DEEL 1 Cistanche Deserticola-polysaccharide remt OVX-geïnduceerd botverlies bij muizen en RANKL-geïnduceerde osteoclastogenese
Mar 02, 2022
Invoering
Osteoporose – een ziekte die wordt gekenmerkt door verminderde botmassa, abnormale microstructuur van botweefsel, verhoogde botfragiliteit en fracturen (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) – treft momenteel meer dan 200 miljoen mensen wereldwijd en vormt een aanzienlijke medische en sociaaleconomische last voor de moderne samenleving (Strom et al., 2011). De klinische behandeling van osteoporose is voornamelijk gericht op hormoonvervanging, bisfosfonaat of denosumabtherapie. Deze methoden zijn effectief, maar brengen bijwerkingen op de lange termijn met zich mee, zoals het potentiële risico op borstkanker en atypische femurfracturen (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Daarom is er een dringende behoefte om medicijnen te onderzoeken die niet alleen remmen,osteoporosemaar hebben ook minder ongewenste bijwerkingen.
Cistanche deserticola(CD), een tonic en geneeskrachtig voedsel dat veel wordt gebruikt in China, bekend als "woestijn ginseng", is de gedroogde, sappige stengel met schubbenblad vanC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) en heeft diverse en effectievefarmacologischactiviteiten, zoals immuunregulatie, anti-oxidatie en anti-osteoporoseeigenschappen (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Eerdere onderzoeken naar de werkzame stoffen van CD bij de behandeling van osteoporose waren vooral gericht op:fenylethanoïdeglycosiden(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). De CD bevat echter ook andere effectieve componenten zoals iridoïden, lignanen,polysachariden(Wang, Zhang en Xie, 2012). De klinische toepassing van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is voornamelijk het afkoken van water.Polysacharidenzijn in water oplosbare componenten en zijn hoogstwaarschijnlijk de belangrijkste farmacodynamische componenten van TCM. Van polysachariden geëxtraheerd uit TCM werd wild gerapporteerd dat ze een anti-osteoporoseeffect en enkele ongewenste bijwerkingen, die over het algemeen in klinieken zijn gebruikt (bijv. polysachariden geëxtraheerd uit Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018), en Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Daarom veronderstelden we datCistanche deserticolapolysacharide(CDP) geëxtraheerd uit CD kan een potentieel veilig medicijn zijn voor de behandeling van osteoporose.
Doorgaans handhaven botresorptie en botvorming een dynamisch evenwicht tijdens botremodellering in coördinatie met verschillende soorten cellen, waaronder osteoclasten, osteoblasten, botbekledingscellen en osteocyten (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Een breuk in dit evenwicht kan leiden tot verschillende botstofwisselingsziekten, zoals:osteoporose(Zhu et al., 2018) en osteosclerose (Ihde et al., 2011). Osteoclasten, als eindgedifferentieerde cellen afgeleid van de mononucleaire/macrofaaglijn, zijn de enige cellen met een botresorptiefunctie (Teitelbaum, 2000). Er zijn twee belangrijke cytokinen die deelnemen aan de differentiatie en rijping van osteoclasten (Koga et al., 2004): macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor KB (NF-KB) ligand (RANKL). M-CSF bemiddelt de differentiatie van hematopoëtische stamcellen tot osteoclastvoorlopers en bevordert de differentiatie van osteoclasten door de expressie van de RANK-receptor op te reguleren (Takayanagi, 2007). De binding van RANKL en RANK aan het osteoclastceloppervlak resulteert in het volgende: (1) rekrutering van signaaladaptermoleculen zoals TNF-receptor-geassocieerde factor 6 (TRAF6); (2) activering van meerdere stroomafwaartse doelen, waaronder NF-KB en door mitogeen geactiveerde proteïnekinasen (MAPK's); en (3) opregulatie van de expressieniveaus van nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, cytoplasma 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). De activering van deze signaalroutes reguleert direct de expressie van osteoclastgenen, waaronder zuurfosfatase 5 (Acp5) [dat codeert voor tartraatresistente zuurfosfatase (TRAcP)], matrixmetalloproteïnase 9 (MMP9) en cathepsine K (CTSK) (Boyle, Simonet , & Lacey, 2003). Daarom is de remming van RANKL-geïnduceerde osteoclastdifferentiatie-gerelateerde signaalroutes een potentiële therapeutische methode voor osteoporose.
In deze studie wilden we de effecten van CDP-behandeling op de ovariëctomie (OVX)-geïnduceerdeosteoporosemuismodel in vivo en op RANKL-geïnduceerde osteoclastactiviteit in vitro, met een focus op de expressie van osteoclast-specifieke genen en de activering van NFATc1 en de NF-KB- en MAPKs-signaleringsroutes. Onze bevindingen kunnen nieuwe inzichten verschaffen in het potentieel van CDP als een veilig en effectief medicijn voor de behandeling van osteoporose.
Voor meer informatie kunt u contact opnemen met:Joanna.jia@wecistanche.com
2. materialen en methoden
2.1. Chemicaliën en monstername
CD (nr. 180801) werd gekocht bij Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) en geïdentificeerd door professor Haibo Huang van de School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, China. Estradiolvaleraattabletten werden gekocht bij Bayer (Leverkusen, Noordrijn-Westfalen, Duitsland). Alfa-gemodificeerd minimaal essentieel medium
(-MEM) en foetaal runderserum (FBS) werden verkregen van Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). Penicilline/streptomycine en de TRAcP-kleuringskit werden verkregen van Solarbio (Beijing, China). Recombinante muis M-CSF en recombinante muis RANKL werden verkregen van R&D Systems (Minneapolis, MN, VS). Met hydroxyapatiet beklede platen werden gekocht bij Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, VS). De primaire antilichamen voor NFATc1 en CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK en P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, VS); en -actine (CWBIO, Beijing, China) werd ook verkregen. De andere reagentia die in dit onderzoek werden gebruikt, waren van analytische kwaliteit en het water werd gezuiverd door het Milli-Q-waterzuiveringssysteem (Millipore, Bedford, MA, VS).
2.2. CDP-extractie
De CD werd vermalen tot een fijn poeder en driemaal gemengd met petroleumether om het te verslaan. Het vaste residu werd door filtratie verzameld en vervolgens bij kamertemperatuur gedroogd. Depolysacharidenwerden gedurende 2 uur driemaal met water uit de voorbehandelde monsters geëxtraheerd, geconcentreerd, geprecipiteerd door toevoeging van watervrije ethanol tot een eindconcentratie van 80 procent (v/v) en 24 uur bij 4 C bewaard. De precipitaten werden verzameld door 20 minuten te centrifugeren bij 3000 rpm, opgelost in gedestilleerd water en gezuiverd (verwijdering van vrije eiwitten) met behulp van de Sevag-methode (Zhao et al., 2019). de hersteldepolysacharidenwerden gedialyseerd, gedroogd en bewaard tot verder gebruik. Bovendien toonden de resultaten van de chemische samenstelling aan dat het totale suiker-, uronzuur-, sulfaat- en eiwitgehalte van CDP 67,63 0,98 procent, 21,05 0,49 procent, 1,{{7 was. }},24 procent en 8,81 0,36 procent .
De monosaccharidesamenstelling en Fourier-transformatie-infraroodanalyse van CDP werden getoond in aanvullende figuren 1 en 2.
2.3. OVX-geïnduceerd osteoporose muismodel
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Guangzhou University of Chinese Medicine (goedgekeurd door SYXK 2019-0202). Dertig 6-weken oude vrouwelijke C57BL/6-muizen werden geleverd door het Experiment Animal Center van de Guangzhou University of Chinese Medicine. Na acclimatisatie gedurende 1 week kreeg één groep muizen een schijnoperatie (Sham-groep), terwijl de overige muizen een ovariëctomie-operatie ondergingen (OVX-groep). Na de operatie mochten de muizen 1-week herstellen. Vervolgens werden met succes gemodelleerde muizen willekeurig verdeeld in 5 groepen, met 6 muizen per groep:
(1) Sham-groep: behandeld met gedestilleerd water, (2) OVX-groep: behandeld met gedestilleerd water, (3) OVX E2-groep (E2): behandeld met 0.13 mg/kg estradiolvaleraattabletten (4 ) OVX CDP-groep met lage dosis (CDP-L): behandeld met 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP-groep met hoge dosis (CDP-H): behandeld met 600 mg/kg CDP. Gedestilleerd water, E2 of CDP werd eenmaal daags via een sonde toegediend. Alle muizen werden opgeofferd na de behandelingsperiode van 12- weken (Fig. 1A). De baarmoeders werden verzameld en gewogen, en de linker tibia's werden verzameld voor daaropvolgende onderzoeken. Volbloedmonsters werden verzameld en gecentrifugeerd bij 5000 rpm gedurende
15 minuten bij 4 C. De serumsupernatanten werden afgezogen en bewaard bij
-80 ◦C tot verdere analyse.
2.4. Microcomputertomografie (micro-CT) analyse en bothistomorfometrie
De linker tibia's werden 48 uur gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens in centrifugebuizen met normale zoutoplossing geplaatst. De vaste monsters werden gescand met Skyscan 1172 micro-CT-instrument (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, België) met de volgende instellingen: spanning, 80 kV; bronstroom, 100 A; Al, 0,5 mm-filter; pixel
grootte, 9,76 m; en rotatiestap, 0.6◦. Verschillende parameters van de
trabeculair bot, inclusief botmineraaldichtheid (BMD), botvolumefractie (BV/TV), botoppervlak per totaal volume (BS/TV), trabeculair aantal (Tb. N) en trabeculaire afstand (Tb. Sp) werden gemeten met CT-Analysator®-software (Bruker micro-CT, Skyscan). Driedimensionale afbeeldingen werden gegenereerd met behulp van CTVol-software (Bruker micro-CT. Skyscan).
Na micro-CT-analyse werden de linker tibia's ontkalkt in 14 procent EDTA-oplossing en ingebed in paraffine om te snijden. De monsters werden voorafgaand aan de hematoxyline- en eosine- (H&E)- en TRAcP-kleuringsexperimenten in secties van 5 µm gesneden met behulp van een microtoom. De gekleurde secties werden onderzocht en gedocumenteerd met behulp van de Olympus CX 31-microscoop (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan).
Cistanchekan de botdichtheid verbeteren en osteoporose verlichten
2.5. Serumanalyse
De calcium (Ca) en fosfor (P) concentraties werden bepaald volgens de kit instructies ontworpen door het Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). TRAcP-5b- en RANKL-niveaus in het serum werden geanalyseerd met respectievelijk TRAcP-5b ELISA-kit (CUSABIO, Wuhan, China) en RANKL ELISA-kit (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China).
2.6. In vitro osteoclastogenese-assay
BMM's werden geïsoleerd uit de tibia en femur van 6-week-oude vrouwelijke C57BL/6-muizen. De geïsoleerde cellen werden gekweekt in -MEM-medium dat 25 ng/ml M-CSF, 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine bevatte. Bij het bereiken van samenvloeiing werden de BMM's (1 104 cellen/putje) uitgezaaid in 96-putjesplaten en behandeld met CDP in aanwezigheid van 50 ng/ml RANKL. Het medium en CDP werden elke 2 dagen vervangen. Na 7 dagen werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gekleurd op de aanwezigheid van TRAcP. Het aantal osteoclasten, gedefinieerd als TRAcP-positieve cellen met drie of meer kernen, werd geteld en gedocumenteerd met behulp van een lichtmicroscoop.
2.7. Celproliferatietest
De BMM's (1 x 104 cellen/putje) werden uitgezaaid in een 96-putjesplaat en overnacht geïncubeerd. Hierna werden de cellen gedurende 48 uur behandeld met verschillende concentraties CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 µg/ml). De celsamenvloeiing werd gedetecteerd en geanalyseerd met behulp van IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, VS), een langdurig, realtime dynamisch live-celbeeldvormingssysteem.
2.8. Hydroxyapatietresorptietest
De BMM's ({{0}} cellen/putje) werden uitgezaaid in een met hydroxyapatiet gecoate plaat, behandeld met CDP in de aangegeven concentraties (0, 5 en 10 µg/ml) en gekweekt in compleet -MEM met 25 ng/ml M-CSF en 50 ng/ml RANKL. Na 7 dagen werden de cellen gewassen met een 10% bleekoplossing om de celcomponenten te verwijderen. De afbeeldingen van hydroxyapatietresorptiegebieden werden vastgelegd met IncuCyte ZOOM® en geanalyseerd met ImageJ-software (NIH, Bethesda, MD, VS) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).
2.9. RNA-isolatie en realtime reverse transcriptie-kwantitatieve PCR-analyse (RT-qPCR)
De BMM's ({{0}} cellen/putje) werden gezaaid in een 6-putjesplaat en gestimuleerd met RANKL en M-CSF in aanwezigheid van CDP in verschillende concentraties (0, 5 en 10 µg/ml) gedurende 5 dagen. Totaal RNA werd geïsoleerd uit de cellen of botweefsel van muizen met behulp van TRIzol-reagens (Sigma-Aldrich). Complementair DNA werd gesynthetiseerd uit 2 µg totaal RNA met behulp van een reverse transcriptase-kit (TransGen Biotech, Beijing, China). De RT-qPCR-reacties werden bereid met PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) en gedetecteerd door het ABI 7500-systeem (Applied
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, VS). De cyclusparameters voor PCR werden als volgt ingesteld: 95 C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 ◦C gedurende 15 s en 60 ◦C gedurende 30 s. De specifieke gebruikte primers worden getoond in Tabel 1 en de hoeveelheid van elk doelgen werd genormaliseerd naar GAPDH (interne controle).
2.10. Western-blot-analyse
De BMM's ({{0}} cellen/putje) werden gezaaid in een 6-putjesplaat. Voor experimenten met een kort tijdsverloop werden de cellen gedurende 1 uur voorgeïncubeerd met de verschillende concentraties CDP (0, 5 en 10 µg/ml) en vervolgens gedurende 30 minuten behandeld met 50 ng/ml RANKL. . Gedurende lange tijd werden de cellen gestimuleerd met 50 ng/mL RANKL op dag 3, 5 en 7 in aanwezigheid van CDP (0, 5 en 10 µg/mL). Totale eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van de RIPA-lysisbuffer (CWBIO). Eiwitten werden gescheiden door 10% SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF-membranen. De membranen werden gedurende 2 uur geblokkeerd met 5 procent magere melk bij kamertemperatuur, geïncubeerd met primaire
antilichamen 's nachts bij 4 ◦C, en dan met de bijbehorende secundaire
antistoffen gedurende 1,5 uur. De membranen zijn ontwikkeld met behulp van ECL-reagentia (Millipore Corp., Billerica, MA, VS) en afbeeldingen werden gemaakt met behulp van Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China).
Cistanchekan de botdichtheid verbeteren
2.11. Detectie van NFATc1-translocatie met behulp van immunofluorescentietest
De BMM's werden gezaaid op dekglaasjes van {{0}}putjes, gestimuleerd met RANKL en M-CSF en gedurende 5 dagen behandeld met 10 µg/ml CDP. De cellen werden gedurende 15 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde, driemaal gewassen met PBS en gedurende 10 minuten gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100. De cellen werden gemengd met 10% geitenserum (CWBIO) en 2 uur geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen een nacht bij 4 ◦C met het primaire antilichaam geïncubeerd en vervolgens met Alexa Fluor 488 geit-anti-muis secundair antilichaam (Abcam, Cambridge, MA, VS) gedurende 1 uur in het donker. De dekglaasjes werden gewassen met PBS, gemonteerd in Prolong Gold Antifade Reagent met 4′, 6-diamidino-2-fenyl in-dole (DAPI) (Solar), en
geïnspecteerd met behulp van Zeiss LSM 800 met Airyscan confocale microscoop (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland).
2.12. statistische analyse
Alle experimentele gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS 25.0 statistische software (IBM Corporation, Armonk, NY, VS). De gegevens voor dier- en celstudies worden uitgedrukt als respectievelijk gemiddelden ± SEM en gemiddelden ± SD. Resultaten maken gebruik van eenrichtingsanalyse van variantie of Student's t-test. Waarden van p < 0.05="" werden="" als="" statistisch="" significant="">
Cistanchekan verminderenapoptoseen bot verbeterendikte
