Deel 1: Bioactieve verbindingen van Ephedra Fragilis: extractie-optimalisatie, chemische karakterisering, antioxidant- en anti-glycatie-activiteiten

Voor meer informatie. contacttina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Response Surface-methodologie (RSM) met een Box-Behnken-ontwerp (BBD) werd gebruikt om de extractie van bioactieve stoffen uit Ephedra fragilis te optimaliseren. De resultaten suggereerden dat extractie met 61,93 procent ethanol bij 44,43 graden gedurende 15,84 uur de beste oplossing was voor deze combinatie van variabelen. Het onder optimale extractieomstandigheden verkregen ruwe ethanolextract (CEE) werd achtereenvolgens gefractioneerd met oplosmiddelen van toenemende polariteit. Het gehalte aan totaal fenol (TP) en totaal flavonoïde (TF), evenals deantioxidanten antiglycatie-activiteiten werden gemeten. Het fytochemische vingerafdrukprofiel van de fractie met de hoogste activiteit werd gekarakteriseerd door gebruik te maken van RP-HPLC. De ethylacetaatfractie (EAF) had de hoogste TP- en TF-gehaltes en vertoonde de krachtigste antioxidant- en antiglycatie-activiteiten. De Pearson-correlatieanalyseresultaten toonden aan dat TP- en TF-gehaltes zeer significant gecorreleerd waren met de antioxidant- en antiglycatie-activiteiten. In totaal werden zes verbindingen geïdentificeerd in de EAF van E. fragilis, waaronder vier fenolzuren en twee flavonoïden. Bovendien toonde moleculaire docking-analyse ook het mogelijke verband tussen geïdentificeerde bioactieve verbindingen en hun werkingsmechanismen. Onze resultaten suggereren nieuw bewijs over de antioxiderende en antiglycatie-activiteiten van E. fragilis bioactieve verbindingen die kunnen worden toegepast bij de behandeling en preventie van veroudering en glycatie-geassocieerde complicaties.

Trefwoorden: Ephedra fragilis; respons oppervlak methodologie; Box-Behnken ontwerp; bioactieve verbindingen; RP-HPLC; antioxiderende en antiglycatie-activiteiten

Klik hier om meer producten te leren

1. Inleiding

De continue blootstelling aan agressors uit verschillende bronnen kan leiden tot een stijging van devrije radicalenproductie in het menselijk lichaam, zijn vermogen om ze te reguleren overschrijdt, en draagt ​​na verloop van tijd bij aan de ontwikkeling van verschillende ziekten die verband houden met oxidatieve stress, waaronder veroudering en diabetes [1]. Vandaar,antioxidantensuppletie kan helpen om een ​​optimaal biologisch systeem te behouden door te hoge concentraties vrije radicalen te verwijderen [2]. Het is aangetoond dat vrije radicalen deelnemen aan het glycatieproces. Glycatie, een spontane niet-enzymatische reactie tussen beschikbare aminogroepen van aminozuurresiduen in eiwitten en reducerende suikers, komt in hogere mate voor bij veroudering en hyperglykemie, wat resulteert in de productie en accumulatie van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's). Afgezien van het interfereren met eiwitten en het veranderen van hun functionaliteit, kunnen AGE's ook:

zich bezighouden met de receptor voor AGE's (RAGE), een multi-ligand-celoppervlaktereceptor van 45 kDa die behoort tot de immunoglobuline-superfamilie [4], en verschillende stroomafwaartse intracellulaire signaalroutes activeren die gepaard gaan met een toename van de productie van vrije radicalen die bijdragen aan pathologische complicaties die verband houden met tot suikerziekte [5].

Het is algemeen bekend dat antioxidanten en radicale scavenger-moleculen goede beschermers zijn tegen deze processen [6]. Het gebruik van geneeskrachtige planten bij het voorkomen en tegengaan van ziekten die verband houden met oxidatieve stress is een oude medische traditie. Onlangs hebben veel onderzoeken aangetoond dat secundaire metabolieten zoals tannines, fenolzuren en flavonoïden met dubbel antioxidant- en antiglycatiepotentieel effectiever zijn bij de behandeling van diabetes mellitus [7]. Daarom is het van groot belang om nieuwe bronnen van fytochemicaliën te identificeren die effectief vrije radicalen wegvangen en niet-enzymatische glycatie verminderen.

Ephedra fragilis is een lid van het geslacht Ephedra (Ephedracea-familie) dat meer dan 60 soorten bevat die groeien in woestijn- en semi-aride omstandigheden op beide halfronden over zes continenten [8]. Al meer dan 5000 jaar worden veel soorten van het geslacht Ephedra algemeen gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) voor de behandeling van verschillende ziekten; er zijn verschillende onderzoeken geweest die hun meerdere gezondheidsvoordelen rapporteren, zoals ontstekingsremmend [9, anti-invasief, anti-angiogeen, [10], antimicrobieel, antiproliferatief, pro-apoptotisch [11], neuroprotectief [12], hepatoprotectief en anti -oxiderende eigenschappen [13]. Flavonoïden, alkaloïden, fenolzuren en andere verbindingen in Ephedra-planten worden beschouwd als de belangrijkste fytochemische componenten voor deze farmacologische eigenschappen [14]. In de farmaceutische industrie wordt reverse-phase high-performance vloeistofchromatografie (RP-HPLC) veel gebruikt als analytische methode om chemische verbindingen te detecteren en te identificeren op basis van hun verschillende hydrofobe eigenschappen, hoewel er in de literatuur weinig studies zijn beschreven voor chemische analyse van Ephedra soorten.

Het extractieproces van deze bioactieve stoffen uit verschillende plantenbronnen is de eerste belangrijke stap in hun kwalitatieve en kwantitatieve analyse [15]. Verschillende factoren nl. extractiemethode, type oplosmiddel en concentratie, temperatuur, tijd en andere kunnen de samenstelling en extractiesnelheid van deze verbindingen aanzienlijk beïnvloeden [16]. Daarom is optimalisatie van de extractieprocessen vereist om een ​​hoog gehalte aan plantaardige actieve stoffen op te leveren. Oorspronkelijk ontwikkeld in de jaren vijftig door Box en Wilson, is de responsoppervlaktemethodologie (RSM) tegenwoordig het meest gebruikte hulpmiddel om dergelijke processen uit te voeren, te verbeteren en te optimaliseren waarin onafhankelijke factoren een gecombineerd effect hebben op de gewenste respons. Een van de meest geselecteerde ontwerpen in RSM door onderzoekers is het Box-Behnken-ontwerp (BBD) omdat het een beperkte proef nodig heeft en daarom een ​​alternatief is dat langdurige experimenten vermijdt en de kosten verlaagt [17-19].

Tot op heden zijn er geen studies beschikbaar in de literatuur met betrekking tot de extractie-optimalisatie van E. fragilis bioactieve verbindingen. Daarom was deze studie gericht op het optimaliseren van de extractie van de totale fenolische (TP) en flavonoïde (TF) inhoud uit E.fragilis door een BBD toe te passen. Het onder optimale extractieomstandigheden verkregen ruwe ethanolextract (CEE) werd achtereenvolgens gefractioneerd met oplosmiddelen van toenemende polariteit en hun antioxiderende en antiglycatie-activiteiten werden onderzocht met behulp van verschillende in vitro tests. Ten slotte hebben we in silico-analyse uitgevoerd om de mechanismen te begrijpen waarmee bioactieve verbindingen in EAE, zoals geïdentificeerd door reverse-phase high-performance vloeistofchromatografie (RP-HPLC), binden aan BSA en RAGE als doeleiwitten.

2. Resultaten en discussie

2.1. De modellen passen

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) voor twee antwoorden geeft de geschiktheid van modellen aan voor nauwkeurige voorspelling van de variatie in de resultaten [20]. Een goede precisie wordt beschreven als een signaal-ruisverhouding groter dan 4, wat wenselijk wordt geacht [21]. De waarden met voldoende nauwkeurigheid zijn respectievelijk 29,4772 en 28,729 voor TP- en TF-inhoud, wat een adequaat signaal aantoont. Tegelijkertijd duiden de kleinere waarden van de variatiecoëfficiënt (CV-percentage) (1,52 en 0,4246 procent voor respectievelijk TP- en TF-gehalten) op een betere precisie en betrouwbaarheid van experimentele waarden. Voor elke responsfactor werd de invloed van de extractiefactoren XI (ethanolconcentratie), X2 (extractietemperatuur) en X3 (extractietijd) zorgvuldig onderzocht (tabel 2). De significantie van elke coëfficiënt werd getest met behulp van F- en p-waarden, aangezien een grotere F-waarde en een kleinere p-waarde altijd leidden tot een significantere overeenkomst tussen verschillende onafhankelijke variabelen [22]. Gezamenlijk gaven deze resultaten aan dat de modellen reproduceerbaar waren en geschikt waren voor optimalisatie.

2.2. Effecten van extractievariabelen op TP-inhoud

Zoals weergegeven in Tabel 2, vertoonden de ANOVA-resultaten significante lineaire (X en X2), kwadratische (Xj, X5 en X) en interactieve (X1X en X2X3) effecten op TP-inhoud. Hiervan is het TP-gehalte voornamelijk afhankelijk van X, X3 bij p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

De waarde van gebrek aan fit was niet-significant (F-waarde =11.02, p-waarde=0.0843), wat aangeeft dat het model goed uitgerust is met een goede voorspelling (R{ {9}},9935; Adj R2=0,9818)(Tabel 2).

De interacties tussen ethanolconcentratie en extractietemperatuur (XjX2) produceren een zeer significante (p<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Deze effecten kunnen te wijten zijn aan het feit dat fenolische verbindingen polaire moleculen zijn die van nature voorkomen bij glucosiden, waardoor ze beter in water oplosbaar zijn [23]. Omdat de extractie van fenolische verbindingen sterk afhankelijk is van de polariteit van het oplosmiddel, is een water-alcoholmengsel effectiever in de extractie ervan dan alcohol alleen [20]. Met betrekking tot het "like-dissolves-like"-principe leidt een afname van de ethanolconcentratie tot een toename van de polariteit van het oplosmiddel, wat helpt bij het oplossen van TP[15]. Niettemin kan een hoge ethanolconcentratie de extractiesnelheid beïnvloeden door het oplossen van fenolische verbindingen te voorkomen. Evenzo verbeterde een verhoging van de extractietemperatuur het herstel van doelfenolverbindingen door weefselverzachting, verzwakte de integriteit van de celwand, verbeterde massaoverdracht en penetratie van oplosmiddel in de plantenmatrix, en verhoogde zowel de oplosbaarheid als de diffusiesnelheid; te hoge temperaturen voor een langere extractietijd kunnen echter de kans op degradatie vergroten [23]. Bovendien is gevonden dat een lange extractieperiode de blootstelling aan zuurstof en licht mogelijk verlengt, wat uiteindelijk het risico op vorming van vrije radicalen vergroot die kunnen worden weggevangen door fenolische verbindingen [23]. Daarom was een langere extractietijd niet nuttig om de extractieopbrengst te maximaliseren [24].

2.3.Effecten van extractievariabelen op TF-inhoud

Zoals blijkt uit tabel 2 zijn de lineaire effecten van X en X3; kwadratische effecten van X en X; en het interactie-effect van X1X2 en XjXg vertoonde significante effecten op het TF-gehalte. Van alle significante factoren is TF voornamelijk afhankelijk van X3,X,X,X en X1X2 op p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

De niet-significante waarde van gebrek aan fit (F-waarde=1.13; p-waarde=0.5024) suggereerde dat het voorgestelde model paste bij de ruimtelijke invloed van de variabelen op de respons met goede voorspelling (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (Tabel 2).

Er werden verschillende 3D-responsoppervlakgrafieken gegenereerd voor TF-inhoud en weergegeven in figuur 1D-F. Het interactie-effect van ethanolconcentratie en extractietemperatuur (X1X2) toonde een significante (p<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

Evenzo vertoonde de interactie tussen ethanolconcentratie en extractietijd (XIX3) een vergelijkbare correlatie (Figuur 1F). De extractieopbrengst van TF nam geleidelijk toe met toenemende ethanolconcentratie (Xj) en extractietijd (X3). Nabij het middelpunt van de responsgrafiek (respectievelijk 61,89 procent en 15,81 uur voor X en X3) bereikte de TF-opbrengst zijn hoogste, maar nam daarna langzaam af. Dit fenomeen is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het tweede diffusieprincipe van Fick, waaruit blijkt dat het uiteindelijke evenwicht tussen de oplossingsconcentratie in de vaste matrix en het oplosmiddel na een bepaalde duur zal worden bereikt, wat leidt tot een vertraging in de extractieopbrengst van doelverbindingen [26] .

2.4. Validatie van geoptimaliseerde voorwaarden

Het doel van de optimalisatie was om de extractieomstandigheden te bepalen die tegelijkertijd de hoogste TP- en TF-gehalten zouden opleveren. Ontwerpexpertsoftware werd gebruikt om optimalisatie uit te voeren. De BBD stelde de optimale ethanolconcentratie, extractietemperatuur en tijd voor om respectievelijk 61,93 procent, 44,43 graden en 15,84 uur te zijn voor de extractie van E. fragilis bioactieve verbindingen. Op dit optimale punt waren de voorspelde TP- en TF-gehalten respectievelijk 15,335 mg GAE/g dw en 2,972 mg OE/g dw (tabel 3). Validatie van het voorspellend vermogen van de modellen werd experimenteel uitgevoerd onder de optimale omstandigheden verkregen uit RSM. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd onder de verkregen omstandigheden en de gemiddelde TP- en TF-gehaltes waren respectievelijk 14,98 ± 0, 29GAE/g DW en 2,92 ± 0,09 QE/g dw. De experimentele waarden van de onderzochte responsen waren vergelijkbaar en in lijn met die van de voorspelde waarden, wat bevestigde dat de modellen voldoende waren om de verwachte optimalisatie weer te geven.

2.5. Extractieopbrengst en fytochemische analyse

Tabel 4 toonde de extractieopbrengst van E.fragilis CEE en zijn fracties. Onze resultaten toonden aan dat de extractieopbrengst in verschillende fracties significant verschilt van 0,78 tot 10,6 procent (w/wo). Zoals weergegeven in Tabel 4, is de CEE(1{{14} },6 procent ) had de hoogste procentuele opbrengst, gevolgd door WF (2,73 procent), WBF (2,04 procent), DMF (0,64 procent) en EAF (0,93 procent), terwijl HF (0,78 procent) ) had de laagste procentuele opbrengst.

Het TP-gehalte van E. fragilis CEE en zijn fracties werd bepaald door middel van een regressievergelijking van de kalibratiecurve (y {{0}}.009x-0.{{ 25}}154; R2=0.9973) en uitgedrukt in milligram galluszuurequivalenten (GAE) per gram gedroogd gewicht (Tabel 4). Over het algemeen had EAF het hoogste TP-gehalte (32,78±0,49 mg GAE/g DW), achtereenvolgens gevolgd door WBF, DMF en CEE (25,02±1,01,19,21±0,22 en 14,98±0,29 mg GAE/g DW), terwijl de WF en HF de laagste gehalten vertoonden (respectievelijk 10,47 ± 0,71 en 8,14 ± 0,17 mg GAE/g DW). Het TF-gehalte van E. fragilis CEE en zijn fracties werd geëvalueerd met een aluminiumchloride-colorimetrische test metquercetineas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Interessant is dat de TP- en TF-gehaltes in EAF 2,18 en 3,{3}}voudig hoger waren dan die van de CEE, wat suggereert dat ethylacetaat het geschikte oplosmiddel kan zijn om meer beschikbare fenolische en flavonoïdenverbindingen te concentreren tijdens de CEE-fractionering. Onze gegevens met betrekking tot TP- en TF-gehaltes komen overeen met die van Yao et al. [27] die melden dat de EAF verkregen uit de medicinale plant Pyrola asarifolia de hoogste niveaus van fenolen en flavonoïden had in vergelijking met de andere fracties (petroleumether, n-butanol en water). In hun onderzoek, Bhardwaj et al. [28] rapporteerde ook vergelijkbare resultaten bij het gebruik van verschillende oplosmiddelen met toenemende polariteit (n-hexaan, chloroform, ethylacetaat en n-butanol) bij de splitsing van een medicinale plant Codonopsis clematidea. Volgens deze auteurs heeft de EAF de hoogste TP- en TF-gehalten, in de verte gevolgd door de n-butanol-, chloroform- en hexaangehaltes. Deze significante variatie in de extractieopbrengsten, samenstelling en zuiverheid van fenolische verbindingen tussen de fracties is waarschijnlijk te wijten aan de verschillen in de polariteit van bestanddelen die worden aangetroffen in plantaardig materiaal, hun chemische structuur, hun polymerisatiegraad en hun interactie met elkaar [29] ].

2.6. In vitro antioxidant activiteit

2.6.1.DPPH "opruimactiviteit"

DPPH" is een van de weinige stabiele vrije radicalen die veel wordt gebruikt om het antioxidantpotentieel van plantenextracten te onderzoeken [30]. Het aaseterpotentieel van een extract wordt vaak geassocieerd met het vermogen om stabiele vrije radicalen op te vangen, wat te wijten is aan het vermogen om waterstof te doneren .

Het wegvangende vermogen van CEE/fracties en VC bij verschillende doses op DPPH*vrije radicalen werd bestudeerd. Figuur 2A laat zien dat alle fracties duidelijke DPPH·opruimingsactiviteit vertoonden op een dosisafhankelijke manier in het bereik van 0,1 tot 1 mg/ml. Bij een dosis van 1 mg/ml, 64.32.44.1{{22} },67,24,86,63,80,95,51,37 en 99,62 procent van de DPPH"radicalen werden uitgedoofd door respectievelijk CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF en VC. De laagste IC50 voor het wegvangen van DPPH van alle fracties werd weergegeven door EAF(0.116±{{30}}.015 mg/ml )vervolgd door WBF (0.175 ± 0.03 mg/ml), CEE (0.23 ± 0.065 mg/ml) en DMF (0.297 ±0,044 mg/ml). WF en HF vertoonden relatief hogere IC50-waarden (respectievelijk 0,964 ± 0,178 en 1,245 ± 0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

De IC50-waarde voor DPPH-radicaalvanging was significant positief gecorreleerd met zowel het TP-gehalte (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus opruimactiviteit

De ABTS-scavenging-assay wordt uitgebreid gebruikt als een index om de antioxidantcapaciteit van zuivere verbindingen en natuurlijke extracten te informeren en te onderzoeken [32,33]. Het vervagen van de blauw/groene kleur van de ABTS*-chromofoor op 734 in aanwezigheid van plantenextract kan wijzen op een antioxidantactiviteit.

Zoals te zien is in figuur 2B, vertoonde de opruimcurve van CEE/fracties op ABTS* plus een opwaartse trend naarmate de concentratie toenam. Bij 1 mg/ml waren de opruimingspercentages van CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF en VC 80.31,40.54,88.76, 9{{2{ respectievelijk {22}}}},11,82,97, 67,36 en 94,90 procent. Van alle fracties werd de minimale ICs0-waarde getoond door EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ ml)vervolgd door DMF(0.196±0.023 mg/ml), WBF (0.277±0.031 mg/ml), CEE(0.429 ± 0,039 mg/ml) en WF (0,654 ± 0,043 mg/ml), terwijl HF de hoogste ICs0-waarde liet zien (1,314 ± 0,104 mg/ml). Gezamenlijk was deze bevinding in overeenstemming met die van Kaewseejan en Siriamornpun [29]. Vergelijking met het remmende vermogen van VC (0,025 ± 0,005 mg/ml) toonde aan dat de wegvangende activiteit van CEE en zijn fracties enigszins zwak was.

Zoals weergegeven in Tabel 5, is er een zeer significante correlatie van ABTS-radicaalvanging met TP-inhoud (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. H2O2 opruimingsactiviteit

H2O2 levert een belangrijke bijdrage aan oxidatieve stress en diffundeert gemakkelijk door cellen door het membraan als een boodschappermolecuul [34]. Alles bij elkaar genomen is H2O2 zelf niet gevaarlijk [35], maar het kan reageren met Fe2 via de Fenton-reactie en geeft aanleiding tot het zeer reactieve hydroxylradicaal (OH*)[36]. Het is dus de meest schadelijke van de ROS voor biomoleculen. Het is daarom noodzakelijk om het vermogen van CCE en zijn verschillende fracties om H2O2 op te vangen, te evalueren.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF en de overeenkomstige opruimcapaciteiten bij 1.0 mg/ml waren respectievelijk 84,56,75,24, 67,17,56,18, 50,19 en 34,95 procent, wat veel lager was dan die van VC (98,03 procent).

Van alle fracties vertoonde EAF de laagste IC50-waarde (IC's0= 0.098±0,013 mg/ml), en deze was significant hoger dan die van VC (0,024 ± 0,006 mg/ml). Dit kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van hoge fenolische en flavonoïde verbindingen in de EAF, waarvan algemeen bekend is dat ze een cruciale rol spelen als antioxidanten in biologische systemen. In onze recente studie hebben we het vermogen van de EAF van E.fragilis aangetoond om Tetrahymena pyriformis te beschermen tegen H2O2-geïnduceerde oxidatieve schade [37].

Onze gegevensanalyse toonde aan dat, net als voor de DPPH"- en ABTS* plus-resultaten, een sterke positieve correlatie van de IC's0-waarde voor H2O2-opruiming werd waargenomen met zowel het TP-gehalte (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Vermogen verminderen

Het reducerende vermogen van een extract fungeert als een indicator van zijn potentiële antioxidantactiviteit [39, A40]. Het antioxidantpotentieel wordt geschat op basis van het vermogen van antioxidanten om ijzer (Fe3) in ferrichloride te reduceren tot ferro (Fe2 plus ). Over het algemeen worden de reducerende eigenschappen toegeschreven aan de aanwezigheid in plantenextracten van reductonen, waarvan bekend is dat ze hun werking uitoefenen door de vrije radicaalketen te verbreken door een waterstofatoom af te staan ​​[41].

Figuur 2D toont de dosis-responscurve voor het reducerende vermogen van E. fragilis-extracten. Het is bekend dat hoe hoger de absorptie bij 700 nm, hoe groter het reductievermogen. In de huidige studie vertoonden CEE en zijn vijf fracties een aanzienlijk reducerend vermogen op een concentratieafhankelijke manier.

De EAF vertoonde maximale antioxidantactiviteit (EC{{0}}.136± 0.{{10}}13 mg/ml) in vergelijking met VC(EC{{4 }}.083± 0.005 mg/ml). Dit werd op de voet gevolgd door WBF (EC50=0.180 ± 0,028 mg/ml), DMF (EC50=0.319 ± 0.031 mg/ml), CEE (EC50=0.334±0.029mg/ml) en WF(EC50=0.398±0.064 mg/ml) .HF bleef achter met minimale reducerende vermogensactiviteit (EC5s0 =0,626±0,068 mg/ml) vergeleken met andere fracties. Deze bevindingen suggereren dat EAF verschillende individuele verbindingen kan bevatten die een effectieve en krachtige reducerende krachtactiviteit hebben. Wetenschappers hebben ontdekt dat extracten van ethylacetaat kunnen dienen als sterke antioxidanten [42].

Er werd een positieve correlatie waargenomen tussen het verminderen van het vermogen en zowel het TP- als het TF-gehalte (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Fosfomolybdeen-assay

TAC van de CEE en zijn fracties evenals VC werden geëvalueerd met behulp van de fosfo-molybdeen-assay en uitgedrukt als EC's0, de concentratie die 0,5 absorptie levert. De methode was gebaseerd op de reductie van Mo(VI) tot Mo(V) door extracten om een ​​groen fosfaat/Mo(V)-complex te vormen bij zure pH met maximale absorptie bij 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(p<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Er werd een zeer significante correlatie waargenomen tussen de totale antioxidantactiviteit en zowel het TP-gehalte als het TF-gehalte (r=0.978 voor beide;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -Caroteen-linoleaat modelsysteem

In het -caroteen-linolzuurmodel ondergaan de sterk onverzadigde -caroteenmoleculen een snelle verkleuring als gevolg van vrije radicalen van linoleen die worden gegenereerd door de oxidatie van linolzuur [44]. Suppletie met antioxidanten zou de oxidatie van -caroteen kunnen minimaliseren door vrije radicalen van linoleaat te neutraliseren en zo het bleken van -caroteen te remmen [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

De EAF vertoonde de minimale IC50-waarde (IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 mg/ml) in vergelijking met BHT (IC's { {5}}.049 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. WIJ. en HF vertoonden relatief hogere IC's0-waarden van 0,5 ± 0,111 mg/ml, 0,998 ± 0,101 mg/ml, 1,073 ± 0,084 mg/ml, 1,402 ± 0,058 mg/ml, en respectievelijk 2,209 ± 0,081 mg/ml.

Er werd een significante correlatie op een positieve manier waargenomen tussen het wegvangen van caroteenoxidatie en zowel het TP-gehalte (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC en -caroteen. Daarom toonden we aan dat de krachtige antioxidantactiviteiten van CEE en zijn fracties hogere opruimingsactiviteiten vertoonden, en dit kan sterk te wijten zijn aan hun samenstelling uit fenolzuur en flavonoïden zoals galluszuur, rutine en quercetine.