probes, Carlsbad, CA, VS), die is samengesteld uit groene calceïne-AM voor het labelen van levende cellen (met groene fluorescentie) en ethidiumhomodimeer -1 voor het labelen van dood cellen (met rode fluorescentie). Kortstondig werden zowel L929-cellen als primaire rattenchondrocyten gekweekt bij een celdichtheid van 8×105 cellen/ml op kamerglaasjes (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™-systeem; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) gedurende 24 uur en vervolgens behandeld met 50 en 100 μM acteoside gedurende 24 uur. Na kweek werd een celoverlevingsassay uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Daarna werden gekleurde cellen afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Dimethylmethyleenblauw (DMMB) Assay. DMMB-assay werd uitgevoerd om de wijziging van het proteoglycaangehalte te beoordelen in primaire rattenchondrocyten die gedurende 21 dagen met acteoside waren behandeld in aan- of afwezigheid van IL-1. Om de kenmerken van primaire rattenchondrocyten gedurende 21 dagen te behouden, werden primaire rattenchondrocyten (2 x 106 cellen) gesuspendeerd in 1 ml 1,2 procent alginaat en vervolgens ingekapseld door de cel/alginaatsuspensie te druppelen in een oplossing van 105 mM CaCl2. De primaire rattenchondrocyten ingekapseld in alginaat werden 24 uur gekweekt in DMEM/F12 (bevat 10 procent FBS, 50 E/ml penicilline, 50 ug/ml streptomycine en 50 ug/ml ascorbinezuur) en vervolgens aangepast gedurende 24 uur in DMEM/F12 met 1 procent mini-insuline-transferrine-selenium (mini-ITS) en 50 ug/ml ascorbinezuur. Vervolgens werden de chondrocyten gedurende 21 dagen behandeld met 50 of 100 M acteoside in aanwezigheid of afwezigheid van 1 ng/mL IL-1. Op dag 21 werden de primaire rattenchondrocyten verzameld voor beoordeling van het proteoglycaangehalte met behulp van de DMMB-assay, zoals eerder beschreven [12]. Om het proteoglycaangehalte per cel te kwantificeren en de proliferatie van primaire rattenchondrocyten te beoordelen, werden bovendien celaantallen gemeten door middel van een DNA-test met behulp van PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), volgens de instructies van de fabrikant.

2.5. Ex vivo orgelcultuur van gewrichtskraakbeenweefsels van ratten. Gewrichtskraakbeenweefsels werden geïsoleerd uit de kniegewrichten van 5-dag oude Sprague-Dawley-ratten en vervolgens gekweekt in DMEM/F12 aangevuld met 10 procent FBS. Vervolgens het gewrichtskraakbeen

monsters werden behandeld met 100 M acteoside in deaan- of afwezigheid van 10 ng/ml IL-1 gedurende 7 dagen. Aan het einde van de kweekperiode werden de monsters verzameld en gedurende 72 uur gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde voor histologische analyse.

2.6. Histologische analyse. Histologische analyse met behulp van safranine-O en snelle groene kleuring werd uitgevoerd om proteoglycaanverlies te verifiëren in het gewrichtskraakbeen behandeld met 100 μM acteoside in de aanwezigheid of afwezigheid van 10 ng/mL IL-1 gedurende 7 dagen. Korte, vaste gewrichtskraakbeenmonsters werden ontkalkt in ethyleendiaminetetra-azijnzuur en vervolgens ingebed in paraﬃn. Daarna werden de voorbereide paraﬃnblokken die gewrichtskraakbeen bevatten in serie gesneden tot een dikte van 5 m en op objectglaasjes geplaatst. Safranine-O en snelle groene kleuring werden vervolgens uitgevoerd om proteoglycaanverlies in de grondsubstantie van gewrichtskraakbeen te beoordelen. Bovendien werd kleuring met hematoxyline en eosine uitgevoerd om de algemene morfologie van het gewrichtskraakbeen te observeren.

2.7. Western-blotting. Western-blotting werd uitgevoerd om de expressie van katabole factoren te onderzoeken, waaronder MMP-13, MMP-1, MMP-3, induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS) en cyclo-oxygenase-2 (COX -2) en de wijziging van cellulaire signaalmoleculen zoals door mitogeen geactiveerde proteïnekinasen en nucleaire factor-kappa B (NFκB). Korte primaire chondrocyten van ratten werden gedurende 24 uur behandeld met 50 of 100 M acteoside in aan- of afwezigheid van 10 ng/ml IL-1. Daarna werden primaire chondrocyten van ratten geoogst door centrifugeren en gelyseerd met behulp van lysisbuffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Om de nucleaire translocatie van NFκB te verifiëren, werden bovendien primaire chondrocyten van ratten gedurende 24 uur behandeld met 50 of 100 μM acteoside in aanwezigheid of afwezigheid van 10 ng/ml IL-1. Daarna werden cytosolische en nucleaire fracties geëxtraheerd met behulp van NE-PER ™ nucleaire en cytoplasmatische extractiereagentia (Thermo Scientific, Rockford, IL, VS) volgens de instructies van de fabrikant. De concentratie van totaal eiwit geëxtraheerd uit primaire rattenchondrocyten werd bepaald met behulp van een bicinchoninezuur-eiwittestkit (Thermo Scientiﬁc, Rockford, IL, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Bovendien werd het geconditioneerde medium verzameld om de niveaus van kraakbeenafbrekende enzymen te detecteren die door chondrocyten werden uitgescheiden. Gelijke hoeveelheden eiwit en geconditioneerd medium werden geëlektroforeerd op natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en vervolgens overgebracht op nitrocellulosemembranen. Daarna werd western blotting uitgevoerd met behulp van gerichte primaire antilichamen tegen MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phosphoERK1/2, total-ERK1 /2, fosfop38, totaal-p38, fosfor JNK, totaal JNK, fosfoNFκB, totaal NFκB, - actine en lamin B. Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd met behulp van een verbeterd chemiluminescentiesysteem (Thermo Scientific, Rockford, IL, VS) volgens de instructies van de fabrikant en vervolgens afgebeeld door een Microchemi-apparaat (DNR Bioimaging Systems, Jeruzalem, Israël).

2.8. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en kwantitatieve realtime PCR (qRT-PCR). Primaire rattenchondrocyten werden gedurende 24 uur behandeld met 50 of 100 M acteoside in aanwezigheid of afwezigheid van 10 ng/ml IL-1. Daarna werd totaal RNA geïsoleerd uit de primaire rattenchondrocyten met behulp van TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. De totale RNA-concentratie werd gemeten met behulp van een NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, VS). Om cDNA te synthetiseren, werd 1 ug RNA omgekeerd getranscribeerd met behulp van een ThermoScript reverse transcriptie-PCR-systeem (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. qPCR van cDNA werd uitgevoerd met behulp van 2 x TOPsimple ™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Republiek Korea) en specifieke primers op een TaKaRa PCR Thermal Cycler Device (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan). Daarna werden de PCR-producten aan elektroforese onderworpen op een agarosegel om de expressieniveaus van doelwitgenen te bepalen. Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd gebruikt als endogene controle. Bovendien werd voor qRT-PCR cDNA geamplificeerd met behulp van een Eco ™ Real-Time PCR-systeem (illumine Inc., San Diego, CA, VS). Actine werd gebruikt als endogene controle. De sequenties van de primers die worden gebruikt in de qPCR en qRT-PCR zijn respectievelijk samengevat in tabellen 1 en 2.

cistanche (acteoside)voordeel: verbetering van de immuniteit

3. Resultaten

3.1. Acteoside heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van L929-cellen en primaire rattenchondrocyten. De muizenfibroblastcellijn L929 die als normale cellen werd gebruikt, werd gedurende 24 uur behandeld met 2,5, 5, 10, 25, 50 en 100 M acteoside. Daarna werd de MTT-test uitgevoerd om de cytotoxiciteit van acteoside op L929-cellen te beoordelen. Zoals weergegeven in figuur 2(a), werd vastgesteld dat de relatieve levensvatbaarheid van L929-cellen 94:8 ± 8 procent, 93:6 ± 7 procent, 100 ± 5 procent, 103:9 ± 5 procent, 126:1 ± 8 procent was en 122:7 ± 4 procent bij respectievelijk 2,5, 5, 10, 25, 50 en 100 μM acteoside, vergeleken met controle (100:02 ± 3 procent). Bovendien, om de cytotoxiciteit van acteoside op primaire rattenchondrocyten te verifiëren, werd de MTT-test uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 2(b). De levensvatbaarheid van primaire rattenchondrocyten behandeld met 2,5, 5, 10, 25, 50 en 100 μM acteoside werd bepaald als 114 ± 4 procent, 117:8 ± 6 procent, 123:9 ± 5 procent, 132:6 ± 4 procent, 153:1±7 procent en 142:1±6 procent, respectievelijk, vergeleken met controle (100:4±5 procent). Om het effect van acteoside op de levensvatbaarheid van zowel L929-cellen als primaire chondrocyten van ratten te bevestigen, werd bovendien een Cell Live/Dead-assay uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 2(c). Het aantal dode cellen gekleurd als rode fluorescentie nam niet toe voor zowel L929-cellen als primaire rattenchondrocyten die gedurende 24 uur werden behandeld met 50 en 100 μM acteoside. Deze gegevens toonden consequent aan dat de gedefinieerde dosering van acteoside geen invloed had op de levensvatbaarheid van L929-cellen en primaire rattenchondrocyten. Zo werden 50 M acteoside en 100 μM acteoside, die niet-toxische doses zijn in zowel L929-cellen als primaire rattenchondrocyten, gebruikt om de antikatabole effecten ervan in vitro te verifiëren met behulp van primaire rattenchondrocyten.

3.2. Acteoside gaat IL-1 -geïnduceerd proteoglycaanverlies in primaire rattenchondrocyten tegen. Primaire rattenchondrocyten ingebed in alginaatkorrels werden gedurende 21 dagen behandeld met 50 en 100 M acteoside in aanwezigheid of afwezigheid van 1 ng/ml IL- 1. Daarna werd een DMMB-assay uitgevoerd om de wijziging in het proteoglycaangehalte te beoordelen, zoals weergegeven in figuur 3 (a). Het relatieve proteoglycaangehalte werd bepaald op 88:3±18:1 procent en 86:8±16:3 procent in de primaire rattenchondrocyten die werden behandeld met respectievelijk 50 en 100μM acteoside, vergeleken met controle (103:8± 32:3 procent). Hoewel de relatieve proteoglycaangehalten werden verlaagd door acteoside, waren deze resultaten niet significant. Het relatieve proteoglycaangehalte nam echter significant af met 37:1 ± 14:7 procent in de primaire rattenchondrocyten die werden behandeld met 1 ng/ml IL-1 , maar 50 en 100 μM acteoside verminderde het proteoglycaangehalte significant met 57 ± 12:4 procent en respectievelijk 64 ± 14:5 procent in aanwezigheid van 1ng/ml IL-1. Vervolgens werd, om te verifiëren of acteoside het door IL-1 - geïnduceerde proteoglycaanverlies onderdrukt, gewrichtskraakbeen dat uit de kniegewrichten van ratten werd gesneden, gedurende 7 dagen behandeld met 100 M acteoside in aan- of afwezigheid van 10 ng/ml IL-1. Daarna werden histologische beoordelingen met H & E-kleuring en safranine-O en snelle groene kleuring uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 3 (b). De morfologische verandering werd niet waargenomen met H&E-kleuring; safranine-O en snelle groene kleuring onthulden echter dat het proteoglycaan dat kleurde als de rode kleur niet veranderde in het gewrichtskraakbeen behandeld met 100 μM acteoside in vergelijking met dat in de controle. Ernstig proteoglycaanverlies werd echter geïnduceerd door 10 ng/mlIL-1 in het gewrichtskraakbeen, en 100 μM acteoside onderdrukte significant het proteoglycaanverlies in het gewrichtskraakbeen behandeld met 10 ng/ml IL- 1 . Gezamenlijk laten deze gegevens consequent zien dat acteoside een antikatabool effect heeft dat de degeneratie van gewrichtskraakbeen vertraagt door IL-1 -geïnduceerd proteoglycaanverlies tegen te gaan.

3.3. Acteoside heeft een antikatabool effect dat MMP-expressie en -activering onderdrukt in primaire rattenchondrocyten die zijn behandeld met IL-1 . Om te onderzoeken of acteoside-geïnduceerd antikatabool effect geassocieerd is met de onderdrukking van MMP-expressie en -activering, werden primaire rattenchondrocyten behandeld met 50 en 100 μM acteoside in de aanwezigheid of afwezigheid van 10 ng/mL IL-1 gedurende 24 uur. Daarna werden de wijzigingen in MMP's onderzocht. Zoals getoond in figuur 4(a), hoewel de expressie van kraakbeenafbrekende enzymen zoals MMP-13, MMP-1 en MMP-3 significant was verhoogd in de geconditioneerde media van primaire ratten chondrocyten behandeld met 10 ng/ml IL-1 , werd het op een dosisafhankelijke manier verlaagd door acteoside. Bovendien onthulden de resultaten van zowel qPCR (Figuur 4(b)) als qRT-PCR (Figuur 4(c)) dat IL-1 de mRNA-niveaus van MMP's zoals MMP-13, MMP{ aanzienlijk verhoogde. {22}} en MMP-3 in de primaire rattenchondrocyten. Ze namen echter dosisafhankelijk af in de primaire rattenchondrocytenbehandeld met 50 en 100 M acteoside. Bovendien onderdrukte acteoside van 50 en 100 M effectief de activering van MMP's in de primaire chondrocyten van ratten die waren behandeld met 10 ng / ml IL -1 (Figuur 4 (d)). Alles bij elkaar genomen geven deze gegevens consequent aan dat acteoside een antikatabool effect heeft dat de expressie en activering van kraakbeenafbrekende enzymen onderdrukt.

3.4. Acteoside onderdrukt de expressie en productie van IL1 -geïnduceerde katabole ontstekingsmediatoren en pro-inflammatoire cytokines in primaire rattenchondrocyten. Om te bepalen of acteoside een preventief effect heeft tegen artrose, werden primaire rattenchondrocyten behandeld met 50 en 100 M acteoside in aan- of afwezigheid van 10 ng/ml IL-1 gedurende 24 uur. Daarna werden de veranderingen in ontstekingsmediatoren, representatieve katabole factoren zoals iNOS, COX-2 en PGE2 onderzocht. De mRNA-niveaus van iNOS, COX-2 en PTGS-2 waren significant verhoogd door IL-1 in de primaire rattenchondrocyten.

Ze namen echter dosisafhankelijk af in de primaire rattenchondrocyten die werden behandeld met acteoside (Figuur 5(a)). Bovendien onderdrukte acteoside niet alleen de expressie van iNOS en COX-2 in de primaire rattenchondrocyten die waren behandeld met IL-1 (Figuur 5(b)), maar verminderde het ook significant de relatieve productie van NO en PGE2 zoals weergegeven. in respectievelijk Figuren 5(c) en 5(d). Deze gegevens suggereren dat acteoside de expressie onderdrukt van door ontstekingsmediator geïnduceerde pro-inflammatoire cytokinen die fungeren als katabole factoren om de progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen te induceren. Om de expressieverandering van pro-inflammatoire cytokinen door 50 M acteoside in de primaire rattenchondrocyten die zijn behandeld met 10 ng/mL IL- 1 te onderzoeken, werd daarom een cytokine-array uitgevoerd zoals weergegeven in figuur 6. Acteoside onderdrukte de expressie van door cytokine geïnduceerde neutrofielen. chemoattractant- (CINC-) 2, CINC-3, ciliaire neurotrofe factor (CNTF), fractalkine (CX3CL1), IL-1 , IL- 1 , leptine, monocyt chemoattractant eiwit{{22} } (MCP-1), macrofaag ontstekingseiwit- (MIP-) 3 en -zenuwgroeifactor (NGF) in de primaire rattenchondrocyten behandeld met IL-1 vergeleken met alleen IL-1. Alles bij elkaar genomen suggereren deze gegevens consistent dat acteoside de progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen voorkomt door onderdrukking van ontstekingsmediatoren en proinflammatoire cytokinen tegen de door IL-1 -geïnduceerde katabole effecten in primaire rattenchondrocyten.

3.5. Acteoside onderdrukt MAPK- en NFκB-fosforylering in primaire rattenchondrocyten die zijn behandeld met IL-1. Om de cellulaire signaalroutes te onderzoeken die geassocieerd zijn met acteoside-geïnduceerde antikatabole effecten tegen pro-inflammatoire cytokine IL-1 wijziging van MAPK en NFκB, werden primaire rattenchondrocyten behandeld met 50 en 100μM acteoside in de aanwezigheid of afwezigheid van IL{{8 }} gedurende 24 uur. Daarna werd het totale eiwit geëxtraheerd en geëlektroforeerd op de SDS-PAGE-gel om de western-blot uit te voeren. Zoals getoond in figuur 7, werden MAPK zoals ERK1/2, p38 en JNK significant gefosforyleerd in de primaire rattenchondrocyten die waren behandeld met IL-1 , terwijl 50 en 100 μM acteoside de fosforylering van MAPK niet significant induceerde in vergelijking met de controle in primaire rattenchondrocyten. Echter, 50 en 100 μM acteoside onderdrukte dosisafhankelijk de IL-1 -geïnduceerde MAPK-fosforylering in primaire rattenchondrocyten. Bovendien werd de fosforylering van NFκB in de primaire rattenchondrocyten behandeld met 10ng/mL IL-1 geleidelijk verminderd door acteoside op een dosisafhankelijke manier. Deze gegevens geven aan dat de cellulaire signaalroutes van MAPK en NFκB nauw betrokken zijn bij de acteoside-geïnduceerde antikatabole effecten tegen IL-1 in primaire rattenchondrocyten.

3.6. Acteoside onderdrukt translocatie van NFκB van het cytosol naar de kern door onderdrukking van IL-1 -geïnduceerde NFκB-fosforylering in primaire rattenchondrocyten. Om te onderzoeken of acteoside de translocatie van NFκB van het cytosol naar de kern onderdrukt, werden primaire rattenchondrocyten behandeld met 50 en 100 ug/mL acteoside in de aanwezigheid of afwezigheid van 10 ng/mL IL-1 . Zoals getoond in figuur 8(a), werd NFKB significant getransloceerd naar de kern vanuit het cytosol van de primaire rattenchondrocyten die waren behandeld met 10 ng/ml IL-1. Het werd echter significant geremd door acteoside op een dosisafhankelijke manier. Bovendien, hoewel het NFκB-niveau was verhoogd in de nucleaire fractie die was geëxtraheerd uit de primaire rattenchondrocyten die waren behandeld met 10 ng/ml IL-1, werd het dosisafhankelijk verlaagd door acteoside, zoals weergegeven in figuur 8(b). Het NFKB-niveau was verlaagd in de cytosolische fractie die was geëxtraheerd uit de primaire rattenchondrocyten die waren behandeld met 10 ng/ml IL-1, maar het werd dosisafhankelijk verhoogd door acteoside. Samengevat geven deze gegevens consistent aan dat acteoside-geïnduceerde antikatabole effecten tegen IL-1 betrokken zijn bij de onderdrukking van translocatie van het cytosol naar de kern op de modulatie van de NFκB-signaleringsroute in primaire rattenchondrocyten.

3.7. Acteoside verzwakt progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen in de chirurgische DMM-geïnduceerde kniegewricht OA-dieren. Om de acteoside-geïnduceerde antikatabole effecten in vivo op te helderen, kregen OA-geïnduceerde dieren gegenereerd door de chirurgische DMM uitgevoerd op het kniegewricht van BALB/c-muizen oraal 5 en 10mg/kg acteoside opgelost in 5 procent ethanol. om de dag gedurende 8 weken. Daarna werden de kniegewrichten histologisch beoordeeld met behulp van safranine-O en snelle groene kleuring, zoals weergegeven in figuur 9. Het proteoglycaanverlies en de verwonding van het gewrichtskraakbeenoppervlak waren significant toegenomen in het kniegewricht dat was ontleed bij DMM-geïnduceerde OA-dieren. Echter, de orale toediening van acteoside onderdrukte het verlies van proteoglycaan en minder schade aan gewrichtskraakbeen vergeleken met alleen vehiculum. Bovendien was de beoordelingsscore van Mankin significant hoger in de groep OA-dieren (n =5, 3± 0:7) die alleen in het voertuig werd geleverd in vergelijking met Naïve (n =5, 0 :67 ± 0:5). Echter, de orale toediening van 5 en 10mg/kg acteoside in de OA-diergroep (n =5) verlaagde de Mankin-classificatiescore met 2±0:7 en 1:67 ± 0:5 , respectievelijk, in vergelijking met alleen het voertuig. Samengevat geven deze gegevens aan dat de orale toediening van acteoside de progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen in synoviale gewrichten met katabole aandoeningen afzwakt.