DEEL 1 Acteoside onderdrukt RANKL-gemedieerde osteoclastogenese door C-Fos-inductie en NF-KB-route te remmen en ROS-productie te verzwakken
Mar 07, 2022
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Zee Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3*
1 Research Institute of Clinical Medicine van Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, Zuid-Korea, 2 Department of Orthodontics, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South Korea, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Zuid-Korea
Abstract
Talrijke studies hebben gemeld dat inflammatoire cytokinen belangrijke mediatoren zijn voor osteoclastogenese, waardoor overmatige botresorptie en osteoporose worden veroorzaakt.Acteoside, de belangrijkste werkzame stof vanRehmannia glutinosa, dat veel wordt gebruikt in de traditionele oosterse geneeskunde, heeft ontstekingsremmende en antioxiderende eigenschappen. In deze studie vonden we datacteosideaanzienlijk remde osteoclastdifferentiatie en vorming van beenmergmacrofagen (BMM's) en RAW264.7-macrofagen gestimuleerd door de receptoractivator van nucleaire factor-kappaB (NF-kB) ligand (RANKL). Voorbehandeling met acteoside verhinderde ook op dosisafhankelijke wijze botresorptie door rijpe osteoclasten.Acteoside(10 mM) verzwakte door RANKL gestimuleerde activering van p38-kinase, extracellulaire signaal-gereguleerde kinasen en c-Jun N-terminaal kinase, en onderdrukte ook NF-kB-activering door remming van fosforylering van de p65-subeenheid en de remmer kBa. Bovendien, RANKL-gemedieerde verhogingen in de expressie van c-Fos en nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, cytoplasma 1 (NFATc1), en in de productie van tumornecrosefactor-a, interleukine (IL)-1b , en IL-6 werden blijkbaar geremd door voorbehandeling met acteoside. Verder, mondelingacteosideverminderde door ovariëctomie geïnduceerd botverlies en inflammatoire cytokineproductie om de niveaus onder controle te houden. Onze gegevens suggereren dat:acteosideremt osteoclastdifferentiatie en rijping van osteoclastische voorlopers door RANKL-geïnduceerde activering van door mitogeen geactiveerde proteïnekinasen en transcriptiefactoren zoals NF-kB, c-Fos en NFATc1 te onderdrukken. Gezamenlijk suggereren deze resultaten dat:acteosidekan werken als een anti-resorptief middel om botverlies te verminderen door osteoclastactivering te blokkeren.
Voor meer informatie kunt u contact opnemen met:emily.li@wecistanche.com
Invoering
Bot wordt voortdurend opnieuw gemodelleerd door uitgebalanceerde osteoclast- en osteoblastactiviteit [1]. Osteoclasten ontstaan uit hematopoëtische voorlopercellen van de monocyt/macrofaaglijn, terwijl osteoblasten van de mesenchymale lijn zijn [2]. Abnormalosteoclastactivering of verminderde osteoblastogenese kan de bothomeostase verstoren en uiteindelijk ziekten veroorzaken zoals osteoporose, artritis en botkanker [3,4]. Osteoporose is een veel voorkomende botziekte die leidt tot een verhoogd risico op fracturen. De meest voorkomende vorm van osteoporose wordt veroorzaakt door een tekort aan oestrogeen bij vrouwen in de menopauze. Medicijnen zoals corticosteroïden en anti-epileptica kunnen ook een disbalans tussen botresorptie en botvorming veroorzaken, wat kan leiden tot osteoporose [5]. Veel anti-resorptieve remmers, waaronder bisfosfonaten, calcitonine, oestrogeen en selectieve oestrogeenreceptormodulatoren, zijn gebruikt om osteoporose te behandelen. Deze remmers houden de botmassa in stand door de osteoclastfunctie te remmen [6]. Oestrogeensubstitutietherapie is de meest populaire behandeling om postmenopauzale osteoporose te voorkomen en te behandelen. Langdurige oestrogeensubstitutietherapie kan echter het risico op endometrium- en borstkanker verhogen. Daarom hebben veel onderzoekers hun inspanningen gericht op het ontwikkelen van een nieuw anti-resorptiemiddel dat geen bijwerkingen heeft [7-10]. Omdat osteoclasten een functie hebben bij botresorptie, werd in talrijke onderzoeken specifiek het remmen van osteoclasten als het belangrijkste doelwit beschouwd. Osteoclasten zijn meerkernige reuzencellen gevormd door mononucleaire voorlopers van de monocyten/macrofaagfamilie via de opeenvolgende proliferatie, differentiatie en fusie van hematopoëtische voorlopercellen [11]. Macrofaag koloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) zijn essentiële factoren voor osteoclastdifferentiatie [12]. Bovendien dragen verschillende inflammatoire cytokinen, zoals tumornecrosefactor (TNF) en interleukine (IL)-1b, bij aan osteoclastogenese door de inductie van RANKL, osteoprotegerine en M-CSF te moduleren [7,13]. RANKL-binding aan de RANK-receptor op het celoppervlak resulteert in RANKL/RANK/TNFR
geassocieerde factoren (TRAF) -complexen die sequentieel NFkB en mitogeen-geactiveerde proteïnekinasen (MAPK's) activeren, waaronder cJun N-terminaal kinase (JNK), p38-kinase en extracellulair signaal-gerelateerd kinase (ERK) [14]. Deze activering speelt een sleutelrol bij het mediëren van osteoclastdifferentiatie, -activering en overleving. RANKL activeert ook de expressie van transcriptiefactoren zoals nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, cytoplasma 1 (NFATc1) en -Fos, die essentieel zijn voor de ontwikkeling van osteoclasten [ 7,9]. Daarom wordt RANKL-signalering beschouwd als het belangrijkste doelwit van anti-resorptiemiddelen die osteoclastactivering onderdrukken en zonder bot zijn.Acteosideis de belangrijkste werkzame stof van Rehmannia glutinosa, die veel wordt gebruikt in de traditionele oosterse geneeskunde [15,16].Acteosideis een sterke antioxidant en heeft anti-hepatotoxische, ontstekingsremmende en anti-nociceptieve activiteiten [17-20]. Dat vonden we eerderacteosidevermindert tyrosinase-activiteit en melaninebiosynthese door ERK-signalering [21] te reguleren, beschermt tegen door reactieve zuurstofspecies (ROS) gemedieerde gingivale schade [22] en onderdrukt door mycotoxine gemedieerde celbeschadiging [23]. Deze effecten hangen nauw samen met:acteoside's vermogen om ROS te verwijderen en MAPK-gemedieerde signalering te reguleren. In het bijzonder wordt gesuggereerd dat ROS door RANKL geïnduceerde signaalroutes en cellulaire gebeurtenissen in osteoclasten bemiddelt. Voorbehandeling met antioxidanten remde door RANKL geïnduceerde activering van NF-kB, ERK en IkBa, waardoor osteoclastogenese werd onderdrukt [24]. Deze bevindingen suggereerden sterk dat, naast ontstekingsremmende activiteit, en antioxiderende activiteit cruciaal is voor een anti-resorptiemiddel, dusacteosidekan RANKL-geïnduceerde osteoclastogenese onderdrukken. In de huidige studie hebben we onderzocht ofacteosideheeft een therapeutisch effect op botverlies. We onderzochten de effecten vanacteosideover osteoclastdifferentiatie en botresorptie en de gerelateerde cellulaire mechanismen met behulp van in vitro en in vivo experimentele systemen.
Materialen en methodes
ethische uitspraak
Dierverzorging en gebruikspraktijken zijn goedgekeurd door de Chonbuk National University Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (vergunning nr. CBU 2010-0007). Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Care and Use Committee van de universiteit.
Muizen, chemicaliën en laboratoriumartikelen
Vier weken oude vrouwelijke ICR-muizen werden gekocht bij OrientBio Inc. (Seoul, Korea) en gehuisvest bij 2261 ° C en 5565 procent vochtigheid op een 12 uur licht/donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water. Acteoside (3,4-dihydroxy-b-fenethyl-Oa-rhamnopyranose syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (Fig. S1) werd geïsoleerd uit de bladeren van Rehmannia glutinosa. Acteoside werd vóór gebruik opgelost in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 en M-CSF werden gekocht bij R & D-systemen (Minneapolis, MN, VS). Antilichamen specifiek voor c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa en b-actine werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, VS ). Antilichamen voor p-p38 en p38 werden gekocht bij Cell Signaling Technology (Danvers, MA, VS). CalciumAssay en Osteocalcin (OC) EIA-kits werden gekocht bij respectievelijk BioAssay Systems (Hayward, CA, VS) en Biomedical Technologies (Stoughton, MA, VS), om de biochemische serumparameters te bepalen. Muistartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) Assay-kit (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, VS) werd ook gebruikt om het serum TRAP5b-niveau te meten. Tenzij anders aangegeven, werden aanvullende chemicaliën verkregen van Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, VS) en laboratoriumwaren waren van SPL Life Sciences (Pochun, Zuid-Korea).
celculturen
Beenmergcellen werden verkregen uit de tibiae en femora van 6 weken oude vrouwelijke ICR-muizen volgens eerder beschreven methoden [25]. De beenmergsuspensie werd geïncubeerd in een kweekschaal van een 100- mm in aanwezigheid van 50 ng/ml M-CSF. Na 3 dagen werden hechtende cellen gebruikt als beenmergmacrofagen (BMM's) om osteoclastische differentiatie te induceren. Sommige beenmergcellen werden ook 48 uur zonder M-CSF geïncubeerd en hechtende cellen werden gekweekt in een osteoblast-differentiërend medium, zoals elders beschreven [25]. RAW264.7 macrofaagcellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum (FBS), 2 mM L glutamine en antibiotica. Deze cellen werden gebruikt als tegenhanger cellijn voor BMM's om het effect van acteoside op osteoclastogenese te onderzoeken.
Osteoclastische differentiatie en TRAP-kleuring
BMM's werden gedurende 2 uur voorbehandeld met verschillende concentraties (0-50 mM) acteoside voordat ze werden gestimuleerd met 100 ng / ml RANKL. Kweekmedia werden op dag 2 en 5 vervangen door verse media. Na 7 dagen incubatie werden de kweken gefixeerd in 4% PBS-gebufferd paraformaldehyde en gekleurd met TRAP met behulp van een sigma Aldrich-kit volgens de instructies van de fabrikant. TRAP-positieve cellen werden geteld met behulp van optische microscopie en cellen met 3 of meer kernen werden als osteoclasten beschouwd. RAW 264,7-cellen werden ook blootgesteld aan 100 ng/ml RANKL na voorbehandeling met acteoside gedurende 2 uur en na 7 dagen incubatie, de cellen werden verwerkt voor TRAP-kleuring.
Meting van de levensvatbaarheid van cellen
De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van een in water oplosbaar tetrazoliumzout (WST)-8-reagens. In het kort werden BMM's of RAW264.7-cellen gekweekt in een groeimedium met 10 procent FBS en antibiotica behandeld met 10 mM acteoside of fenolische verbindingen zoals quercetine, luteoline, apigenine of epigallocatechin-3-gallaat (EGCG). WST-8 reagens werd na 48 uur incubatie aan de kweken toegevoegd. Na nog eens 4 uur incuberen werd de WST -8-specifieke absorptie gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, VS).
Botresorptietest
BMM's (16105 cellen/ml) werden gesuspendeerd in a-MEM met 50 ng/ml M-CSF en 100 ng/ml RANKL, vervolgens verdeeld over een a24-well-plaat bekleed met calciumfosfaat-nanokristallen (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Zuid-Korea) met een dichtheid van 26104 cellen/cm2 met en zonder acteoside. Na 7 dagen incuberen werden de cellen van de platen verwijderd met 5% natriumhypochloriet, en putvorming werd waargenomen onder een optische microscoop. Het geresorbeerde oppervlak werd ook gemeten met een beeldanalysator en uitgedrukt als een percentage van de controlewaarde.
Western Blot-analyse
Hele eiwitlysaten werden bereid in een lysisbuffer zoals elders beschreven [26]. Cytosolische en nucleaire eiwitten werden bereid zoals eerder beschreven [25]. Gelijke hoeveelheden eiwitextract werden gescheiden door 12-15 procent SDS-PAGE en geblot op polyvinyldifluoridemembranen. De blots werden een nacht bij 4 °C met primaire antilichamen onderzocht voordat ze gedurende 1 uur met secundair antilichaam in blokkeerbuffer werden geïncubeerd. De blots werden ontwikkeld met verbeterde chemiluminescentie (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, VK) en blootgesteld aan röntgenfilm (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, VS).
MAPK-activiteitsassay
Cellen werden 2 uur voorbehandeld met acteoside en daarna nog eens -30 min gestimuleerd met RANKL. MAPK-activiteiten werden bepaald met behulp van immunometrische assaykits, zoals de p-p38kinase-assaykit (Assay Designs, Inc., MI, VS), p-ERK-enzymassaykit (Assay Designs) en p-SAPK/JNK sandwich ELISA-kit ( Celsignaleringstechnologie, MA, VS). Alle procedures volgden de instructies van de fabrikant en de absorptie werd gemeten met een microplaatlezer.
Elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA)
DNA-eiwitbindingsreacties werden uitgevoerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, met 10-15 mg eiwit in 20 ml buffer met 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 procent glycerol ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM van [a-32P] dCTP-gelabelde oligonucleotiden en het Klenow-fragment van DNA-polymerase. De monsters werden gescheiden op 6% polyacrylamidegels, die werden gedroogd en blootgesteld aan röntgenfilm (Eastman Kodak Co.) gedurende 12-24 uur bij 270 ° C. De oligonucleotide-primersequenties die specifiek zijn voor NF- waren 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 en 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.
NF-KB Luciferase-assay
RAW264.7-macrofagen in 24-putjesplaten werden getransfecteerd met 0,8 mg kB-luciferase-reportervector met behulp van 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. 24 uur na transfectie werden de cellen gestimuleerd met RANKL in aanwezigheid en afwezigheid vanacteosidevoor 24 u. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 100 ml reporterlysisbuffer (Promega, Madison, WI, VS). Gelijke hoeveelheden eiwitmonsters werden in 96-well microplaten geplaatst en gemengd met luciferasesubstraat. Luminescentie werd gemeten met behulp van een microplaatluminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Duitsland). In dit experiment werd een permeabel NF-B-remmerpeptide (BIOMOL, Butler Pike, PA, VS) gebruikt als een positieve kB-remmer.
Meting van cytokines
BMM's of RAW264.7-cellen werden gestimuleerd met RANKL in aanwezigheid van acteoside in 24-wellcultuurplaten. Na 48 uur incubatie werden kweeksupernatanten verzameld en beoordeeld met ELISA met behulp van TNF-a-, IL-1b- en IL-6-specifieke OptEIATM-kits volgens de instructies van de fabrikant.
Realtime omgekeerde transcriptie-polymerase kettingreactie (RT-PCR)
De mRNA-expressie van osteoclastische markers, zoals c-Fos, NFATc1 en TNF-a, werd bepaald door real-time RT-PCR. In het kort werd totaal RNA uit macrofagen geëxtraheerd met Trizolreagens volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen). cDNA werd gesynthetiseerd met 1 mg totaal RNA met behulp van SuperScriptReverse Transcriptase II en primers (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS) werd gebruikt om de accumulatie van PCR-product tijdens het fietsen te detecteren met het ABI 7500-sequentiedetectiesysteem (AppliedBiosystems). Na denaturatie bij 95 °C gedurende 10 min was PCR
Meting van intracellulaire ROS
Een voorraadoplossing van 29,79-dichloordihydrofluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Duitsland) werd bereid in DMSO en in het donker bij 220 °C bewaard. In het kort, BMM's (106 cellen/ml in 6-putjesplaten) werden 24 uur gekweekt met 50 ng/MLM-CSF en vervolgens behandeld met verschillende concentraties (0-10 mM) acteoside 2 uur vóór stimulatie met 100 ng/mlRANKL. Na 1 uur co-incubatie werden deze cellen vervolgens 30 minuten geïncubeerd met 25 mM DCFH-DA. De groene fluorescentie van 29,79-dichloorfluoresceïne (DCF) werd geregistreerd bij 515 nm (FL 1) met behulp van een FACS VantageH-systeem (Becton-Dickinson, San Jose, CA, VS), en 10,000 gebeurtenissen werden per monster geteld.
Inductie van door ovariëctomie geïnduceerde osteoporose
Voor dit onderzoek werden vrouwelijke ICR-muizen (6 weken oud) gebruikt. Muizen kregen een schijnoperatie (Sham, n=10) of chirurgische ovariëctomie (OVX, n=20) onder verdoving. Een week na de operatie werden de OVX-muizen willekeurig verdeeld in 2 groepen van elk 10 muizen: bilaterale OVX en bilaterale OVX aangevuld met 200 ml PBS met 1 mM acteoside oraal (AC-groep). mondelingacteosidewerd eenmaal per 3 dagen toegediend gedurende 8 weken na de operatie, en dezelfde hoeveelheid PBS werd toegediend aan de Sham- en OVX-groepen. Na 1 dag van de laatste toediening werden muizen opgeofferd en vervolgens werden biochemische parameters in serum en 3-dimensionale botstructuur geanalyseerd.
Bepaling van serum biochemische parameters
Bloedmonsters werden verzameld via hartpunctie en serum werd verzameld door centrifugeren. Serummonsters werden bij 280 °C bewaard voor analyse van biochemische parameters. De serumspiegels van IL-1b en IL-6 werden geschat met behulp van de ELISA-kit zoals hierboven beschreven, terwijl de activiteit van alkalische fosfatase (ALP) werd bepaald met behulp van een biochemische colorimetrische test die de hoeveelheid p -nitrofenol geproduceerd uit een p-nitrofenolfosfaatsubstraat, zoals elders beschreven [27]. Om de biomarkers van botvorming en -resorptie te schatten, werden ook de serum-OC-, calcium- en TRAP5b-spiegels bepaald volgens de instructies van de fabrikant.
Analyses van botstructuur en morfometrische parameters
De dijbenen van muizen (Sham-, OVX- en AC-groepen) werden ontleed en gevuld met fysiologische zoutoplossing voor mechanisch testen. De mechanische sterkte van het dijbeen werd gemeten zoals elders beschreven [28]. De breukbelasting werd geregistreerd als de piekkracht in newton op het punt dat de middenschacht van het rechter dijbeen brak. Bovendien werd het lichte dijbeen van elk dier histomorfometrisch geanalyseerd met behulp van een microcomputertomografie (micro-CT) systeem (SkyScan 1076 microfocus röntgensysteem, Kontich, België). In het kort, de botten in 4 procent formaldehyde-opslag werden oppervlakkig gedroogd op papieren tissues voordat ze werden gewikkeld in plastic '' vershoudfolie '' of in parafilm, om uitdroging tijdens het scannen te voorkomen. Elk met plastic omhuld bot werd in plastic/polystyreenschuimbuizen geplaatst die verticaal horizontaal in de 1076-scannermonsterkamer waren gemonteerd voor micro-CT-beeldvorming. Het scannen werd uitgevoerd met een bronspanning van 100 kV en een bronstroom van 140 mA met een resolutie van 35 mm. Driedimensionale modellen van de trabeculaire botten van het dijbeen werden gereconstrueerd met behulp van SkyScan CT Analyzer versie 1.11. De structurele parameters zoals trabeculaire botmineraaldichtheid (BMD, g/cm3), procent botvolume (botvolume (BV)/weefselvolume (TV), procent), dikte (Tb.Th, mm), scheiding (Tb.Sp , mm) en aantal (Tb.N, 1/mm) werden vervolgens gemeten.
Osteogene differentiatie- en mineralisatietest
Beenmergcellen gekweekt in {{{{10}}}}well kweekplaten werden behandeld met DAG (10 nM dexamethason, 50 mM ascorbinezuur en 20 mM b-glycerofosfaat) in aanwezigheid van 10 mM acteoside. Na 2 weken differentiatie werden de cellen gedurende 1 uur gefixeerd met ijskoude 70% (vol/vol) ethanol en gekleurd met 0,2% alizarinerood Sin gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de cellen waren ontkleurd en aan de lucht waren gedroogd, werden de celkweekplaten geëvalueerd met lichtmicroscopie met behulp van een omgekeerde microscoop (Nikon TS100, Japan). Om de hoeveelheid rode kleurstof te kwantificeren, werd de vlek geëlueerd met 10% acetylpyridiniumchloride door 20 minuten te schudden en de absorptie werd gemeten bij 560 nm. De hoeveelheid calcium die in de cellagen werd afgezet, werd ook gemeten met behulp van een Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Bovendien werd de expressie van botspecifieke mRNA-markers, zoals runt-gerelateerde transcriptiefactor-2(Runx2), osterix, bot-sialoproteïne (BSP) en OC bepaald door real-time RT-PCR. Oligonucleotide-primers van deze markers werden ontworpen met productgroottes van minder dan 200 bp met behulp van PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) zoals elders beschreven [27].
Statistische analyse
Tenzij anders aangegeven, worden alle gegevens uitgedrukt als de gemiddelde6 standaarddeviatie (SD) van 3 of meer onafhankelijke experimenten. Er werd een one-way ANOVA gebruikt voor meerdere vergelijkingen met behulp van SPSS versie 12.0 software. Een p-waarde van 0.05 werd als statistisch significant beschouwd.
Resultaten
Acteoside remt de vorming van osteoclasten door macrofagen op een dosisafhankelijke manier
Om het effect van acteoside op BMM-differentiatie tot osteoclasten te verifiëren, werden de cellen gedurende 7 dagen gekweekt met verschillende concentraties (0-20 mM) acteoside in aanwezigheid van 50 ng/ml M CSF en 100 ng/ml RANKL . Acteoside verminderde het aantal osteoclasten op een dosisafhankelijke manier. Toen de cellen gedurende 2 uur werden voorbehandeld met 10 mM acteoside, nam het aantal osteoclasten af met 43 procent in vergelijking met cellen die waren aangevuld met M-CSF en RANKL (Fig. 1A). Fig. 1B toont de RANKL-gemedieerde osteoclastdifferentiatie en de remming ervan door gecombineerde behandeling met acteoside. In overeenstemming met dit resultaat verminderde de voorbehandeling met acteoside de RANKL-gestimuleerde differentiatie van RAW264.7-cellen en osteoclastvorming (figuren 1C en D). Toen het anti-osteoclastische potentieel van acteoside op BMM's werd vergeleken met het anti-osteoclastpotentieel van verschillende fenolische verbindingen bij dezelfde concentratie (10 mM), vertoonde luteoline de hoogste activiteit (Fig. 2A). Echter, luteoline, quercetine of apigenine zelf verminderden de levensvatbaarheid van de cellen (Fig. 2B). Alle verbindingen remden osteoclastische differentiatie door RAW264.7-macrofagen met de volgende relatieve activiteiten: luteoline. quercetine=apigenine.EGCG=acteoside (Fig. 2C). Luteoline, quercetine of apigenine zelf toonden ook de verminderde levensvatbaarheid van de cellen (Fig. 2D). Daarentegen veroorzaakte behandeling met quercetine alleen een significante vermindering van de levensvatbaarheid in zowel BMM's als RAW264.7-cellen, wanneer deze cellen gedurende 2 dagen werden blootgesteld aan 10 mM van elke verbinding met 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, of beide (gegevens niet getoond). Wanneer de concentratie van deze verbindingen nodig is om 50 procent van
osteoclastvorming in BMM's (IC50) werd berekend met behulp van concentratie-activiteitscurven, de IC50 van acteoside, quercetine, luteoline, apigenine en EGCG was respectievelijk 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 en 6,6 mM (Fig. 2E). Dit resultaat was vergelijkbaar met het geval dat RAW264.7-macrofagen werden onderzocht. Deze gegevens suggereerden dat luteoline en quercetine een hogere anti-clastogene werking hadden dan acteoside. Daarentegen had quercetine op de IC50 ook een licht toxisch effect op de cellen (gegevens niet getoond).
ActeosideRemt botresorptie door macrofagen Acteoside voorkwam ook RANKL-gemedieerde botresorptie op een dosisafhankelijke manier, zoals gemeten door een in vitro modelsysteem (Fig. 3A). Botresorptie werd significant geremd wanneer BMM's werden geïncubeerd met 1 mM acteoside (figuur 3B). Een 10 mM acteoside-behandeling verzwakte door RANKL geïnduceerde putvorming door BMM's bijna volledig. Evenzo verminderde acteoside de botresorptie in RANKL-gestimuleerde RAW264.7-cellen (figuren S2A en B). het vermogen vanacteosideom botresorptie te remmen, was afhankelijk van de timing van de behandeling ten opzichte van RANKL-stimulatie. Acteoside (10 mM) toegevoegd 4 dagen na RANKL-stimulatie verminderde de putvorming in BMM's niet, terwijl het het aantal gevormde osteoclasten onderdrukte (Fig. 3C). Dit andere resultaat was gedeeltelijk te wijten aan het pitgebied dat al was gevormd na 4 dagen RANKL-stimulatievorming (Fig. 3D).
ActeosideDown-reguleert vroege RANKL-signaleringpaden
RANKL induceert de activering van 3 bekende MAPK's en NF-kB in osteoclastprecursoren, en deze activering is vereist voor vroege osteoclastdifferentiatie. Om de mogelijke mechanismen te begrijpen waarmee acteoside osteoclastogenese remt, hebben we het effect van acteoside op MAPK's en NF-B-activering in macrofagen onderzocht. BMM's en RAW264.7-cellen werden gedurende 2 uur voorbehandeld met 10 mM acteoside en vervolgens gedurende 30 minuten gestimuleerd met 100 ng / ml RANKL. MAPK-fosforylering werd onderzocht door Western-blotting en immunometrische analyse. RANKL induceerde fosforylering van p38-, ERK- en JNK-inBMM's (Fig. 4A) en RAW264.7-cellen (Fig. 4B). Acteoside verhinderde deze door RANKL geïnduceerde verhogingen van p-p38, p-ERK en p-JNK. Dit resultaat werd ondersteund door immunometrische analyse, waarbij die voorbehandeling met 10 mM acteoside de niveaus van gefosforyleerde MAPK's in deze macrofagen significant remde (Fig. 4C). RANKL-behandeling verhoogde de DNA-binding van NF-kB, terwijl acteoside door RANKL geïnduceerde activering van NF-kB-DNA-binding remde (Fig. 5A). Deze remming was prominenter aanwezig in BMM's dan in RAW264.7-cellen. Acteoside verminderde ook door RANKL gestimuleerde p65- en IkBa-fosforylering in BMM's en RAW264.7-cellen (figuren 5B en C). Het toevoegen van 10 mMacteoside remde bijna volledig zowel de afbraak als de activering van IkBa in BMM's (figuur 5B). Om verder te bevestigen dat NF kB-activering betrokken is bij de werking van acteoside, werden kB-promoter-luciferaseconstructen tijdelijk getransfecteerd in RAW264.7-cellen. De cellen die waren geïncubeerd met 100 ng/ml RANKL hadden een 3-voudig hogere kB-promoteractiviteit, die significant werd verzwakt door 10 mM acteoside (Fig. 5D).
Acteoside onderdrukt de productie van inflammatoire cytokines en de expressie van TNF-a, c-Fos en NFATc1in RANKL-gestimuleerde macrofagen
TNF-a, IL-1b en IL-6 zijn belangrijk bij de vorming en functie van osteoclasten, die wordt gemedieerd door NF-kB-signalering in RANKL-gestimuleerde macrofagen. RANKL stimuleerde de productie van deze cytokinen, en deze productie werd aanzienlijk verminderd door 10 mM acteoside-voorbehandeling in BMM's (Fig. 6A). Evenzo verzwakte acteoside de door RANKL geïnduceerde productie van cytokinen, behalve IL -6, in RAW264.7-macrofagen (Fig. S3). Om de moleculaire mechanismen van acteoside-actie bij osteoclastogenese te begrijpen, hebben we het effect van acteoside op TNF-a-, c-Fos- en NFATc1-expressie verder onderzocht. RANKL reguleerde de mRNA-expressie van deze factoren in BMM's en RAW264.7-cellen (Fig. 6B en C). Voorbehandeling met 10 mM acteoside remde significant de RANKL-geïnduceerde expressie van deze factoren in beide
BMM's en RAW264.7-cellen. Acteoside-voorbehandeling verminderde ook sterk de eiwitniveaus van c-Fos en NFATc1 in RANKL-gestimuleerde BMM's (Fig. 6D). Deze resultaten suggereren datacteosidedown-reguleert RANKL-inducerende mediatoren van osteoclastvorming op gen- en eiwitniveau.
Acteoside vermindert de intracellulaire ROS-generatie in BMM's op een dosisafhankelijke manier
Omdat het bekend is dat intracellulaire ROS-productie gecorreleerd is met RANKL-gestimuleerde osteoclastogenese, hebben we onderzocht of acteoside de ROS-productie remt tijdens RANKL-gemedieerde osteoclastdifferentiatie met behulp van een celpermeabele, oxidatiegevoelige kleurstof, DCFH-DA. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat het gemiddelde fluorescentiesignaal dat specifiek is voor DCF in BMM's blijkbaar naar rechts verschoven was na stimulatie met RANKL, vergeleken met de onbehandelde controlecellen (Fig. 7A). Deze verschuiving was vergelijkbaar met het geval dat RAW264.7-macrofagen werden waargenomen na RANKL-stimulatie (gegevens niet getoond). Het behandelen van BMM's met acteoside verminderde de signaalintensiteit van de DCF op een dosisafhankelijke manier. Voorbehandeling met 10 mM acteoside verminderde bijna volledig de niveaus van intracellulair ROS geproduceerd tijdens osteoclastdifferentiatie tot de onbehandelde controleniveaus (Fig. 7B).
Orale toediening van acteoside remt verandering van osteoporotische biochemische markers en botverlies bij muizen die ovariëctomie hebben ondergaan
Om het effect van acteoside op botverlies te onderzoeken, hebben we een osteoporotisch diermodel gemaakt door middel van ovariëctomie. Er was geen significant verschil in lichaamsgewicht tussen OVX en Shammice tijdens de experimentele periode (gegevens niet getoond). De groep had significant hogere serumspiegels van IL-1b en IL-6 dan de Sham-groep (Fig. 8). Door ovariëctomie geïnduceerde verhogingen van deze inflammatoire cytokines werden afgezwakt door orale toediening van acteoside (AC-groep). De serumspiegels van markers voor botombouw zoals ALP, calcium, TRAP5b en OC waren significant verhoogd in de OVX-groep. Van deze osteoporotische markers werden de verhoogde niveaus van calcium, TRAP5b en OC in OVX-muizen blijkbaar geremd door behandeling met acteoside, terwijl de serumspiegel van ALP niet werd veranderd door de behandeling. De gemiddelde maximale breukbelasting naar het midden van de rechter femurschacht was significant lager in de OVX-groep dan in de Sham-groep (Fig. 9A). Behandeling met Acteoside verhoogde de maximale fractuurback-up tot die van de Sham-groep. Toen het corticale bot van het dijbeen werd ontleed en waargenomen door optische microscopie, waren de osteoporotische kenmerken getoond in de OVX-groep bijna volledig verdwenen in AC-muizen (Fig. 9B). Om het effect van acteoside op het OVX-geïnduceerde osteoporosemodel te verifiëren, werden BMD en botmorfologische parameters in het trabeculaire van het lichte proximale femur geanalyseerd met micro-CT. Zoals getoond in Fig. 9C, werd een wijziging van de femorale trabeculaire architectuur gevonden in OVX-muizen, terwijl deze verandering werd verminderd door behandeling met acteoside. De resultaten van de micro-CT-analyse onthulden dat BMD, een maat voor botsterkte, dramatisch was verminderd in OVXmice (Fig. 9D). Vergeleken met de Sham-groep vertoonden OVX-muizen ook significante veranderingen in BV/TV, Tb. Sp, en Tb. N, maar niet Tb.Th. Orale acteosidebehandeling van OVX-muizen verhinderde significant de verandering in BMD evenals BV/TV en Tb.N.
