DEEL 1: Cistanche-extracten verbeteren de neurotoxiciteit die wordt veroorzaakt door waterstofperoxide in nieuwe mutant DJ-1-getransfecteerde neuroblastoom cellulaire modellen

Contact:joanna.jia@wecistanche.com

1. INLEIDING

De belangrijkste neurodegeneratieve ziekten omvatten:Alzheimerziekte, de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en anderen. Van deze aandoeningen is de incidentie van PD(ziekte van Parkinson) is de tweede in de wereld en behaalt 1 tot 2 procent bij mensen ouder dan 60 jaar (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Als het belangrijkste neurologische kenmerk van PD zijn de dopaminerge neuronen in de substantia nigra pars compacta progressief degeneratief (Glizer & MacDonald, 2016), wat gepaard gaat met het verschijnen van ‐synucleïne-insluitsels genaamd Lewy-lichaampjes (Zhang, An, Zhang, & Pu , 2010). In de pathogenese van PD worden rusttrillingen, stijfheid, bradykinesie en houdingsafwijkingen gediagnosticeerd als de belangrijkste symptomen van PD in de kliniek. Hoewel de exacte progressieve degeneratieve mechanismen van dopaminerge neuronen niet te begrijpen zijn, kunnen ofwel omgevingsoorzaken, waaronder blootstelling aan insecticiden, neurotoxische middelen en zware metalen, ofwel genetische oorzaken zoals mutaties van Parkin (Kitada et al., 1998), ‐synucleïne (Polymeropoulos et al. al., 1997) en DJ‐1 (Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003), worden verondersteld te leiden tot het optreden van PD. Tot op heden is het aantal missense-mutaties, frameshift-mutaties en grote fragmentdeleties veroorzaakt door DJ‐1-genmutaties groter dan 10 (Andres-Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). Binnen DJ‐1-eiwit valt de substitutie van Leucine166Proline (L166P) op als belangrijk. Daarnaast is ook aangetoond dat oxidatieve stress optreedt bij PD (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) en betrokken is bij de pathogenese ervan (Hague et al., 2003).

DJ‐1-gen met acht exons verdeeld over 24 kb, lokaliseert op chromosoom 1p36 bij mensen (Bonifati et al., 2003) en codeert voor een sterk geconserveerd eiwit dat 189 aminozuren bevat. Het eiwit behoorde tot de ThiJ/PfpI-familie en bestaat in een homodimeervorm. Gliacellen in de cortex en substantia nigra en striatum zijn de belangrijkste die worden aangetroffen in gebieden met DJ‐1-eiwit (Olzmann et al., 2007). In deze cellen speelt DJ‐1 de volgende rollen, zoals oncogen (Nagakubo et al., 1997), transcriptionele regulatie (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi‐ Niki, Taira, Iguchi-Ariga, & Agria, 2003 ), antioxidatieve stress (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), chaperonne (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006), en protease (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees, & Wood, 2003).

Behandeling voor neurodegeneratieve ziekten: cistanche-extract

Cistancheis traditionele Chinese geneeskunde en is door de eeuwen heen voornamelijk gebruikt om andrologische ziekten te behandelen. De belangrijkste actieve ingrediënten vanCistanchezijn fenylglycosiden waaronder 34 verbindingen, zoals acteoside, echinacoside, enz. De farmacologische effecten vanCistanche-extractenomvatten verbetering van de seksuele functie, anti-aging, toenemend leer- en geheugenvermogen, neuroprotectie, immunomodulatie, antivermoeidheid, anti-ischemische en leverbescherming (Tu et al., 2011). Cafeïnezuur is een van de belangrijkste metabolieten van Cistanche (Yan, 2018).

De veelgebruikte cellulaire modellen van PD omvatten door 1‐methyl‐4‐ fenylpyridiniumion-geïnduceerde PC12-cellen (Abou-Sleiman et al., 2003) en door waterstofperoxide (H2O2) geïnduceerde neuroblastoomcellen (SH-SY5Y) (Zhang et al., 2003). ., 2009). De typische pathologische kenmerken van PD zijn echter niet aanwezig in deze modellen. Om een ​​meer fysiologisch relevant cellulair model van PD te ontwikkelen, hebben we in deze studie H2O2-geïnduceerde L166P- en C106S DJ‐1-getransfecteerde SH‐SY5Y-cellen vastgesteld en de effecten vanCistanche-extractenen belangrijke bioactieve verbindingen, waaronder acteoside, echinacoside, cafeïnezuur enCistanche totaal glycosidenvoor het eerst op deze twee modellen.

Cistanche-extract anti-neurodegeneratieve ziekten

2. MATERIALEN EN METHODEN

2.1|Plasmiden, medicijnen, chemicaliën en cellen

FLAG‐L166P DJ‐1, FLAG‐C106S DJ‐1-plasmiden en anti-DJ‐1-polyklonale antilichamen werden vriendelijk geleverd door Dr. Hiroyoshi Ariga, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University. Gedehydrateerd minimaal essentieel medium (MEM) en F12-medium werden gekocht bij Gibco. Lipofectine was van Invitrogen. FastDigest Xho I en FastDigest EcoR I waren van Fermentas. De endotoxinevrije plasmide-bereidingskit was van biotech. De SH‐SY5Y-cellijn was van de Cell Bank van de Chinese Academie voor Medische Wetenschappen. BCA-eiwitassay-reagenskit was van Pierce. PVDF-membranen waren van Millipore. Anti-FLAG polyklonaal antilichaam was van GeneTex.Cistanche-extracten, waaronder acteoside, echinacoside, cafeïnezuur en totale glycosiden van Cistanche, werden geleverd door het Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University.

2.2|Plasmidenamplificatie, extractie en zuivering

Na het kweken van Escherichia coli JM109-cellen in vloeibaar LB-medium tot OD600=0.5, werden competente cellen bereid met behulp van de calciumchloridemethode. De competente E. coli werden vervolgens getransformeerd met plasmide-DNA met behulp van de heat shock-methode, waarna de transformanten 16-24 uur bij 37 graden werden gekweekt op LB-platen met ampicilline. Een succesvol getransformeerde monoklonale kolonie werd vervolgens geselecteerd en gekweekt in vloeibaar LB-medium dat 50 ug/ml ampicilline bevatte gedurende nog eens 12 uur bij 37°C. De plasmiden werden geëxtraheerd en gezuiverd met behulp van een endotoxinevrije plasmidebereidingskit volgens de instructies van de fabrikant.

2.3|Plasmide identificatie

Geëxtraheerde plasmiden werden onderworpen aan enzymatische digestie, waarna de plasmiden en gedigereerde fragmenten werden onderzocht met behulp van 1 procent agarosegelelektroforese. De resulterende gel werd 20-25 minuten bij kamertemperatuur in EB-oplossing gekleurd en gefotografeerd.

2.4|Plasmidetransfectie in SH‐SY5Y-cellen

Gezuiverd plasmide-DNA werd getransfecteerd in SH‐SY5Y-cellen die waren gekweekt in MEM/F‐12-medium dat 10% foetaal runderserum bevatte. Getransfecteerde cellen werden vervolgens geselecteerd in een medium dat 400 ug/ml G418 bevatte, waarna 200 ug/ml G418 werd gebruikt om de stabiel getransfecteerde cellijn te behouden.

2,5|Identificatie van getransfecteerde cellen door Western blot

Getransfecteerde SH‐SY5Y-cellen werden gelyseerd in RIPA-buffer. Na centrifugatie van het lysaat werd de totale eiwitconcentratie in het supernatant bepaald met behulp van een BCA-eiwitassayreagenskit. Gelijke hoeveelheden eiwitextract werden vervolgens onderworpen aan een 12,5% SDS-polyacrylamidegelelektroforese en overgebracht op een PVDF-membraan. Het PVDF-membraan werd geblokkeerd met 5 procent magere droge melk in TBST-oplossing en verwerkt voor immunodetectie. Anti-FLAG en anti-DJ‐1 werden gebruikt als primaire antilichamen, en HRP-geconjugeerd IgG was het secundaire antilichaam. Een verbeterd chemiluminescentiedetectiesysteem werd toegepast om de doeleiwitten te detecteren.

2.6|Immunocytochemische identificatie van getransfecteerde cellen

Getransfecteerde SH‐SY5Y-cellen werden gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde-oplossing, permeabel gemaakt met 0,3 procent Triton X-100-oplossing en geblokkeerd met 10 procent geitenserum. De geblokkeerde cellen werden vervolgens eerst geïncubeerd met anti-FLAG en anti-DJal-polyklonaal antilichaam en vervolgens met FITC-geconjugeerd secundair geit-antikonijn. De celkernen werden gekleurd met Hoechst 33342 en de cellen werden zichtbaar gemaakt onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (IX-71, Olympus).

2.7| Levensvatbaarheidstest van de cel

Ongetransfecteerde en getransfecteerde SH‐SY5Y-cellen werden uitgeplaat in 96‐-extracten, waaronder acteoside, echinacoside, cafeïnezuur en totale glycosiden van Cistanche (allemaal respectievelijk 10, 20 en 40 ug/ml), en de cellen werden 6 uur geïncubeerd vóór behandeling met 0,2 mM H202 gedurende nog eens 1 uur. Het medium werd weggegooid en de levensvatbaarheid van de cellen werd getest met behulp van MTT zoals hierboven beschreven.

2.8|Effecten van cistanche-extracten op de levensvatbaarheid van cellen

extracten, waaronder acteoside, echinacoside, cafeïnezuur en totale glycosiden van Cistanche (allemaal respectievelijk 10, 20 en 40 ug/ml), werden toegevoegd en de cellen werden 6 uur geïncubeerd vóór behandeling met 0,2 mM H2O2 voor nog eens 1 uur. Het medium werd weggegooid en de levensvatbaarheid van de cellen werd getest met behulp van MTT zoals hierboven beschreven.

2.9|statistische analyse

Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA en de LSD-methode met SPSS 22.0-software. Waarden van p < 0.05="" werden="" als="" significant="">

Cistanchekruid

3|RESULTATEN

3.1|Plasmiden werden met succes getransformeerd en gezuiverd. Na afzonderlijke expressie in E. coli JM109 werden plasmiden geëxtraheerd en onderzocht met 1 procent agarosegelelektroforese na digestie met een restrictie-enzym (Figuur 1). De plasmiden van 6,2 kb werden gesplitst in lineaire DNA-fragmenten van 5,4 en 0,8 kb, wat bevestigde dat de L166P- en C106S DJ‐1-plasmiden beide met succes tot expressie werden gebracht en gezuiverd.

3.2|Identificatie van getransfecteerde cellen door Western-blotting. Zoals weergegeven in figuur 2, hebben we FLAG‐L166P DJ‐1- en FLAG‐C106S DJ‐1-banden gedetecteerd bij ongeveer 70 kDa. De hoge niveaus van FLAG‐-gelabeld eiwit in de getransfecteerde SH‐SY5Y-cellen geven aan dat de L166P- en C106S DJ‐1-mutanten sterk tot expressie werden gebracht in hun respectieve transfectanten.

3.3|Immunocytochemische identificatie van getransfecteerde cellen. Het toont de sterke fluorescerende signalen van getransfecteerde SH‐ SY5Y-cellen na incubatie met anti-DJ‐1- of anti-FLAG-antilichamen. Dit bevestigt de hoge niveaus van L166P en C106S DJ‐1 tot expressie gebracht in de transfectanten.

3.4|Getransfecteerde cellen waren gevoeliger voor H202 dan niet-getransfecteerde cellen. Na incubatie gedurende 1 uur in aanwezigheid van gegradeerde concentraties van H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} },5 en 1 mM, waren de levensvatbaarheid van SH‐SY5Y-cellen getransfecteerd met L166P of C106S DJ‐1 dosisafhankelijk verminderd in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen

3.5|Cistanche-extracten remden H2O2-geïnduceerde reducties SH-SY5Y-levensvatbaarheid werd dosisafhankelijk geremd door behandeling metCistanche-extracten, waaronder acteoside, echinacoside, cafeïnezuur en totale glycosiden van Cistanche (allemaal respectievelijk 10, 20 en 40 ug/ml).

Cistanche