Deel 1 Doxorubicine verbetert op paradoxale wijze tumor-geïnduceerde ontsteking bij jonge muizen
Mar 11, 2022
Contactpersoon: ali.ma@wecistanche.com
Ibrahim Y. Abdelgawad et al
Cistanche tubulosa voorkomt nierziekte, klik hier voor deproducten en Cistanche herba
Abstract:
Doxorubicine(DOX) is een van de meest gebruikte chemotherapeutica in de kinderoncologie. DOX wekt een ontstekingsreactie op in meerdere organen, wat bijdraagt aan door DOX veroorzaakte bijwerkingen. Kanker zelf veroorzaakt ontstekingen die leiden tot meerdere pathologische aandoeningen. De huidige studie onderzocht de ontstekingsreactie op DOX entumorenmet behulp van een EL4-lymfoom, immunocompetent, juveniel muismodel. Vier weken oude mannelijke C57BL/6N-muizen werden subcutaan geïnjecteerd met EL4-lymfoomcellen (5 x 104 cellen/muis) in het flankgebied, terwijltumor-vrije muizen werden geïnjecteerd met vehiculum. Drie dagen na tumorimplantatie werden zowel tumorvrije als tumordragende muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met ofwel DOX (4 mg/kg/week) of zoutoplossing gedurende 3 weken. Een week na de laatste DOX-injectie werden de muizen geëuthanaseerd en de harten, levers,nierenen serum werden geoogst. Genexpressie en serumconcentratie van ontstekingsmarkers werden gekwantificeerd met respectievelijk real-time PCR en ELISA. DOX-behandeling aanzienlijk onderdrukttumorgroei bij tumordragende muizen en veroorzaakte significante hartatrofie bij tumorvrije en tumordragende muizen. EL4-tumoren veroorzaakten een sterke ontstekingsreactie in het hart, de lever ennier. Opvallend is dat de DOX-behandeling de tumor-geïnduceerde ontsteking verbeterde die paradoxaal was voor het effect van DOX bij tumorvrije muizen, wat een wijd uiteenlopend effect aantoont van DOX-behandeling bij tumorvrije versus tumordragende muizen.
trefwoorden:doxorubicine; tumor; ontsteking
1. Inleiding
Doxorubicine (DOX), ook bekend als Adriamycine, is een van de meest gebruikte chemotherapeutica in de klinische kinderoncologie. Ondanks de effectiviteit bij een breed scala aan kankers, waaronder lymfoom, leukemie en andere vormen van kanker bij kinderen, is de klinische bruikbaarheid van DOX beperkt vanwege de toxiciteit van meerdere organen. Naast de duidelijke cardiotoxiciteit [1], is aangetoond dat DOX nefrotoxiciteit [2-5] en hepatotoxiciteit [6] veroorzaakt. Bijna 50 procent van de pediatrische kankerpatiënten krijgt DOX als onderdeel van hun behandelprotocol [7]. Dankzij effectieve kankerbehandelingen, waaronder DOX, is de 5-jaarsoverleving van kinderen met de diagnose kanker gestegen van minder dan 60 procent in de jaren zeventig tot meer dan 80 procent nu [8,9]. Dit leidt tot een grote populatie van overlevenden van kinderkanker (CCS's), geschat op ongeveer 400,000. Helaas lopen CCS's een hoog risico op het ontwikkelen van bijwerkingen op de lange termijn als gevolg van de behandeling van kanker en/of kanker zelf.
Van DOX is aangetoond dat het systemische ontsteking [10-12] en ontstekingsreactie in meerdere organen, waaronder het hart [13], veroorzaakt,nier[14], en lever [15]. Het is aangetoond dat deze ontstekingsreactie DOX-geïnduceerde bijwerkingen bevordert [16,17]. De meeste van deze onderzoeken die DOX-geïnduceerde ontsteking rapporteren, zijn uitgevoerd in:tumor-vrije diermodellen die niet het klinische scenario nabootsen waarin pediatrische kankerpatiënten een DOX-behandeling krijgen na diagnose van kanker. Van kanker als zodanig is ook aangetoond dat het ontstekingen veroorzaakt die bijdragen aan meerdere pathologische aandoeningen die DOX-geïnduceerde toxiciteiten kunnen verergeren [18,19]. Daarom is er een cruciale behoefte om klinisch relevante diermodellen op te stellen om de mechanismen van door DOX geïnduceerde toxiciteit van meerdere organen bij jonge,tumor-dragende muizen om het samenspel tussen DOX-behandeling en kanker zelf te bestuderen om dergelijke toxiciteiten te veroorzaken.
In de huidige studie hebben we de ontstekingsreactie op DOX en de tumor onderzocht in een klinisch relevant syngeen EL4-lymfoom, immunocompetent, juveniel muismodel. Dit model is goed ingeburgerd in kankeronderzoek [20] en is klinisch relevant voor pediatrische kankerpatiënten, aangezien lymfoom een van de meest voorkomende vormen van pediatrische kanker is [21]. Het gebruik van syngene muizen is van cruciaal belang voor het bestuderen van de ontstekingsreactie op zowel DOX als de tumor vanwege de cruciale rol van het immuunsysteem in de pathogenese van ontsteking [22]. De leeftijd van de muizen was 5 weken na toediening van DOX, wat overeenkomt met de adolescentieleeftijd van 10-12 jaar bij mensen [23]. Bovendien zijn de toegediende DOX-doses klinisch relevant voor de doses die worden ontvangen door pediatrische kankerpatiënten [24]. We hebben eerst de effecten van DOX op de hartfunctie bepaald in tumorvrije en tumordragende muizen, aangezien DOX-geïnduceerde cardiotoxiciteit wordt beschouwd als de meest klinisch relevante bijwerking van DOX, naast andere toxiciteiten voor meerdere organen. Daarna bepaalden we het effect van DOX, de tumor en hun combinatie op verschillende ontstekingsmarkers in het hart, de lever enniernaast serummarkers van systemische ontsteking. We ontdekten dat de aanwezigheid van de EL4-tumor een sterke ontstekingsreactie opwekte in meerdere organen. Opvallend is dat de DOX-behandeling de tumor-geïnduceerde ontsteking verbeterde, paradoxaal ten opzichte van het eerder gerapporteerde effect van DOX bij tumorvrije muizen.
2. Resultaten
2.1. Effecten van DOX op lichaamsgewicht en tumorgroei
De huidige studie werd opgezet in juveniele muizen om het klinische scenario bij pediatrische kankerpatiënten na te bootsen, zoals beschreven in figuur 1A. Er werd geen significante morbiditeit of mortaliteit waargenomen bij tumorvrije of tumordragende muizen na blootstelling aan DOX (4 mg/kg/week gedurende 3 weken), wat in overeenstemming is met onze eerdere studie met dezelfde dosis [25]. Juveniele blootstelling aan DOX resulteerde echter in een significant verminderde toename van het lichaamsgewicht in vergelijking met met zoutoplossing behandelde muizen (Figuur 1B). Om het antikankereffect van DOX in dit EL4-lymfoommodel te beoordelen, hebben we de tumorgewichten gemeten na necropsie van muizen. Chronische DOX-toediening bij tumordragende muizen remde significant de EL4-tumorgroei, wat het antikankereffect van dit doseringsregime van DOX aantoont (Figuur 1C).
2.2. Effect van DOX-toediening op de hartfunctie en morfometrie bij tumorvrije en tumordragende muizen
DOX veroorzaakte cardiale atrofie, zoals blijkt uit een significante afname van het hartgewicht tot de lengte van het scheenbeen (HW/TL) (Figuur 1D). Opmerkelijk is dat cardiale atrofie veroorzaakt door DOX werd vergroot in tumordragende muizen (Figuur 1D). De effecten van DOX, tumor en de combinatie van beide op de hartfunctie en morfologie werden beoordeeld met behulp van transthoracale echocardiografie. Representatieve M-Mode-afbeeldingen van elke groep worden weergegeven in figuur 2A. Noch DOX, noch de tumor veroorzaakten significante veranderingen in de ejectiefractie (Figuur 2B), hartminuutvolume (Figuur 2C), fractionele verkorting (Figuur 2D), linkerventrikel (LV) massa (Figuur 2E), LV-achterwanddikte in diastole (LVPW' d) (Figuur 2F), of LV posterieure wanddikte in systole (LVPW's) (Figuur 2G).
2.3. Effect van DOX-toediening op genexpressie van ontstekingsmarkers in het hart van tumordragende en tumorvrije muizen
Harten werden geoogst van zowel tumorvrije als EL4-lymfoomtumordragende juveniele C57BL/6N-muizen één week na de toediening van 4 mg/kg/week DOX of een equivalent volume steriele zoutoplossing gedurende 3 weken (n=8 per groep). Na extractie van totaal RNA, cardiale mRNA-expressie van ontstekingsmarkers interleukine-1 alfa (IL-1 ), interleukine-1 bèta (IL-1 ), interleukine{{12} } (IL-6), tumornecrosefactor-alfa (TNF-), inflammatoire chemokinen monocyt chemoattractant eiwit-1 (Mcp-1), en CX C-motief chemokinen (Cxcl1, Cxcl9 en Cxcl10) werden bepaald door real-time PCR. De genexpressie van meerdere ontstekingsmarkers in het hart was significant opgereguleerd in tumordragende muizen in vergelijking met tumorvrije muizen, waaronder de pro-inflammatoire cytokines IL-1 (Figuur 3A), IL-1 ( Figuur 3B), IL-6 (Figuur 3C) en TNF- (Figuur 3D) en de inflammatoire chemokines Mcp-1 (Figuur 3E), Cxcl1 (Figuur 3F) en Cxcl10 (Figuur 3H). Terwijl DOX-toediening bij tumorvrije muizen niet resulteerde in significante veranderingen in de expressie van ontstekingsmarkers in het hart, heft DOX-toediening de tumor-geïnduceerde opregulatie van IL-1 (Figuur 3B), Mcp{{44} significant op. } (Figuur 3E), Cxcl9 (Figuur 3G) en Cxcl10 (Figuur 3H). Belangrijk is dat tweeweg-ANOVA een significant interactie-effect vertoonde in alle markers behalve Cxcl1, Cxcl9 en Cxcl10, wat de uiteenlopende effecten aantoont die DOX heeft op cardiale inflammatoire markers bij tumordragende in vergelijking met tumorvrije muizen.
2.4. Effect van DOX-toediening op genexpressie van ontstekingsmarkers in de lever van tumorvrije en tumordragende muizen
Levers werden geoogst van zowel tumorvrije als EL4-lymfoomtumordragende juveniele C57BL/6N-muizen één week na de toediening van 4 mg/kg/week DOX of een equivalent volume steriele zoutoplossing gedurende 3 weken (n=8 per groep). Na extractie van totaal RNA, hepatische mRNA-expressie van ontstekingsmarkers IL-1 , IL-1 , IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 en Cxcl10 werden bepaald door real-time PCR. Tumordragende muizen hadden een significant verhoogde leverexpressie van de pro-inflammatoire cytokines IL-1 (Figuur 4A), IL-1 (Figuur 4B), TNF- (Figuur 4D), Cxcl9 (Figuur 4G), en Cxcl10 (Figuur 4H) vergeleken met tumorvrije muizen. Hoewel minder opmerkelijk, toont tweerichtings-ANOVA een significant effect van de tumor op de hepatische genexpressie van IL-6 (Figuur 4C). Tweerichtings-ANOVA toonde een significant interactie-effect aan tussen de tumor en DOX in Cxcl10 (Figuur 4H). DOX-toediening verminderde de tumor-geïnduceerde opregulatie van IL-1 en TNF- (Figuur 4B, D). Noch DOX, noch de tumor had een significant effect op de hepatische expressie van inflammatoire chemokinen Mcp-1 en Cxcl1 (Figuur 4E, F).
2.5. Effect van DOX-toediening op genexpressie van ontstekingsmarkers in de nier van tumorvrije en tumordragende muizen
Nieren werden geoogst van zowel tumorvrije als EL4-lymfoomtumordragende juveniele C57BL/6N-muizen één week na de toediening van 4 mg/kg/week DOX of een equivalent volume steriele zoutoplossing gedurende 3 weken (n=8 per groep). Na extractie van totaal RNA, renale mRNA-expressie van ontstekingsmarkers IL-1 , IL-1 , IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 en Cxcl10 werden bepaald door real-time PCR. In overeenstemming met de waargenomen veranderingen in het hart en de lever, hadden tumordragende muizen een significant verhoogde renale expressie van de pro-inflammatoire cytokines IL-1 (Figuur 5A), IL-1 (Figuur 5B), TNF- (Figuur 5D) en Mcp-1 (Figuur 5E) vergeleken met tumorvrije muizen. Bovendien toont tweerichtings-ANOVA een significant effect van de tumor op de renale genexpressie van Cxcl1 (Figuur 5F), Cxcl9 (Figuur 5G) en Cxcl10 (Figuur 5H). DOX-toediening bij tumordragende muizen verbeterde significant de tumor-geïnduceerde opregulatie van IL-1 (Figuur 5B), IL-6 (Figuur 5C), TNF- (Figuur 5D) en Mcp{{43} } (Figuur 5E). Binnen die markers toonde tweerichtings-ANOVA ook een significante interactie aan tussen DOX en de tumor, wat de verschillende effecten aantoont die DOX heeft op nierinflammatoire markers bij tumordragende muizen in vergelijking met tumorvrije muizen.
2.6. Effect van DOX-toediening op histopathologische kenmerken in het hart, de lever en de nieren van tumorvrije en tumordragende muizen
Harten, levers en nieren werden geoogst uit één cohort tumorvrije en EL4-lymfoomtumordragende juveniele C57BL/6N-muizen één week na de toediening van 4 mg/kg/week DOX of een equivalent volume steriele zoutoplossing gedurende 3 weken ( n=4 per groep). De histopathologische evaluatie toonde geen grote pathologische veranderingen in het hart aan (Figuur 6A). Slechts minimale infiltratie van ontstekingscellen, aangetoond als zeldzame foci van minimaal cellulaire gemengde (mononucleaire en neutrofiele) ontsteking, werd waargenomen in de leverweefsels die waren geoogst van met DOX behandelde tumorvrije (drie van de vier muizen), met zoutoplossing behandelde tumordragende ( twee van de vier muizen) en met DOX behandelde tumordragende muizen (drie van de vier muizen) (Figuur 6B). Histopathologische evaluatie van de nieren toonde geen grote pathologische veranderingen aan in alle groepen behalve met DOX behandelde tumordragende muizen (Figuur 6C), waarbij twee van de vier muizen in deze groep regio's van tubulaire regeneratie van volledige dikte, fibrose en milde interstitiële ontsteking die ongeveer 5 procent van het totale weefseloppervlak aantast.
2.7. Uiteenlopende effecten van DOX op ontstekingscytokines in serum bij tumorvrije versus tumordragende muizen
We hebben eerder gemeld dat acute DOX-toediening een systemische ontstekingsreactie opwekte bij volwassen C57BL/6N-muizen [11]. Hierin hebben we het effect bepaald van chronische DOX-toediening op serumniveaus van de ontstekingsmarkers IL-6 en TNF-, in juveniele tumorvrije en tumordragende muizen. Met zoutoplossing behandelde tumordragende muizen vertoonden een duidelijke, hoewel statistisch onbeduidende toename in serum IL-6 (Figuur 7A) en TNF- (Figuur 7B) vergeleken met tumorvrije muizen. Belangrijk is dat tweeweg-ANOVA een significante interactie aantoonde tussen DOX-toediening en de tumor op de serumspiegels van IL-6 en TNF-. Inderdaad, DOX-toediening normaliseerde de tumor-geïnduceerde opregulatie van IL-6 tot een vergelijkbaar niveau als controletumorvrije muizen (Figuur 7A).
