Deel 1 | Herba Cistanche-extract verbetert mitochondriale ATP-generatie in rattenharten en H9c2-cellen

Contactpersoon: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung en Kam Ming Ko

Afdeling Biochemie, Hong Kong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, China

Trefwoorden: ATP,Cistanche deserticola |, H9c2 cellen, hart, mitochondriën

Abstract

Het onderzoeken van de farmacologische basis van de "Yang- verkwikkend" werking van Herbal Cistanche [de gedroogde hele plant vanCistanche deserticola |Y.C. Ma (Orobanchaceae)], in de Chinese geneeskunde werden de effecten van het methanolextract van Herba Cistanche op de mitochondriale ATP-opwekkingscapaciteit onderzocht met behulp van een ex vivo rattenhartmodel en een in situ H9c2-celtest. Behandeling met Herba Cistanche-extract verhoogde de myocardiale mitochondriale ATP-opwekkingscapaciteit op een dosisafhankelijke manier bij ratten, zoals beoordeeld door in vitro meting. De stimulatie van atp-opwekkingscapaciteit was geassocieerd met een parallelle verbetering van mitochondriaal elektronentransport ondersteund door pyruvaat maar niet door succinaat. Herba Cistanche behandeling verhoogde ook de myocardiale mitochondriale complex I en complexe III activiteiten, waarbij de mate van stimulatie op complex I activiteit groter was. De behandeling met Herba Cistanche veroorzaakte een dosis- en tijdsafhankelijke toename van de mitochondriale ATP-opwekkingscapaciteit in H9c2-cellen. De resultaten geven aan dat herba Cistanche behandeling kanmitochondriale ATP-generatie verhogenin rattenharten ex vivo en H9c2 cellen in situ, eventueel doorverbetering van de oxidatieve fosforylering.

Cistanche kan de hartfunctie, lagere bloeddruk en lagere bloedlipiden verbeteren

Introductie

"Yang-verkwikking", die de gegeneraliseerde verbetering van de lichaamsfunctie in de Chinese geneeskunde belichaamt, omvat het gebruik van energie bij het aansturen van verschillende biochemische processen.

In dit opzicht wordt ATP, de universele valuta van energie bij het voeden van cellulaire functie, voornamelijk gegenereerd door oxidatieve fosforylering in mitochondriën. We hebben gepostuleerd dat "Yang verkwikkende" kruidenbeschikken over het vermogen om de mitochondriale ATP-opwekkingscapaciteit te vergroten(Ko et al., 2004). Dit wordt ondersteund door onze recente bevinding dat "Yang-verkwikkende" maar niet "Yin-voedende" Chinese tonificerende kruiden de myocardiale ATP-opwekkingscapaciteit in muizenharten ex vivo kunnen verbeteren (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, de gedroogde hele parasitaire plant (exclusief de bloem) van Cistanche deserticola Y.C. Ma (Orobanchaceae), is geclassificeerd als een'Yang-verkwikkend' tonificerend kruid in de traditionele Chinese geneeskunde (Chen, 1998), en het verschijnt als het meest populaire ingrediënt in een aantal Chinese patenten voor- mulaties gebruikt voor Yang-invigoration'. In China en Japan wordt Herba Cistanche veel gebruikt voor de behandeling van een groot aantal Yang-deficiëntiesymptomen. Farmacologische studies wezen uit dat Herba Cistanchevrije radicalen opruimen(Xiong et al., 1996),kalmerend middel produceren(Lu, 1998),antiaging(Lee et al., 1990),antinociceptieve en ontstekingsremmende effecten(Lin et al., 2002), enverbeteren van de immuunfunctie(Wu et al., 2005). Het belangrijkste werkzame bestanddeel van Herba Cistanche isfenylethanoïde glycosiden(Ouyang et al., 2003), waarvan is vastgesteld dat zeantibacterieel, antistress en antioxidatiefeigenschappen (Xiong et al., 1998), evenals anti-apoptotische effecten op gekweekte neuronen (Tian & Pu, 2005). In de huidige studie, om de farmacologische basis van de Yang-verkwikkende werking van Herba Cistanche te onderzoeken, werden de effecten van Herba Cistanche behandeling op de ATP-opwekkingscapaciteit in mitochondriën geïsoleerd uit rattenharten ex vivo en gekweekte H9c2 cardiomyocyten in situ onderzocht. Om het biochemische mechanisme te onderzoeken dat ten grondslag ligt aan de ATP-generatieverbeterende werking, werden de effecten van Herba Cistanche-behandeling op mitochondriaal elektronentransport en complexe I-IV-activiteiten ook onderzocht in rattenharten.

De effectieve ingrediënten van Cistanche kunnen verschillende actieve zuurstofvrije radicalen opruimen

Materialen en methoden

Chemicaliën, celkweek en kruidenmaterialen

ATP, ADP en 3-[4,5-dimethylthiozol-2-yl]-2,5-difenyl- tetrazoliumbromide (MTT) werden gekocht van Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). Luciferase-oplossing (ATPlite) werd verkregen uit PerkinElmer (Boston, MA, VS). Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht van GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, VS). H9c2 cellijn werd gekocht van ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche werd geleverd door een lokale kruidenhandelaar (Lee Hoong Kee). Het kruid werd geauthenticeerd door de leverancier en een voucherexemplaar (HKUSTY00301) werd gedeponeerd bij de afdeling Biochemie, Hong Kong University of Science & Technology (HKUST).

Kruidenextractie

Herba Cistanche (100g) werd in kleine stukjes gesneden en vervolgens geëxtraheerd door verhitting onder reflux in 300 ml methanol bij 65◦C gedurende 2 uur. De procedure werd twee keer herhaald. Het gepoolde extract werd gedroogd door het oplosmiddel onder verlaagde druk te verdampen en het methanolextract van Herba Cistanche werd verkregen met een opbrengst van 39% (w / w). Chemische analyse wees uit dat het methanol ex-tract van Herba Cistanche totale saponinen, totale flavonoïden, totale lignanen en polysacchariden bevatte in concentraties van respectievelijk 1,62% (w / w), 0,08%, 0,15% en 75,6%.

Dierenverzorging

Volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten (8-10 weken; 250-300 g) werden gehouden onder een 12-uurs donkere / lichte cyclus in een lucht / vochtigheid-gecontroleerde kamer bij ongeveer 22 ◦ C en lieten voedsel en water ad libitum toe in de animal care facilities bij HKUST. Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Research Practice Committee van HKUST.

Medicamenteuze behandeling

Dieren werden willekeurig verdeeld in groepen, met elk vijf tot zes dieren. In de behandelingsgroepen werden ratten intragastrisch toegediend met het methanolextract van Herba Cistanche (opgelost/gesuspendeerd in water) bij toenemende dagelijkse doses (0,031-0,5 g/kg) gedurende 3 dagen. Controledieren kregen alleen water. Vierentwintig uur na de laatste dosering werd het hart verkregen van fenobarbital-verdoofde dieren en onderworpen aan biochemische analyse.

Bereiding van mitochondriale fracties en meting van de ATP-opwekkingscapaciteit (ATP-GC) ex vivo

Monsters van linkerventrikelweefsel van het hart werden weggesneden en gespoeld met ijskoude isotone buffer (0,32 M sucrose, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Cardiale mitochondriale fracties werden bereid door differentiële centrifugatie in isotone buffer bij 4◦C. Een 10% (w /v) harthomogenaat werd bereid door het gehakte ventriculaire weefsel te homogeniseren met een teflonglashomogenisator bij 4000 tpm gedurende 20-30 volledige slagen. Het homogenaat werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 600 × g om kernen en celresten te verwijderen. Het supernatant werd vervolgens gecentrifugeerd bij 8000 × g gedurende 30 minuten om de mitochondriën te bezinken (Evan, 1992). De pellets werden geresuspendeerd in 1 ml van de isotone buffer en reconstitueerden de mitochondriale fracties. De mitochondriale ATP-GC van onbehandelde dieren werd gemeten met de methode van Leung et al. (2005)

Cistanche polysacchariden kunnen de fysiologische degeneratie van organen en de degeneratie van celmorfologie vertragen

Meting van mitochondriaal elektronentransport

De meting van elektronentransport in geïsoleerde mitochondriën, die is gebaseerd op de reductie van MTT, volgens [1] gevormd zoals beschreven door Cohen et al. (1997). Mitochondriën werden bereid bij een eiwitconcentratie van 1 mg/ml met een incubatiebuffer (250 mM sucrose, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4). Een aliquot (40 μL) van de mitochondriën werd gemengd met 100 μL elk van 15 mM pyruvaat of 0,5 mM succinaat en 0,42 mg / ml MTT. Het reactiemengsel werd geïncubeerd bij 37◦C gedurende 10 minuten met zacht schudden. Na de incubatie werd het reactiemengsel beëindigd door de toevoeging van 100 μL lysisbuffer (10%, w/v, natriumdodecylsulfaat en 45% dimethylformamide, aangepast tot pH 4,7 met ijsazijn). Na 5 minuten staan werden absorptiemetingen van het reactiemengsel gedaan met een microtiterplaatlezer (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) en gerapporteerd als het verschil tussen 570 nm en 630 nm. De gegevens werden uitgedrukt als een percentage van de gemiddelde waarde van de controlegroep (d.w.z. Herba Cistanche-onbehandeld).

Celkweek

H9c2-cellen, een permanente cellijn afgeleid van cardiale myoblasten (Hescheler et al., 1991), werden gekweekt als monolagen in DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS. Het medium bevatte glucose (4,5 g/l) en glutamine (4,5 mM), aangevuld met NaHCO3 (17 mM), penicilline (100 IE/ml) en streptomycine (100 μg/ml). Alle cellen werden gekweekt onder een atmosfeer van 5% (v/v) CO2 in lucht bij 37◦C. Het medium werd om de 2 of 3 dagen vervangen door een vers medium. Een voorraad cellen werd gekweekt in een kweekkolf van 75 cm2 en vóór samenvloeiing gesplitst in een subcultivatieverhouding van 1:10. Voor ATP-GC-assay werden H9c2-cellen gezaaid met een dichtheid van 2,5 × 104 cellen / goed in een 24-well plaat. Na de celaanhechting, Herba Cistanche extract (opgelost in fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PBS) werd toegepast in het medium en de cellen werden geïncubeerd gedurende toenemende perioden (2-16 uur) van de tijd. Controlecellen (onbehandeld) kregen alleen de PBS.

Meting van ATP-GC in situ

Na de aangegeven incubatieperioden met Herba Cistanche-extract in toenemende concentraties (50-300 μg/ml), werd de ATP-GC-test uitgevoerd. Het medium werd geaspireerd en cellen werden behandeld met digitonine (50 μg/ml) in een incubatiebuffer (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5% BSA, pH 7,4) gedurende 3 min bij 37◦C. Na het aanzuigen van de digitonine, glutamaat (5 mM), malaat (5 mM) en ADP (60 μM) werden toegevoegd aan de cellen voor mitochondriale ATP-generatie, die met toenemende tijdsintervallen werd gecontroleerd variërend van 0 tot 15 min. De reactie werd beëindigd door de toevoeging van 60 μL perchloorzuur (30 %, g/v), en de reactiemengsels werden vervolgens gecentrifugeerd bij 600 × g voor 10 min bij 4◦C. Een aliquot (120 μL) van het supernatant werd gemengd met 90 μL van 1,4 M KHCO3 voor neutralisatie. De mengsels werden opnieuw gecentrifugeerd bij 600 × g bij 4◦C, en de supernatanten werden gemeten voor ATP-inhoud als eerder beschreven. De ATP-GC van de onbehandelde cellen werd geschat door het gebied onder de curve van de grafiek te berekenen (AUC1) het uitzetten van gegenereerde ATP (nmol/mg eiwit) tegen tijd (0-15 min) en uitgedrukt in willekeurige eenheden. Voor Herba Cistanche-behandelde cellen, AUC1-waarden van toenemende incubatietijden (3, 5, 7, 10 en 15 min) werden genormaliseerd tot een respectieve gemiddelde controlewaarde van onbehandelde monsters en uitgedrukt als procentuele controle. Vervolgens wordt het gebied onder de curve (AUC2) van de grafiek die procentuele controlewaarden uitzet tegen incubatietijd (3-15 min) werd berekend en uitgedrukt in willekeurige eenheden. Gegevens van Herba Cistanche-behandeld groepen werden uitgedrukt als een percentage van de controle uit de vergelijking:

[AUC2(HerbaCistanche − behandeld)/AUC2(onbehandeld)] ×100%

Metingen van complex I-IV en citraatsynthase activiteiten

Mitochondriale elektronentransportketen (ETC) complex I– III-activiteiten werden gemeten met behulp van spectrofotometrische methoden met behulp van complexspecifieke substraten (NADH voor complexe I, succinaat voor complex II en decylubiquinol voor complex III) zoals beschreven (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al., 2005; Mark et al., 2001). Complex IV-activiteit werd gemeten met behulp van een cytochroom c oxidase assay kit van Sigma. Mitochondriale citraatsynthase-activiteit werd gemeten met behulp van de methode van Srere (1969).

Eiwit assay

Eiwitconcentraties van mitochondriale fracties en cellen lysaten werden bepaald met behulp van een BioRad-eiwittest kit met standaard runderserumalbumine (0,038-0,600 mg/ml).

Statistische analyse

Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde (SEM). Ze werden geanalyseerd door middel van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). Post hoc meerdere vergelijkingen waren gedaan met LSD. P-waarden<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Resultaten

Effecten van Herba Cistanche behandeling op myocardiale mitochondriale ATP-GC bij ratten

Zoals te zien is in figuur 1, verhoogde behandeling met Herba Cistanche-extract in doses tot 0,5 g/kg de myocardiale mitochondriale ATP-GC op een dosisafhankelijke manier bij ratten, met de stimulatiegraad is 89% bij een dosis van 0,5 g/kg.

Effecten van Herba Cistanche behandeling op mitochondriaal elektronentransport in rattenharten

De mate van elektronentransport in geïsoleerde mitochondriën werd gemeten door de reductie van MTT te monitoren. De substraat dat voor de test werd gebruikt, was pyruvaat of succinaat.

Figuur 1.Het effect van de behandeling met Herba Cistanche op de mitochondriale ATP-opwekkingscapaciteit in rattenharten ex vivo

Elke balk vertegenwoordigt de gemiddelde ± SEM, met n = 5. Dieren werden oraal behandeld met Herba Cistanche in de aangegeven dagelijkse doses gedurende 3 dagen. Atp-opwekkingscapaciteit werd gemeten zoals beschreven in 'Materialen en methoden'. Gegevens werden uitgedrukt in procentuele controle met betrekking tot waarden (AUC2) van de respectieve onbehandelde controlegroep. ∗Significaal anders van de respectieve onbehandelde controlegroep; aanzienlijk anders uit de met Herba Cistanche behandelde groep bij 0,5 g/kg.

Figuur 2. Effecten van Herba Cistanche behandeling op mitochondriaal elektronentransport in rattenharten

Elke balk vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM, met n = 5. a) Pyruvaat-ondersteund (b) succinaat-ondersteund mitochondriaal elektronentransport werd gemeten door MTT-reductie, zoals beschreven in 'Materialen en methoden'. De gegevens werden uitgedrukt in het percentage van onbehandelde controlewaarden [pyruvaat-ondersteund: OD570nm− OD630nm = 0,0206 ± 0,0001 (SEM), n = 5; Succinaat-ondersteund: mannelijk, 0,255 ± 0,015, n = 5]. ∗ Aanzienlijk anders dan de respectievelijke onbehandelde controlegroep; een significant verschil met een groep van 0,5 g/kg.

Zoals te zien is in figuur 2a, verhoogde de dosisafhankelijke behandeling met Herba Cistanche de mate van mitochondriaal elektron transport ondersteund door pyruvaat in rattenharten, met de optimale stimulatie waarneembaar bij doses van 0,5 g/kg. Echter, geen significante veranderingen in de mate van mitochondriale elektronentransport ondersteund door succinaat werden gedetecteerd in Herba Cistanche-behandelde rattenharten (fig. 2b).

Voor deel 2,klik hier.