Deel 1 Preventieve effecten van fenylethanolglycosiden van cistanche tubulosa op door runderserumalbumine geïnduceerde leverfibrose bij ratten

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstract

Achtergrond:Cistanche tubulosa is een traditioneel Chinees kruidengeneesmiddel dat veel wordt gebruikt voor het reguleren van de immuniteit.Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche(CPhG's) van deze plant zijn de voornamelijk werkzame materialen. Het doel van deze studie was om de preventieve en therapeutische effecten van CPhG's op door BSA geïnduceerde leverfibrose bij ratten en gerelateerde moleculaire mechanismen met hepatische stellaatcellen te evalueren. Biejiarangan (BJRG), een ander traditioneel Chinees kruidengeneesmiddel, werd als positieve controle gebruikt. Methoden: In in vivo experimenten werden 75 SD-ratten willekeurig verdeeld in 6 groepen: normaal (behandeld met gedestilleerd water), model (BSA-behandeld), positief medicijn (BSA-behandeld plus BJRG 60{{29} } mg/kg/dag), en BSA-behandelde plus CPhGs (125, 250 en 500 mg/kg/dag) groepen. De lever- en miltindexen, serumspiegels van aspartaataminotransferase (AST), alanineaminotransferase (ALT), hexadeceenzuur (HA), laminine (LN), type III procollageen (PCIII), type IV collageen (IV-C), hydroxyproline ( Hyp) en transformerende groeifactor 1 (TGF- 1) werden gemeten in rattenlevers. Histopathologische graden voor leverfibrose werden voor elke groep beoordeeld met behulp van H & E en Masson's trichroomkleuring. De expressie van TGF- 1, collageen I (Col-I) en collageen III (Col-III) werd bepaald met een immunohistochemische kleuringsmethode. Deze effecten werden in vitro verder geëvalueerd door de expressieniveaus van NF-KB p65 en Col-I te bepalen door kwantitatieve real-time PCR-analyses. Col-I-eiwitexpressie werd ook onderzocht door western blotting. Resultaten: Alle dosisgroepen (125, 250 en 500 mg/kg/dag) CPhG's verlaagden significant de lever- en miltindex, verlaagden de ALT-, AST-, HA-, LN-, PCIII-, IV-C-serumspiegels, TGF- 1-gehalte (P <0,01, p=""><0,01 en="" p=""><0,01), en="" hyp-gehalte.="" cphg's="" verlichtten="" ook="" duidelijk="" de="" zwelling="" van="" levercellen="" en="" voorkwamen="" effectief="" hepatocytnecrose="" en="" infiltratie="" van="" ontstekingscellen.="" immunohistochemische="" resultaten="" toonden="" aan="" dat="" cphg's="" de="" expressie="" van="" tgf-="" 1="" (p=""><0,01, p=""><0,01 en="" p=""><0,01), col-i="" en="" col-iii="" significant="" verminderden.="" de="" in="" vitro="" effecten="" van="" cphg's="" (100,="" 75,="" 50="" en="" 25="" ug/ml)="" op="" hsc-t6="" toonden="" aan="" dat="" cphg's="" de="" mrna-expressie="" van="" nf-kb="" p65="" en="" col-i="" significant="" verminderden,="" en="" cphg's="" verlaagden="" ook="" de="" col-i-eiwitexpressie.="" conclusies:="" cphg's="" hebben="" een="" significant="" anti-leverfibrose-effect="" en="" kunnen="" worden="" gebruikt="" als="" hepatoprotectieve="" middelen="" voor="" de="" behandeling="" van="">

Trefwoorden: Leverfibrose, Cistanche tubulosa, Fenylethanolglycoside, Chemokine BSA, Preventie en therapie.

Achtergrond

Leverfibrose is een wondgenezingsreactie op ernstige leverbeschadiging die optreedt bij de pathogenese van chronische hepatitis veroorzaakt door verschillende factoren. Deze factoren zijn virale infectie, alcoholmisbruik, cholestase en metabole en auto-immuunziekten [1-3]. Progressieve accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) en verminderde hermodellering verstoren de normale architectuur van de lever, wat resulteert in leverfibrose [4]. Leverfibrose is van cruciaal belang bij chronische leverziekte en ontwikkelt zich vaak tot onomkeerbare cirrose en carcinogenese. Op dit moment zijn er geen methoden of effectieve medicijnen voor de behandeling van leverfibrose. Daarom is het dringend nodig om een ​​geneesmiddel tegen leverfibrose te vinden dat de progressie van leverbeschadiging tot fibrose en kanker zal afzwakken.Cistanche tubulosaW (van de familie Orobanchaceae) is een parasitaire plant die veel wordt gekweekt in de zuidelijke regio van Xinjiang in China [5]. Mensen gebruiken het meestal om de nieren te stimuleren, het bloed te voeden, de darm te ontspannen en veroudering te vertragen. Het staat officieel vermeld in de Chinese Farmacopee [6]. C. tubulosa bevat een verscheidenheid aan actieve componenten. WaaronderFenyl-ethanolglycosiden uit cistanche(CPhG's), iridoïden en polysachariden. Als een van de vele actieve componenten inC. tubulosaCPhG's hebben overtuigende antioxiderende, antivermoeidheids-, neuroprotectieve en ontstekingsremmende effecten vertoond in zowel in vivo als in vitro studies [7]. In de afgelopen jaren is gemeld dat CPhG's (Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche) hepatoprotectieve effecten hebben. Mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan deze effecten zijn het wegvangen van vrije radicalen, bescherming van levermembranen, immunoregulatie, remming van apoptose, remming van de expressie van HBsAg en HBeAg en remming van HBV-DNA-replicatie en andere [8-11]. Er zijn echter maar weinig studies in de literatuur die het anti-hepatische fibrose-effect van afbeeldingen behandelen. Daarom was deze studie gericht op het onderzoeken van het anti-hepatische fibrose-effect van GPhC's door gebruik te maken van een model van door runderserumalbumine (BSA) geïnduceerde leverfibrose bij ratten. Gerelateerde moleculaire mechanismen werden onderzocht in HSC-T6-cellen.

Methoden:

Chemicaliën en reagentia

Een Hydroxyproline-kit (alkalische hydrolyse) (Lot: 20140616) werd gekocht bij Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China). Rat TGF- 1 sandwich ELISA-kits (lot: 238240615) werden gekocht bij Lianke Biotech Co., Ltd. (China). Anti-collageen I-antilichaam van konijnen (lot: 140619), antilichaam van konijnen-anti-collageen III (lot: 980788 W) en antilichaam van konijnen-anti-TGF- 1 (lot: 140619) werden geleverd door Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (China). Ingesloten met normaal schapenserum (werkvloeistof) (kavel: WP141214), PV-6000 (kavel: WK141225) en DAB-kit (kavel: K136621D) werden gekocht bij Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (China) . Detectie van primaire antilichamen werd uitgevoerd met behulp van 2. Antilichaamoplossing (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) en 2. Antilichaamoplossing (Alk-Phos. Conjugated, Anti-muis) (lot: 272387) gekocht bij Invitrogen Company (VS ). Runderserumalbumine (BSA) (partij: SLBG8239V) werd gekocht bij Sigma (VS). Voor gebruik werd BSA bereid bij 18 g/L in normale zoutoplossing, de bacteriën verwijderd door filtratie en BSA bewaard bij 4°C. Freund's onvolledige adjuvans met 1 g lipide uit schapenhaar (partij: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (China)) werd gemengd met 2 g vloeibare paraffine (partij: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (China), gesteriliseerd in een stoomautoclaaf en bewaard bij 4°C. Het positieve geneesmiddel BJRG werd verkregen als Biejiarangan-tabletten van Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (China). BJRG-geneesmiddelvoorraden werden bereid door oplossen BJRG-tabletten in gedestilleerd water met een concentratie van 600 mg/kg.

Plant materialen

C. tubulosa(Orobanchaceae-familie) werd gekocht in de Minfeng-regio van Xinjiang in China. Het materiaal is geverifieerd door onderzoeker Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica van Xinjiang. Voucherspecimens werden gedeponeerd in het Institute of Materia Medica van Xinjiang.

Bereiding van CPhG's(Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche)

Gedroogde en gesneden wortelstokken vanC. tubulosa(6,0 kg) werden achtereenvolgens driemaal onder terugvloeikoeling geëxtraheerd met 70 procent ethanol en het oplosmiddel werd verwijderd om het ethanolextract op te leveren. Ethanolextracten werden gezuiverd met behulp van AB-8-hars om de fenylethanolglycosiden (CPhG's) te verkrijgen. Voorraadoplossingen van CPhG's die voor verschillende dosisgroepen in dierstudies werden gebruikt (respectievelijk 500 mg/kg, 250 mg/kg en 125 mg/kg) werden opgelost in 0,5 procent (5 g/L) carboxymethylcellulose (natriumzout).

Kwantificering van CPhG's(Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche)

De inhoud van twee componenten (echinacoside en acteoside) in de CPhG's werd bepaald door HPLC met behulp van een eerder gerapporteerde methode (Zhang et al. 2004) [12]. HPLC werd uitgevoerd met behulp van een Shimadzu LC-10A HPLC uitgerust met een UV-detector. De HPLC-kolom was een Phenomenex Gemini ODS-kolom (250 x 4,6 mm, 5 m). De isocratische mobiele fase bestond uit methanol-acetonitril-1 procent azijnzuur (15:10:75, v/v/v). Elutie was gedurende 40 minuten en de stroomsnelheid werd op 0,6 ml/min gehouden. De kolomtemperatuur werd constant op 30 graden gehouden. UV-detectie was bij 334 nm.

Dieren en HSC-T6-cellijn

[Grade SPF] gezonde volwassen mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten (180-220 g) werden gekocht bij Xinjiang Medical University Animal Center, licentienummer: SCXK (New) 2011-0004. Ratten kregen specifiek pathogeenvrij (SPF) voer. Alle procedures met betrekking tot de dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het First Affiliated Hospital van de Xinjiang Medical University. Ratten werden gehuisvest in kooien onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (25 graden en een licht/donkercyclus van 12 uur) en hadden vrije toegang tot standaard rattenvoer en kraanwater. Ratten werden voor de behandeling geacclimatiseerd. Een onsterfelijk gemaakte rattenleverstellaatcellijn, HSC-T6, werd verkregen van Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, China). HSC-T6-cellen werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (High Glucose) (DMEM, Beijing, China) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum (Gibco, Zuid-Amerika), 100 IE/ml penicilline en 100 ug/ml streptomycine (Beijing , China) in een bevochtigde incubator op 37 graden met 5 procent CO2.

BSA-geïnduceerde leverbeschadiging en behandelingen

Vijfenzeventig SD-ratten werden willekeurig verdeeld in zes groepen: normaal (behandeld met gedestilleerd water), model (BSA-behandeld), positief geneesmiddel (BSA-behandeld plus BJRG 600 mg/kg/dag) en BSA-behandeld plus CPhG's(Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/dag) groepen. Met BSA behandelde plus CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/dag) groepen hadden 13 ratten in elke groep, en de andere groep had 12 ratten in elke groep. Het BSA-geïnduceerde leverbeschadigingsmodel is onderverdeeld in primaire sensibilisatie gevolgd door een immunologische aanval) [13]. Behalve de normale groep kregen de andere groepen meerdere subcutane injecties toegediend met 0,5 ml (9 mg/ml) BSA Freund's onvolledige adjuvans op dag 1, dag 15, dag 22, dag 29 en dag 36 voor primaire sensibilisatie. Zeven dagen na de vijfde injectie werd bloed verkregen via de plexus van de retinale ader van de rat en getest op serumalbumine-antilichamen. BSA-antilichaam in rattenserum werd gedetecteerd met een dubbele agardiffusiemethode. De aanvalsinjectie werd uitgevoerd door toediening van 0,4 ml BSA in normale zoutoplossing via de staartader in BSA-antilichaam-positieve ratten tweemaal per week gedurende tien keer. De concentraties en tijdstippen van injecties waren 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 en 10.00 g/L op respectievelijk dag 46, dag 50, dag 53, dag 57, dag 60, dag 64, dag 67, dag71, dag 74 en dag 78. In de normale groep werd normale zoutoplossing gebruikt voor immunologische primaire (sensibilisatie) en secundaire (aanval) injecties in plaats van BSA, en andere aandoeningen waren dezelfde als die in de modelgroep. De normale groep kreeg oraal gedestilleerd water toegediend met een dosis van 10 ml/kg/dag. De modelgroep kreeg oraal 10 ml/kg/dag 0,5 procent CMC-Na-oplossing toegediend. De positieve geneesmiddelgroep kreeg oraal 600 mg/kg/dag BJRG toegediend. De met BSA behandelde plus CPhG's (125,

250 en 500 mg/kg/dag) kregen oraal 125, 250 en 500 mg/kg/dag CPhG's toegediend(Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche), respectievelijk. De dagelijkse dosering van ratten werd twee weken na de laatste injectie voortgezet. Na de experimentele periode werden ratten 12 uur gevast voorafgaand aan 10% chloraalhydraat en vervolgens onmiddellijk geëuthanaseerd. Serummonsters werden van elke rat verzameld en onmiddellijk gebruikt. Levers werden voor twee doeleinden geoogst: (1) conservering in vloeibare stikstof voor Hyp-kits en (2) fixatie in 10 procent formaldehyde voor histologisch en immunohistochemisch onderzoek. De totale duur van de dierstudies was 93 dagen.

Lever- en miltindexen

De lever en milt werden door middel van laparotomie ontleed en gewassen met 4 graden normale zoutoplossing. Na het absorberen van overtollig water met filtreerpapier, werden de lever en de milt gewogen om de overeenkomstige indices te berekenen: Relatief orgaangewicht=orgaanmassa (g)/individuele lichaamsmassa (g) × 100 procent [14].

cel experimenten

HSC-T6-cellen werden uitgeplaat in een 96-well-plaat. Aanvankelijk werden cellen 48 uur gekweekt met DMEM dat 10 procent FBS bevatte. Het medium werd vervolgens vervangen door DMEM zonder FBS om de cellen gedurende 12 uur uit te hongeren. De cellen werden vervolgens 24 uur gekweekt met DMEM dat 5,0 ng/ml TGF- 1 (zonder FBS) bevatte. Ten slotte zijn er verschillende concentraties van CPhGs(Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml en 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml en 1,5 ug/ml) en echinacoside (500 ug/ml, 250 ug/ml en 125 ug/ml) werden in viervoudige putjes op de plaat uitgevoerd en 48 uur geïncubeerd.

Realtime PCR-analyse

Het mRNA-expressieniveau van NF-KB, p65 en collageen I werd bepaald door real-time PCR. Om mRNA-expressies in HSC-T6-cellen te bepalen, werden de cellen (4 x 105 cellen) gezaaid in platen met zes putjes met 3 ml DMEM met 10 procent FBS en een nacht geïncubeerd bij 37 graden en 5 procent CO2, waarna de celkweekmedia werden veranderd in serumvrij DMEM. Volgende, CPhGs(Fenyl-ethanolglycosiden uit cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml en 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml en 1,5 ug/ml) en echinacoside (500 ug/ml , 250 ug/ml en 125 ug/ml) werden aan de putjes toegevoegd. Na 48 uur incubatie met CPhG's of monomere samenstellingen, werd totaal RNA geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens (Invitrogen, VS) en krachtig geschud met chloroform gedurende 15 seconden. Na 3 minuten bij kamertemperatuur te hebben gezeten, werd het lysaat gedurende 15 minuten bij 12, 000 x g bij 4 graden gecentrifugeerd. RNA in de waterige fase werd geprecipiteerd met isopropanol en de bovenste waterige fase werd overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis. RNA werd geprecipiteerd door 0,75 procent ethanol toe te voegen, waarna de microcentrifugebuis werd gecentrifugeerd bij 12,{20}} x g bij 4 graden gedurende niet meer dan 5 minuten. Het supernatant werd verwijderd en het RNA werd 5-10 minuten bij kamertemperatuur gedroogd. Specifieke sets primers (Sangon, Shanghai, China) die werden gebruikt voor amplificatie van rat-actine [GenBank: NM_031144.3], collageen I [GenBank: NM_ 053304.1] en NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] genen werden ontworpen met behulp van Batch Primer 3. De forward (fw) en reverse (rv) primers waren als volgt: Collageen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actine (vw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Resultaten werden genormaliseerd naar het mRNA van het huishoudgen-actine als een interne controle en worden gepresenteerd als relatieve mRNA-niveaus. Reacties werden uitgevoerd met 8 L iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM primerpaar, 8,5 L gedestilleerd water en 2, 5 μL cDNA. Elke polymerasekettingreactie werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: 95 graden gedurende 3 minuten, daarna 40 cycli van 10 sec. bij 95 graden, 30 sec. bij 55 graden en 10 sec. bij 55 graden - 95 graden voor verlenging, gevolgd door enkele fluorescentiemeting . De eindresultaten werden beschreven met de relatieve waarden (2-ΔΔCt). Berekening en analyse werden uitgevoerd door het iQ5 Real-Time PCR-detectiesysteem.

Western-blot-analyse

Collageen I (Abcam, Cambridge, VK, Art No: ab34710) eiwitexpressieniveaus werden bepaald door Western blotting [met -actine (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, China) als huishoudelijke controle. Hele celextracten werden bereid met behulp van Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (Thermo Scientific, VS) buffer met 1 procent Halt-proteaseremmercocktail (Thermo Scientific, VS) en 1 procent Halt-fosfataseremmercocktails (Thermo Scientific, VS). De eiwitconcentratie werd gemeten en gekwantificeerd met de Bradford-methode [18]. Eiwit (10-50 ug) werd gescheiden op een 10% SDS-PAGE-gel en overgebracht naar PVDF-membranen (Millipore, VS). Membranen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% BSA en de primaire antilichamen (Anti-Colla gen I antilichaam, 1:200 verdunning of muis-mAb van -actine, 1:5000 verdunning) werden overnacht bij 4 graden geïncubeerd. De overeenkomstige Alk-Phos. geconjugeerde secundaire antilichamen werden bij kamertemperatuur geïncubeerd. Ten slotte werden de membranen drie keer gewassen met 1 x Tris-HCl-zoutoplossing met 0, 1 procent Tween 20 en werden signalen gescand en gevisualiseerd door GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Densitometrische analyse werd uitgevoerd op de eiwitten van belang en genormaliseerd naar -actine door GEL DOC Image Studio-software (Bio-Rad). -actine werd gebruikt als de interne controle.

statistische analyse

De Shapiro-Wilk normaliteitstest en Levene's variantie homogeniteitstest werden toegepast om de normaliteit te verifiëren en You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Pagina 4 van 13homogeniteit van variantie. Variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post hoc-test werd gebruikt om statistische verschillen te identificeren in homogene, normaal verdeelde gegevens. De niet-parametrische test van Kruskal-Wallis werd gebruikt om gegevens te analyseren die niet normaal verdeeld of homogeen waren. Resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Significantie werd vastgesteld op P < 0,05.="" alle="" gegevens="" werden="" geanalyseerd="" met="" spss="" 16.0-software="" (xinjiang="" medical="">

Resultaten

Kwantitatieve bepaling van CPhGs

CPhG's in C. tubulosa bevatten twee fenylethylalcoholglycosiden, echinacoside en acteoside, en hun inhoud in de CPhG's werd bepaald door HPLC-analyse (Fig. 1) op 42,71 ± 0,42 procent en 14,27 ± {{7 }},18 procent respectievelijk.

Lever- en miltindexen

Zoals Tabel 1 liet zien, waren de lever- en miltindexen van de modelgroep significant verhoogd [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" de="" lever-="" en="" miltindexen="" van="" het="" positieve="" geneesmiddel="" bjrg="" en="" cphg's="" bij="" verschillende="" dosisgroepen="" waren="" significant="" verlaagd="" in="" vergelijking="" met="" de="" modelgroep="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectievelijk].="" de="" lever-="" en="" miltindexen="" waren="" lager="" dan="" die="" van="" de="">

Effecten van CPhG's op ALT-, AST-activiteiten en leverfibrosemarkers

In de huidige studie waren de serumspiegels van de leverenzymen AST en ALT significant verhoogd in de modelgroep, wat een weerspiegeling is van hepatocellulaire schade bij door BSA geïnduceerde leverfibrose-ratten. Echter, de experimenten.

toonde aan dat behandeling met BJRG (600 mg/kg) en CPhG's (125, 250 en 5{{10}}0 mg/kg) verminderde AST significant [VERLEDEN < 0.0{{60}}1,="" verleden="">< 0.001,="" verleden="">< 0,001,="" verleden="">< 0,001="" respectievelijk]="" en="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," respectievelijk]="" bij="" leverfibrose-ratten="" .="" (tafel="" 2).="" de="" niveaus="" van="" ha,="" ln,="" pc="" en="" iv-c="" in="" modelratten="" waren="" significant="" verhoogd="" [respectievelijk="" pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0" 0,002,="" piv-c="">< 0,001,].="" vergeleken="" met="" de="" modelgroep="" zijn="" de="" niveaus="" van="" respectievelijk="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," ln="" [respectievelijk="" pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectievelijk],="" en="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respectievelijk]="" bij="" ratten="" werden="" aanzienlijk="" verlaagd="" door="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" en="" cphg's="" bij="" verschillende="" dosisgroepen="" (125,="" 250="" en="" 500="" mg/kg)="" (tabel="" 3).="" hyp-gehalte="" en="" tgf-="" 1="" collageengehalte="" werd="" ook="" gedetecteerd="" door="" hyp-niveaus="" in="" leverweefsel="" te="" meten.="" zoals="" weergegeven="" in="" tabel="" 4,="" is="" de="" gemiddelde="">het niveau in de modelgroep was significant hoger dan in de normale groep, maar het was duidelijk verlaagd in de BJRG-groep en de verschillende CPhGs-dosisgroepen. De leverconcentratie van TGF{{0}} van de modelgroep bij ratten was significant verhoogd [P < 0.001].="" vergeleken="" met="" de="" modelgroep="" waren="" de="" tgf-="" 1-spiegels="" van="" het="" positieve="" geneesmiddel="" en="" de="" verschillende="" cphgs-dosisgroepen="" aanzienlijk="" verlaagd="" [p="" tgf-="" 1="">< 00,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respectievelijk].="" de="" resultaten="" zijn="" samengevat="" in="" tabel="">

Histopathologisch onderzoek

Waarnemingen van secties van normaal leverweefsel gekleurd met H&E en Masson's trichroom vertonen verschillende hepatische lobben en hepatische sinusoïden. De leverweefselstructuur bij de modelratten was verstoord en het leverweefsel en de hepatische sinusoïden waren vervangen door een grote hoeveelheid bindweefsel. Er werden echter meer normale cytoarchitectuur en minder bindweefsel gedetecteerd in de behandelingsgroep dan die in de modelgroep.

H&E-kleuring

In de normale groep werden structurele integriteit van de leverkwab zonder abnormale portale gebieden en hepatische sinusoïden waargenomen. De leverkoorden waren op een ordelijke manier gerangschikt, met de kern rond en helder. De kernen bevinden zich in het midden van de cel, met een overvloed aan cytoplasma. Alleen het portaalgebied heeft een kleine hoeveelheid fibreus weefsel (Fig. 2a). In de modelgroep was de lobvormige structuur zwaar beschadigd. Levercellen vertoonden milde waterige degeneratie, meestal ballondegeneratie en/of vetdegeneratie. De vorming van infiltratie van ontstekingscellen, uitgebreide hyperplasie van fibreus weefsel, de vorming van een groot aantal van het fibreuze septum, gespleten lobben en significante proliferatie van levercellen werden ook waargenomen. Deze waarnemingen bevestigden het succes van de oprichting van het diermodel voor immuunbeschadiging bij ratten van leverfibrose (figuur 2b). In vergelijking met de modelgroep was er een vermindering van infiltratie van ontstekingscellen in de verschillende CPhG's. Ook werden minder necrose en vetdegeneratie van levercellen waargenomen, evenals verlichting van fibrose. CPhG's verzachtten significant de pathologie van door BSA geïnduceerde leverfibrose bij ratten, verlichtten de zwelling van levercellen en voorkwamen effectief hepatocytnecrose en infiltratie van ontstekingscellen, wat suggereert dat CPhG's een beschermend effect uitoefenen op door BSA geïnduceerde leverfibrose bij ratten. (Fig. 2c-f). Masson's trichroomkleuring In de normale groep was het leverweefsel normaal. Het leverportaalgebied vertoonde een klein aantal blauwe collageenvezels en het leverweefsel was normaal gestructureerd (figuur 3a). Vergeleken met het leverweefsel van de normale groep, prolifereerde fibreus weefsel door het centrale blad en breidde het zich uit tot in het leverparenchym. Collageenvezels verlengd en gekoppeld en

omhulde de gehele lobule en omringde de centrale ader. Deze effecten, samen met hepatocytfibrose, lobulaire structurele schade, periportale fibrose en pseudolobulevorming (figuur 3b) leverden het bewijs dat het model was vastgesteld. Vergeleken met de modelgroep waren de collageenvezels in de positieve medicijncontrolegroep lichtjes naar buiten verlengd vanaf het perifere portaalgebied (figuur 3c). Vergeleken met de modelgroep waren de collageenvezels in de verschillende CPhGs-dosisgroepen significant verminderd, werd de vezelproliferatie geremd en de proliferatie van fibreus weefsel in het leverparenchym significant verminderd. Deze resultaten suggereerden dat CPhG's ratten beschermden tegen door BSA geïnduceerde leverfibrose (Fig. 3d-f).

Immunohistochemische kleuring

Belangrijk is dat de expressie van collageen type I en collageen type III een essentiële rol spelen bij de ontwikkeling van leverfibrose, en hun vorming en afzetting in het leverweefsel zou kunnen dienen als een belangrijke bepalende factor voor de werkzaamheid tegen leverfibrose. De resultaten zijn samengevat in tabel 5.

Collageen type I

De normale groep bracht collageen type I voornamelijk tot expressie in bloedvaten en het portaalgebied. De modelgroep bracht collageen type I vasculaire fibrose in hoge mate tot expressie in portaalgebieden. In de ruimte van Disse werd collageen type I-kleuring waargenomen als strepen of als een fragmentarische verdeling. Collageen omhuld fibreuze septa om pseudolobule te vormen. In deze experimenten werden minder fibreuze septa gevormd voor BJRJ (600 mg/kg) en verschillende dosisgroepen van CPhG's (125, 250 en 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, respectievelijk PCol I=0.023 en P Col I=0.044]. De semi-kwantitatieve resultaten lieten zien dat de expressie van hun collageen type I significant lager was in vergelijking met de modelgroep (Fig. 4).

Collageen type III

Collageen type III werd zwak tot expressie gebracht in de normale groep en perifere gebieden rond de poort- en leveraders vertoonden een kleine hoeveelheid fijne gele in plaats van continue vezels (figuur 5a). In de modelgroep vertoonden collageenvezels brede en dikke koorden, wat wijst op een sterke expressie, voornamelijk gelokaliseerd in de portaal- en fibreuze weefselgebieden (figuur 5b). Collageenvezels van BJRJ (600 mg/kg) en verschillende dosisgroepen van CPhG's (125, 250 en 500 mg/kg) waren filamenteus en verdeeld rond de centrale ader en portale gebieden. Vergeleken met de modelgroep waren de collageenvezels significant verminderd, de kleuring was bleek en dun en de immunohistochemische kleuring was zwak positief (Fig. 5c-f). Deze semi-kwantitatieve resultaten laten zien dat de positief tot expressie gebrachte cellen in de positieve en verschillende dosisgroepen [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010, en P Col III=0.037, respectievelijk] waren verschillend van die in de modelgroep.

TGF- 1

Er was weinig expressie van TGIF{{0}} in normale levercellen van ratten. Expressie was beperkt tot een klein aantal interstitiële cellen (Fig. 6a). In de modelgroep was TGF- 1-expressie wijd verspreid in het portaalgebied, fibreuze ruimten, hepatische stellaatcellen, ontstekingscellen, de sinusoïdale wand en het cytoplasma. Een bepaald portaalgebied vertoonde een sterk positieve expressie met bruingele kleuring (figuur 6b). Er was een kleine hoeveelheid expressie in het portaalgebied en fibreuze septa van BJRJ (600 mg/kg) en verschillende dosisgroepen van CPhG's (125, 250 en 500 mg/kg). De mate van positieve kleuring in deze groepen was significant verminderd in vergelijking met die van de modelgroep. Kleuring in de interstitiële cellen in de fibreuze septa en het cytoplasma van ontstekingscellen was verminderd (Fig. 6c-f). Semi-kwantitatieve resultaten lieten zien dat BJRJ en verschillende dosisgroepen van CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004,="" respectievelijk]="" waren="" significant="" in="" vergelijking="" met="" de="" modelgroep.="" zoals="" eerder="" in="" het="" artikel="" vermeld,="" is="" tgf-="" 1="" een="" belangrijk="" cytokine="" in="" de="" pathofysiologie="" van="">

fibrose, waardoor de productie van extracellulaire matrix wordt gestimuleerd [19]. We toonden aan dat het niveau van TGF- 1 in de modelgroep toenam op een manier die consistent is met de ernst van leverfibrose. De expressieniveaus van TGF- 1 in de lever waren consistent met serum TGF- 1-niveaus. Dit geeft aan dat CPhG's leverfibrose als gevolg van TGF- 1-expressie aanzienlijk kunnen verminderen door deel te nemen aan de synthese en afbraak van ECM. De expressie van collageen type I, collageen type III en TGF- 1 kan het pathologische proces van leverfibrose detecteren. Hun expressieniveaus in de behandelingsgroepen waren significant verlaagd en illustreerden dat CPhG's de collagenase-activiteit kunnen verbeteren, het dynamische evenwicht van de ECM-synthese en -afbraak in de lever kunnen handhaven, waardoor de vorming van leverfibrose wordt vertraagd en voorkomen.