Deel 1:Mapping The Epigenomic And Transcriptomic Interplay During Memory Formation And Recall in The Hippocampal Engram Ensemble
Mar 15, 2022
Voor meer information:ali.ma@wecistanche.com
Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*
1Picower Instituut voor Leren enGeheugen, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, VS.
2Departement of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, VS.
3Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, VS.
4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, VS.
5Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, Massachusetts, VS.
Klik omCistanche vitamine winkel en Cistanche voor het geheugen
Abstract
De epigenoom en driedimensionale (3D) -genomische architectuur komen naar voren als sleutelfactoren in de dynamische regulatie van verschillende transcriptionele programma's die nodig zijn voor neuronale functies. Hier gebruiken we een activiteitsafhankelijk taggingsysteem bij muizen om de epigenetische toestand, 3D-genoomarchitectuur en transcriptionele landschap van engramcellen gedurende de levensduur vangeheugenvorming en terugroepactie. Uit onze bevindingen blijkt datgeheugencodering leidt tot een epigenetische priminggebeurtenis, gekenmerkt door een verhoogde toegankelijkheid van versterkers zonder overeenkomstige transcriptionele veranderingen.Geheugenconsolidatie resulteert vervolgens in ruimtelijke reorganisatie van grote chromatinesegmenten en promotor-enhancer interacties. Ten slotte, met reactivering, maken engramneuronen gebruik van een subset van denovolong-range interacties, waarbij geprimeerde versterkers in contact werden gebracht met hun respectieve promotors om genen die betrokken zijn bij lokale eiwittransformatie in synaptische compartimenten te upreguleren. Gezamenlijk verduidelijkt ons werk de uitgebreide transcriptionele en gebruikers kunnen tekst bekijken, afdrukken, kopiëren en downloaden en de inhoud in dergelijke documenten dataminen, voor academisch onderzoek, altijd onderworpen aan de volledige voorwaarden van gebruik: http://www.nature.com/authors/editorial_policies/license.html#terms
*Correspondentie naar: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.
Bijdragen van de auteur:
A.M en L.-H.T. het project geconceptualiseerd en ontworpen. A.M en A.Z voerden gedragsexperimenten, ISH, immunostaining en MARIS-analyse uit. C.A voerde virusinjectie en immunostainings uit. A.M en H.S.M voerden ATAC-seq experimenten uit. A.M en A.Z voerden nucleaire RNA-seq experimenten uit. A.M, H.S.M en V.D voerden pc-Hi-C en Hi-C experimenten uit. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R en J.D.V. voerden ATAC-seq analyse uit. A.M, R.M.R, H.S.M, V.D en F.G voerden nucleaire RNA-seq analyse uit. A.M, V.D, H.S.M en R.M.R voerden pc-Hi-C en Hi-C analyse uit. Alle auteurs hielpen bij het interpreteren van de gegevens. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R, J.Z.Y, M.K en L.H.T schreven het manuscript met input van alle auteurs. L.H.T. leverde de tools en begeleidde het project.
Tegenstrijdige belangen:
Auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
het epigenomische landschap gedurende de levensduur vangeheugenvorming en herinnering in het hippocampale engram ensemble.
De vorming en het behoud van langetermijngeheugens zijn afhankelijk van gecoördineerde genexpressie en synthese van synaptische eiwitten1. Deze moleculaire processen werken binnen een specifieke populatie van neuronen, aangeduid als engramcellen2-4. Recente benaderingen met behulp van activiteitsafhankelijke expressie van verslaggevers boden een kader voor het verkennen van het engram ensemble5-8, maar de moleculaire mechanismen die bepalend zijn voorgeheugenopslag en ophalen blijven slecht begrepen. In het bijzonder komen epigenetische modificaties en 3D-genomische architectuur naar voren als een sleutelfactor in de dynamische regulatie van genexpressie9-17, en er is een toenemende waardering voor hun belang in neuronale functie, ontwikkeling en ziekte14, 16, 18
Hier gebruikten we het Targeted Recombination in Active Populations (TRAP) muismodel5,6, waarin geactiveerde neuronen die het Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein, (Arc) gen, tot expressie brengen, permanent worden gelabeld op een induceerbare manier. Geactiveerde neuronen tijdensgeheugencodering, consolidatie en recall werden gesorteerd en onderworpen aan nucleaire RNA-sequencing (nRNA-seq), Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq) en chromosome conformation capture (Hi-C). Onze gegevens tonen aan datgeheugencodering leidt tot een genoombrede toename van de toegankelijkheid van chromatine, zonder verwachte veranderingen in genexpressie. Verder tonen we aan dat de late fase van geheugenconsolidatie geassocieerd was met de herlokalisatie van grote chromatinesegmenten (subcompartimenten) van inactieve naar permissieve omgevingen, en de reorganisatie van het promotor-enhancer interactielandschap. Ten slotte, reactivering van de neuronen tijdensgeheugenrecall is geassocieerd met denovopromoter-enhancer interacties, waarbij gebruik wordt gemaakt van een grote subset van de enhancers die werden geprimed tijdensgeheugencodering. Deze promotor-enhancer interacties zijn geassocieerd met een robuuste verandering in de expressie van genen die betrokken zijn bij lokale eiwitsynthese en synaptische morfogenese.
Resultaten
Temporele en ruimtelijke identificatie van geactiveerde en gereactiveerde engramcellen
Het volgen van neuronale activiteit in de loop van de tijd is een van de grootste uitdagingen geweest bij het bestuderen van engramcellen, omdat de markers voor neuronale activiteit, bekend als onmiddellijke vroege genen (IEG's), kort na inductie terugkeren naar de basislijn1,2. Om deze beperking te overwinnen, maakten we gebruik van het TRAP5,6-model, dat twee transgenen vereist, één die CreERT2 uitdrukt van een activiteitsafhankelijke Arc-promotor en één die expressie van het gele fluorescerende eiwit (eYFP) reporter mogelijk maakt, op een Cre-afhankelijke manier. Toediening van tamoxifen (TAM) aan de TRAP-muizen resulteert in een permanent eYFP-label in de geactiveerde Arc-neuronen. Zonder TAM wordt CreERT2 in het cytoplasma bewaard en wordt eYFP niet tot expressie gebracht (Extended Data Fig. 1a). TRAP-muizen werden onderworpen aan het klassieke Pavloviaanse contextuele angstconditioneringsparadigma (CFK) (fig. 1a), een veelgebruikte methode om aversieve herinneringen te bestuderen19. Ongeveer 1,5-2 uur na blootstelling aan FS werden hersenen verzameld om i) RNA-bindend eiwit fox-1 homoloog 3 (Rbfox3) ook bekend als NeuN + en eYFP + gelabelde neuronen te identificeren die werden geactiveerd tijdens de initiële blootstelling (geactiveerd-vroeg), die kan worden onderscheiden van ii) NeuN + / eYFP- niet-geactiveerde basale toestand neuronen (Basaal) (Fig. 1a). Na vijf dagen, bij gebrek aan ophalen, verzamelden we iii) NeuN + / eYFP + -neuronen die op de trainingsdag werden getagd, wat duidt op lange termijngeheugenconsolidatie (Geactiveerd-laat). In een
verschillende cohorten, werden muizen opnieuw blootgesteld aan de geconditioneerde stimulus en de daaropvolgende endogene ARC-eiwitexpressie werd 1,5-2 uur na herblootstelling getest. Dit maakte de identificatie mogelijk van iv) dubbelpositieve NeuN+/eYFP+/ endogene Arc+ engramneuronen die tijdens de training werden geactiveerd en gereactiveerd tijdensgeheugenrecall (gereactiveerd). Met name, hoewel DNA-recombinatie mogelijk niet volledig 1,5-2 uur na de FS optreedt, zagen we een hoge co-lokalisatie (gemiddeld 84%) tussen endogene Arc-eiwit en de Arc: eYFP-reporter (Extended Data Fig. 1b), wat ook consistent was met eerdere rapporten20.
Ter bevestiginggeheugencodering en recall tijdens CFC, bevriezingsgedrag werd geregistreerd tijdens training en hernieuwde blootstelling aan angstopwekkende signalen (Extended Data Fig. 1c). In overeenstemming met de vorige publicaties6,20 toonden onze gegevens een significante toename van het aantal eYFP+ (Geactiveerd-vroege en -late) neuronen in de hippocampus, vergeleken met muizen die naïef bleven voor CFK in hun thuiskooi (F (2, 70) = 240,3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">
Geheugenvorming wordt geassocieerd met een verhoogde toegankelijkheid van chromatine, voornamelijk op versterkers
Om de moleculaire krachten die verschillende transcriptionele programma's beheersen beter te begrijpen, hebben we genoombrede veranderingen van chromatinetoegankelijkheid gemeten in verschillende fasen vangeheugen. Hippocampusweefsels werden gepoold en geïsoleerde kernen (Extended Data Fig. 2a, Aanvullende Tabel 1) werden onderworpen aan ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding. Differentieel toegankelijke regio's (DARs) analyse (Diffbind, DESeq2-modus) tussen alle populaties (Fig. 2a) onthulde dat de meeste veranderingen in chromatinetoestand optreden tijdens de vroege fase van geheugenvorming, waar 7.862 regio's in het genoom toegankelijkheid krijgen (Basaal versus vroeg, aanvullende tabel 2). Daarentegen zagen we relatief minimale veranderingen in de chromatinetoestand bij de overgang van geactiveerd-vroeg naar geactiveerd-laat (582 DARs) en tussen geactiveerd-late en gereactiveerde neuronen (725 DARs), met 48% overlap tussen hen (Extended Data Fig. 2b). Opmerkelijk genoeg identificeerden we een groot percentage (52%) stabiel verkregen DARs die toegankelijker werden in Activated-early en toegankelijk bleven in zowel de Activated-late als Reactivated neuronen (Fig. 2b,c; Aanvullende tabel 2). Interessant is dat terwijl zowel vroege veranderingen (Basaal versus vroeg) als stabiel verkregen DAR's werden verrijkt voor intergene regio's, late chromatineveranderingen (vroeg versus laat en laat versus gereactiveerd) meestal werden verrijkt voor promotorsites (fig. 2d).
Functioneel inzicht werd verkregen door te beoordelen hoe DARs worden gekenmerkt door verschillende histonmodificaties. We gebruikten ChromHMM eerst om een chromatinetoestandsmodel vast te stellen uit twee onafhankelijke studies die bulk hippocampusweefsel gebruikten voor en na voetschok 21,22. Vervolgens voerden we een vouwverrijkingsanalyse uit (waargenomen over verwachte verdeling) van de DARs voor deze verschillende toestanden en onthulden dat vroege chromatineveranderingen en stabiele DARs werden verrijkt voor enhancersmarkeringen (Fig. 2e; Uitgebreide gegevens Fig. 2c, Aanvullende tabel 3).
Deze resultaten zijn in lijn met eerdere publicaties, waaruit blijkt dat het stimuleren van primaire neuronale cultuur langdurige enhancer-activiteit induceert12,23. Vervolgens analyseerden we de overlap van individuele stabiele loci met de H3K4me1 en H3K27ac21. Deze twee histonmarkeringen bakenen verschillende populaties van versterkers af, die ofwel 'geprimed' (alleen H3K4me1), 'actief' (H3K4me1 en H3K27ac) of 'latent' (geen markeringen) kunnen zijn18. Stabiele pieken toonden een verdeling over zowel geprimeerde als actieve versterkers (Extended Data Fig. 2d), waarbij 47% van deze sites werd voorspeld 'latent' te zijn (geen overlap tussen DARs en histon marks21 verkregen 1h na FS). Om ons model te bevestigen, voerden we chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) uit voor H3K4me1- en H3K27ac-histonmarkers, gevolgd door qPCR. Vier geselecteerde locaties werden gekozen uit onze vermeende enhancer modelleringsanalyse (Extended Data Fig. 2d; Enhancer 1 – voorspeld geprimed, Enhancer 2- voorspeld Active, Enhancer 3 en 4 – voorspelde latent). In overeenstemming met ons model identificeerden we twee 'latente' loci in de basale toestand (Enhancers 3 en 4) die transformeerden naar een 'actieve' toestand tijdensgeheugenformatie (fig. 2f). Bovendien bleek de vermeende versterker 1 'geprimed' te zijn in de basale toestand en werd actief, waar er een significante stabiele toename was van H3K27ac-markers tijdens de late fase en recall (fig. 2f). Samen geven deze gegevens aan dat het repertoire van nieuw toegankelijke versterkers werd uitgebreid in de gepotentieerde engramneuronen, waar latente of geprimeerde regio's H3K4me1- en H3K27ac-markeringen kregen en dus actieve versterkers werden.
Om de functionele rol van toegankelijke promotors en versterkerregio's te begrijpen, hebben we een motiefverrijkingsanalyse uitgevoerd (aanvullende tabel 4). Onze gegevens geven aan dat de meerderheid (70%) van de motieven op toegankelijke promotors even verrijkt zijn en werden geïdentificeerd in alle fasen vangeheugen(Uitgebreide gegevens Fig. 2e). Daarentegen vertoonden de meeste versterkersites verschillende patronen van transcriptiefactor (TF) -bindende motieven in verschillende geheugenfasen. Interessant is dat de alomtegenwoordig uitgedrukte motieven uit het Jun Proto-Oncogen, Ap-1 Transcription Factor Subunit (d.w.z. Jun-Ap1) en de Regulatory Factor X (Rfx) familie van TF's, pas na de beginfase van codering aanzienlijk werden verrijkt (Extended Data Fig. 2e). Eerder werd gemeld dat het Jun-Ap1-complex een centrale rol speelt bij de selectie van enhancers en kan fungeren als een pionier TF om versterkerplaatsen te definiëren tijdens de ontwikkeling van de hersenen en neuronale activiteit12,24. Deze bevindingen komen overeen met onze gegevens die een hoog percentage latente/geprimeerde loci in de basale toestand lieten zien (Fig. 2f, Extended Data Fig. 2c,d). Daarom lijkt het erop dat neuronale activiteit de binding van Jun-Ap1 aan latente versterkers kan veroorzaken, die vervolgens chromatinemodificatoren rekruteert die latente versterkers activeren. Evenzo suggereert de verrijking van de transcriptiefactor Yin Yang 1 (Yy1) motieven alleen in versterkers uit de vroege en late toestand, dat promotor-versterkerorganisatie een actief proces is vangeheugenvorming, omdat onlangs werd gemeld dat Yy1 de vorming van deze langeafstandsinteracties vergemakkelijkt25. Gezamenlijk suggereren deze gegevens dat de beginfase vangeheugenformatie verandert het chromatine-toegankelijkheidslandschap in geactiveerde neuronen, waarbij langdurige stabiele veranderingen voornamelijk optreden binnen enhancergebieden.
Dynamische veranderingen in ruimtelijke nucleaire architectuur en chromatinetoegankelijkheid tijdens initiëlegeheugenvorming correspondeert met verhoogde promotor-enhancer interacties frequentie tijdensgeheugenherinneren
Nucleaire 3D-architectuur is in opkomst als een sleutelfactor in de dynamische regulatie van genexpressie, in veel neuronale functies26-28. Daarom waren we geïnteresseerd in het afbakenen van de precieze veranderingen die optreden in de ruimtelijke chromatineorganisatie tijdensgeheugenvorming en consolidatie. We produceerden Hi-C-gegevens van basale toestand en eYFP + gelabelde neuronen (vroeg en -laat, aanvullende tabel 5). Chromatine is gescheiden in twee ruimtelijk verschillende subkerncompartimenten, 'A' en 'B', overeenkomend met het transcriptioneel actieve en inactieve chromatine, respectievelijk15, 16,26. Vroeg bewijs suggereert dat neuronale activiteit en extrinsieke signalering een reorganisatie van 3D-chromatine-architectuur kunnen veroorzaken14,27,28. Onze compartimenttoestandanalyse15, 16,26 (fig. 3a-c) onthulde herlokalisatie van grote chromatinesegmenten van inactief (B) naar de permissieve omgeving (A) (en vice versa) tijdens de begin- en late fase vangeheugenformatie (212 segmenten overgeschakeld van A naar B, 127 van B naar A, gemiddelde grootte van ~436Kbp). Interessant is dat 52% van de regio's in de vroege fase die van B naar A overschakelden, die toestand in de late fase handhaafden (d.w.z. in toestand A bleven, fig. 3b,c; Aanvullende tabel 6). Bovendien overlapten bijna al deze regio's met verkregen DAR's uit onze ATAC-seq-analyse, wat de overgang van subcompartiment van inactieve naar de permissieve omgeving bevestigde (fig.3d). Deze gegevens geven aan dat sommige loci subcompartimentwisselingen ondergaan in verschillende geheugenfasen en daarom kunnen bijdragen aan langetermijnveranderingen in neuronale eigenschappen en functie na de eerste activering.
Hoewel onze Hi-C-gegevens grootschalige reorganisatie suggereerden, bleef het onduidelijk of deze heroriëntatie de interactie van nieuwe promotor-enhancerrepertoires en de fine-tuning van verschillende transcriptionele programma's mogelijk maakte (Fig. 3e). Door gebruik te maken van de promoter-capture Hi-C (pc-HiC) techniek, bestudeerden we de precieze veranderingen die optreden in promotor-enhancers interacties tijdens het proces vangeheugenvorming en terugroepactie. Voor deze studie gebruikten we op maat ontworpen "lokaas" gericht op ~ 5000 promotors29. In overeenstemming met eerdere publicaties29 ontdekten we ~19.000 (per groep) significante promotors-versterkers (67,5%) en promotors-promotors (46,2%) interacties (Extended Data Fig. 3a,b).
Omdat promotors in het zoogdierbrein onder controle konden staan van meerdere regulerende elementen14,30,31, analyseerden we de overlap tussen alle interagerende versterkers en hun respectieve promotors. We hebben ontdekt dat tijdens elkegeheugenfase, dezelfde promotors interageren vaker met een verschillende subset van versterkers (d.w.z. uniek, Basaal - 3243, Vroeg - 7602, Laat - 7028, Gereactiveerd - 7244; Fig. 4a, b; Uitgebreide gegevens Fig. 3c; Aanvullende tabel 7). Dit resultaat komt overeen met eerdere publicaties waaruit blijkt dat meerdere versterkers rond verschillende genen (c-Fos en Arc) cruciaal zijn voor hun activering en dat hun interactiefrequentie met hun respectieve promotors wordt gewijzigd als reactie op verschillende depolariserende middelen in gekweekte neuronen31. We identificeerden ook een kleinere subset van interacties waarin de promotors interactie hadden met dezelfde versterkers over verschillendegeheugenfasen (d.w.z. gemeenschappelijk, ~ 31% van alle interacties; Aanvullende tabel 7). Bovendien vertoonden gereactiveerde neuronen significant sterkere interactiescores (zoals berekend door Chicago, Fig. 4b; Uitgebreide gegevens fig.3d). Hoewel het aantal unieke interacties vergelijkbaar was in vroege, late en gereactiveerde toestanden, geven sterkere interactiescores aan dat specifieke promotor-versterkerinteracties vaker voorkomen tijdens het geheugen
herinneren. Dit idee werd verder gevalideerd door 3C-experimenten, met primers die zijn ontworpen om de frequentie van interactie te meten tussen geselecteerde enhancer (E) en genpromotors (P) die coderen voor eukaryote translatie-initiatiefactor 3 subeenheid D (Eif3d) of glutamaatreceptor, ionotroop, kaïnaat 3 (Grik3) (Fig. 4c). Onze gegevens toonden aan dat gereactiveerde neuronen een significante toename hadden in de interactiefrequentie tussen de Eif3d-promotor en de geselecteerde versterker, in vergelijking met de andere populaties (fig. 4c). Gezamenlijk geven deze gegevens aan dat promotor-versterker interacties vaker voorkomen tijdensgeheugenherinneren.
Vervolgens vroegen we of de dynamische langeafstandsinteracties geïdentificeerd via pc-HiC overeenkomen met chromatinegebieden die toegankelijker worden, zoals bepaald via ATAC-seq. Dit zou bevestigen dat de toegenomen toegankelijkheid een functioneel gevolg heeft bij het tot stand brengen van nieuwe promotor-versterkerinteracties. Om dit te bereiken, vergeleken we de overlap tussen interacterende versterkers in elke celpopulatie met DARs (waargenomen) of een willekeurige set toegankelijke genomische loci (verwacht). Onze analyse onthulde een significante overlap tussen zowel verworven DARs in geactiveerde vroege neuronen en stabiel verkregen DARs met de interagerende versterkers, in alle celpopulaties (Alle Ps< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e).="" in="" contrast,="" changes="" in="" chromatin="" accessibility="" that="" occurred="" during="" the="" late="" phase="" of="">geheugenconsolidatie en reactivering overlapten niet significant met interacterende versterkers (Extended Data Fig. 3e). Samen geven deze resultaten aan dat de toename van toegankelijkheid tijdens geheugencodering een priming-gebeurtenis is en dat deze geprimeerde loci zich bezighouden met de-novo functionele promotor-enhancer-interacties tijdens latere fasen vangeheugenvorming. Dit dynamische landschap wordt geïllustreerd door de genomische regio's rond het gen eukaryote translatie-initiatiefactor 5 subeenheid A (Eif5a) te visualiseren (fig. 4d). Deze temporele moleculaire dissectie van de levensduur van het engram benadrukt hoe gecoördineerde priming van de epigenetische toestand van een cel tijdensgeheugencodering en consolidatie vergemakkelijkt interacties op lange afstand tijdens reactivering.
