Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls klik hier om deel 1

Pls klik hier om deel 3

Cistanche kan het geheugen verbeteren

Op basis van deze bevindingen hebben we vervolgens onderzocht of de miR-466f-3p-expressie in de hippocampus bij ruimtelijk leren engeheugenvorming had ook invloed op de neuronale morfologie in vivo. Het is significant dat we vonden dat de gemiddelde ruggengraatdichtheid van de hippocampale neuronen van GLN-muizen hoger was dan die van PLN-muizen, zoals onthuld door Golgi-impregnatie van de piramidale

Figuur 3. Effecten van wijziging van de miR-466f-3p-expressieniveaus van de hippocampus op de MWM-prestaties van muizen

(A) Experimentele tijdlijn van de MWM-taak, expressieanalyse of elektrofysiologische meting van de muizenhersenen na injectie met lentivirus.

(B) linkerpanelen: expressie van dsRed in muis hippocampus. Representatieve IF-beelden met lage en hoge vergroting van hippocampus van muizen die zijn geïnfecteerd met recombinante lentivirussen die alleen dsRed tot expressie brengen als controle (linkerkolom met afbeeldingen) of miR-466f-3p plus dsRed (rechts kolom met afbeeldingen). De omkaderde gebieden van de bovenste twee afbeeldingen zijn vergroot en hieronder weergegeven. Schaalbalken, 100 mm. De stippellijnen geven de grenzen van DG aan. Kernen werden gekleurd met DAPI. GCL, korrelcellaag; ML, moleculaire laag. Rechter histogram, relatieve expressieniveaus van miR-466f-3p in muis-hippocampus geïnfecteerd met lentivirus tot expressie brengende controle of miR-466f-3p, zoals bepaald met RT-qPCR ( n=16 per groep).

(C) MWM-prestaties van muizen die zijn geïnfecteerd met verschillende recombinante lentivirussen, verpakt met het gebruik van vijf verschillende plasmiden die alleen dsRed, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ tot expressie brengen {5}}p, en miR/SCR-sponzen, respectievelijk, in hun hippocampus (n=13, 26, 16, 19 en 11 per groep, respectievelijk). Linker paneel: escape latency tijdens de training. Rechterpaneel: individuele ontsnappingslatentie op de 6e sessie.

Gegevens weergegeven in (B) worden weergegeven als gemiddelde ± SD en gegevens weergegeven in (C) worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische significantie werd beoordeeld door ongepaarde t-test (B), tweeweg-ANOVA met Bonferroni post-hocvergelijking (C, linkerpaneel) of één-ANOVA met Tukey's post-hoctest (C, rechterpaneel). Statistische verschillen: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" en="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" versus="" anderen;="" #mir-spons="" versus="">

neuronen in de GLN- en PLN-muis-hippocampus (Figuur S3). Deze bevindingen tonen aan dat opregulatie van miR-466f-3p in de hippocampus de uitgroei van neurieten en de vorming van dendritische wervelkolom bevordert, wat vergelijkbaar is met de inductie van de dichtheid van de wervelkolom die wordt waargenomen in de hippocampus van GLN-muizen ten opzichte van PLN-muizen.

miR-466f-3p moduleert het ruimtelijk leren van de muis positief engeheugenprestaties, evenals synaptische plasticiteit

Om te onderzoeken of miR-466f-3p het ruimtelijk leren van de muis positief reguleert engeheugenformatie gebruikten we een recombinante lentivirus-infectiebenadering om het miRNA in de hippocampus van de muis tot overexpressie te brengen. De muizen werden 7 dagen na injectie van lentivirus in de DG geanalyseerd (Figuur 3A). Representatieve beelden van de heupexpressieniveaus van miR-466f-3p waren inderdaad verhoogd in de miR{-466f-3p-groep met overexpressie vergeleken met de controlegroep (rechter histogram in figuur 3B). We ontdekten dat muizen met hippocampale overexpressie van miR-466f- 3p en onderworpen aan de MWM-taak een ontsnappingslatentie vertoonden van 88 ± 5 s in de 1e sessie en 19 ± 1 s in de 6e sessie (rood puntlijn, figuur 3C), die beter waren dan voor vectorcontrolemuizen (zwarte lijn) of mutante controlemuizen (rode cirkellijn) en vergelijkbaar met de ontsnappingslatenties van GLN-muizen beschreven in figuur 1A. Parallel onderzochten we het effect van miR-466f-3p functieverlies op ruimtelijk leren engeheugendoor miR-466f-3p te remmen met behulp van miR-sponge. Met name de MWM-prestaties van muizen waarin miR-466f-3p van de hippocampus werd gevangen door de miR-spons was vergelijkbaar met die van PLN-muizen, dwz ze leerden niet het platform te vinden, zelfs niet door de laatste sessie (ononderbroken groene vierkante lijn,

Figuur 3C). Bovendien leken muizen die met lentivirus waren geïnjecteerd de homeostatische plasticiteit niet te hebben verstoord, aangezien sommige muizen in elke groep tijdens de laatste sessie hadden geleerd of op zijn minst bezig waren met leren (Figuur 3C, rechterhistogram).

Gezien het feit dat overexpressie van miR-466f-3p in muis-hippocampus hun leren engeheugenvermogen, analyseerden we de vergelijkende elektrofysiologie van gekweekte hippocampale neuronen die verschillende niveaus van miR-466f-3p tot expressie brengen. De miniatuur exciterende postsynaptische stroom (mEPSC) van DIV14 hippocampale neuronen die miR-466f-3p of mut-miR-466f-3p, miR-spons of controle tot overexpressie brengen, was opgenomen met behulp van patchklemmen met hele cellen. Terwijl er geen significante verschillen waren in de mEPSC-amplitude, stijgende Tau of afnemende Tau tussen de vier sets monsters, was de mEPSC-frequentie van neuronen die miR-466f-3p tot overexpressie brengen significant hoger in vergelijking met andere groepen (Figuur 4A), wat aangeeft dat postsynaptische glutaminerge receptoren sterker werden geactiveerd na overexpressie van miR-466f- 3p.

Vervolgens hebben we de langetermijnpotentiëring (LTP) gemeten om de rol van miR-466f-3p in synaptische plasticiteit in vivo direct te bepalen. We hebben de hippocampus van muizen geïnjecteerd met recombinant lentivirus zoals beschreven in figuur 3 en vervolgens LTP in hippocampus-plakken geïnduceerd door tetanische stimulatie (drie treinen van hoogfrequente stimulatie [3xHFS]) van de Schaffer-collaterale route. We ontdekten dat ons protocol LTP in alle groepen induceerde, zoals blijkt uit de aanhoudende toename van veldexciterende postsynaptische potentialen (fEPSP's) in het cornu ammonis 1 (CA1) gebied (Figuur 4B, linkerpaneel). De LTP was sterker in miR-466f-3p tot overexpressie brengende plakjes (188 procent ± 2 procent van de basislijn 40-50 min na stimulatie, gemiddelde ± SEM) vergeleken met mutant (169 procent ± 1 procent van de uitgangswaarde), SCR-spons (173 procent ± 3 procent van de uitgangswaarde) en met controlevirus geïnfecteerde plakjes (159 procent ± 2 procent van de uitgangswaarde), als miR-466f-3p-remming door miR-spons verminderde de LTP (128 procent ± 1 procent van de basislijn) ten opzichte van de controles (Figuur 4B, rechterpaneel). We maten ook de LTP van de GLN- en PLN-groepen na de training. De respectieve gegevens onthulden ook significante verschillen in fEPSP-helling in het CA1-gebied tussen de GLN- en PLN-groepen (Figuur 4C). Dus een verhoogd niveau van miR-466f-3p verbetert LTP en synaptische plasticiteit die op zijn beurt het leren engeheugenvermogen van muizen. Samen laten de gegevens in de figuren 2, 3 en 4 zien dat miR-466f-3p een cruciale positieve rol speelt bij ruimtelijk leren engeheugenvorming, waarschijnlijk door de vorming van de wervelkolom, LTP en de sterkte van synaptische plasticiteit te verbeteren.

Mef2a-mRNA is een regulerend doelwit van miR-466f-3p

We hebben een bio-informatica-analyse uitgevoerd om potentiële doelwit-mRNA's te identificeren die worden gereguleerd door binding van miR-466f-3p aan hun 30 UTR's. Onder de kandidaten die we identificeerden, was het Mef2a-mRNA dat codeert voor MEF2A. Interessant genoeg bleek eerder dat MEF2A-expressie werd gedownreguleerd na MWM-training, en overexpressie van deze factor had een negatief effect op de prestaties van muizen (Cole et al., 2012). Daarom hebben we een luciferase-reportertest gebruikt om te onderzoeken of miR-466f-3p de translatie van Mef2a-mRNA reguleert door te binden aan zijn 30 UTR. We hebben wildtype of mutante Mef2a 30 UTR-sequenties ingevoegd stroomafwaarts van een SV40-promoter-gedreven luciferase-cDNA (Luc), resulterend in het reporterplasmide psiCHECK2-MEF2A 30 UTR of psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Figuur 5A). Zoals getoond in het linker histogram van figuur 5B, verzwakte co-expressie van miR-466f-3p de expressie van luciferase aangestuurd door Mef2a 30 UTR. Dit effect bleek afhankelijk te zijn van de interactie tussen miR-466f-3p en Mef2a 30 UTR aangezien mutatie van ofwel de voorspelde bindingsplaats van miR-466f-3p op de Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) of het zaadgebied van miR-466f-3p (50-AUACACA-30) het herkennen van Mef2a 30 UTR heft het remmende effect van miR-466f-3p op luciferase-activiteit op (Figuur 5B, middelste histogram). Bovendien elimineerde co-expressie van de miR-spons, maar niet de CR-spons, ook het repressieve effect van miR -466 f -3 p op luciferase-activiteit (Figuur 5B, rechter histogram). Noch overexpressie van miR-466f-3p noch miR-spons had enig effect op de niveaus van Mef2a-mRNA in primaire hippocampale neuronen (Figuur 5C), maar ze verminderden of verhoogden respectievelijk de niveau van MEF2A-eiwit (Figuur 5D). We vonden ook dat overexpressie van respectievelijk miR-466f-3p of miR-spons het mRNA-niveau van activiteit-gereguleerd cytoskelet-geassocieerd eiwit (Arc) in primaire hippocampale neuronen neerwaarts of opwaarts reguleerde (Figuur 5C) , een bekend stroomafwaarts doelwit dat positief werd gereguleerd door MEF2A (Flavell et al., 2006)

We voerden ook fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) uit om miR-466f-3p te detecteren en combineerden dit met IF-labeling van MEF2A in DIV14 primaire hippocampale neuronen zonder of met forskolinebehandeling. Van Forskolin is bekend dat het chemische LTP induceert en adenylylcyclase activeert, waardoor de intracellulaire cAMP-niveaus worden verhoogd. We observeerden nucleaire colokalisatie van MEF2A met miR-466f- 3p, zoals geïllustreerd door de representatieve afbeeldingen in figuur 5E. Na forskolinestimulatie nam het miR-466f-3p-signaal echter toe in zowel soma als dendrieten, terwijl het MEF2A-signaal in de

kern verminderd, zoals blijkt uit de wederzijdse veranderingen van de intensiteiten van respectievelijk de MEF2A- en Fast Red-signalen van de individuele neuronale cellen (Figuur 5E). Samenvattend geven de gegevens in figuren 5A-5E aan dat miR-466f-3p de expressie van MEF2A-eiwit negatief reguleert door te binden aan de 30 UTR van Mef2a-mRNA en bijgevolg de translatie ervan te onderdrukken.

In overeenstemming met de hierboven beschreven resultaten, vonden we dat hippocampale niveaus van MEF2A-eiwit werden gedownreguleerd in GLN-muizen na MWM-training, maar niet in PLN-muizen (Figuur 5F). Bovendien waren de relatieve niveaus van MEF2A in individuele GLN-muizen (dots) en PLN-muizen (vierkantjes) omgekeerd gecorreleerd met de niveaus van miR-466f-3p (R=0.60, Figuur 5G). Dus heterogene patronen van ruimtelijk leren engeheugenvermogen worden gemoduleerd door stochastische toenames van hippocampale miR- 466f-3p bij individuele muizen en de daaruit voortvloeiende afname van MEF2A bij stimulatie van neuronale activiteit.

Stochastische activering van hippocampus CREB en daaruit voortvloeiende transcriptionele opregulatie van het miR- 466-669-cluster tijdens MWM-training

We hebben de mechanismen onderzocht waarmee miR-466f-3p in de hippocampus van de muis stochastisch kan worden opgereguleerd door de MWM-taak. Er zijn drie miRNA-precursors die coderen voor miR-466f-3p, die allemaal behoren tot het knaagdierspecifieke miR-466-669-cluster dat zich bevindt in intron 10 van zijn gastheergen, mSfmbt2 (Inoue et al. ., 2017) (Figuur 6A). Interessant genoeg was er, in tegenstelling tot miR-466f-3p, geen significant verschil in de expressieniveaus van mSfmbt2 tussen de GLN- en PLN-groepen (Figuur 6B), wat suggereert dat het miR-466-669-cluster een afzonderlijk transcript zou kunnen coderen in plaats van deel uit te maken van het primaire transcript van mSfmbt2. Dienovereenkomstig hebben we verschillende sets primers ontworpen om het vermeende primaire transcript van miR-466-669-cluster te identificeren met RT-qPCR. Zoals afgebeeld in figuur 6A, een lang PCR-fragment (plus 282 tot 2.381), samen met een reeks overlappende qPCR-banden, namelijk A (plus 282 tot 115), B (131 tot 406), C (388 tot 686), D ( 662 tot 1.028), E ( 1.004 tot 1.299), F ( 1.242 tot 1.629), G ( 1.605 tot 2.029), en H ( 2.005 tot 2.381), konden worden gedetecteerd in de hippocampus van de muis, maar niet in deel I ( 2.306 tot 2.776 ) (data niet weergegeven). Deze gegevens ondersteunen dat het miR-466-669-cluster codeerde voor een lang transcript in de buurt van ongeveer 2.388 bp stroomopwaarts van de eerste miRNA-precursor (dwz pre-mir-466m, aangegeven plus 1inFiguur6A). Opmerkelijk is dat, vergelijkbaar met wat we vonden voor miR-466f-3p, het gemiddelde niveau van dit transcript in de hippocampus van GLN-muizen hoger was dan voor PLN-muizen (Figuur 6C). Dus verbeterd leren engeheugenvermogen van GLN-muizen is te wijten aan transcriptionele activering van het miR-466-669-cluster.

Activering van nucleair CREB door fosforylering tijdens MWM-taken of in andere vormen van leren is een cruciale stap voor het omzetten van korte naar lange termijngeheugen(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). Daarom hebben we onderzocht of de verschillende niveaus van miR-466f-3p bij individuele muizen die de MWM-taak ondergingen, mogelijk gecorreleerd waren met de activeringsstatus van CREB. Om dit idee te onderzoeken, onderzochten we eerst de fosforyleringsniveaus van hippocampus CREB bij individuele muizen. Zoals getoond in figuur 6D, werd CREB-activering (door fosforylering op residu S-133) versterkt in GLN-muizen ten opzichte van PLN- en HC-muizen. We hebben ook bevestigd dat miR -466f-3p inderdaad tot co-expressie werd gebracht met pCREB in neuronen door miRNA ISH uit te voeren in combinatie met IF-kleuring van pCREB en MAP2 in primaire hippocampale neuronen (Figuur S2A). Bovendien waren de primaire transcriptniveaus van miR- 466-669-cluster positief gecorreleerd met pCREB in GLN-muizen (R=0.52), terwijl het negatief gecorreleerd was met pCREB in PLN-muizen (R=0 0,71) (Figuur 6E). We hebben gecontroleerd op een correlatie tussen de niveaus van een andere actieve factor, fosfo-extracellulair signaal-gereguleerd kinase (pERK), en de primaire transcriptniveaus van het miR-466-669-cluster. We ontdekten dat beide typen MWM-getrainde muizen positieve correlaties vertoonden tussen miR-466-669 clustersignaal en pERK (respectievelijk R=0.59 en 0.48; Figuur S4A), en er was geen verschil in pERK/ tERK-expressie tussen die twee groepen (Figuur S4B). Om de impact van CREB-activering op transcriptionele opregulatie van demiR-466-669cluster verder te verduidelijken, en bijgevolg

inductie van miR-466f-3p,we gebruikten een specifieke CREB-remmer,666- 15 (Xie et al., 2015), in combinatie met forskolinebehandeling van DIV14 primaire hippocampale neuronen. Van Forskolin is bekend dat het CREB-fosforylering activeert (Malhotra et al., 2015). We ontdekten dat voorbehandeling van primaire hippocampale neuronen met 666-15 door forskolin geïnduceerde CREB-activering blokkeerde (Figuur 6F) en de niveaus van miR-466f-3p en miR-466-669-cluster verminderde transcript (figuren 6G en 6H). Gelijktijdig werden mRNA-niveaus van de bekende pCREB-doelgenen nurr1 en homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) ook verlaagd na behandeling met 666-15 (Figuur 6H). Alles bij elkaar genomen, laat figuur 6 zien dat stochastische activering van CREB in de hippocampus van een subpopulatie van inteeltmuizen die MWM-taak ondergaan, transcriptie van het miR-466-669-cluster induceert en bijgevolg inductie van miR-466f{{23 }}p, waardoor hun ruimtelijk leren wordt verbeterd engeheugenvermogen om beter te presteren in de taak.

DISCUSSIE

We hebben de mogelijke rol van miRNA's onderzocht bij het moduleren van het variërende vermogen van ruimtelijk leren engeheugenonder ingeteelde C57BL/6J-muizen. We suggereren dat stochastische activering van CREB en de daaruit voortvloeiende opregulatie van hippocampale miR-466f-3p verantwoordelijk is voor het grotere ruimtelijk leren engeheugenvermogen van een subgroep van onze testmuizen, waarschijnlijk als gevolg van miR-466f-3p die translationele remming van Mef2a-mRNA dat codeert voor degeheugennegatieve regelaar MEF2A. Onze bevindingen bieden een scenario dat de functionele en evolutionaire rol aantoont van een specifiek miRNA bij het reguleren van cognitie door stochastische inductie van een CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A-as door omgevingsstimuli.

De MWM-taak is op grote schaal gebruikt om het variërende vermogen van ruimtelijk leren te onderzoeken engeheugenvoor knaagdieren. Onder normale omstandigheden gebruiken knaagdieren distale signalen om zich te oriënteren, waardoor ze de locatie van het verborgen platform in de taak kunnen leren en onthouden. De meeste van onze inteelt C57BL/6J-muizen (62%) vertoonden een normaal patroon van ontsnappingslatentie en vonden het platform binnen 30 s bij sessies 3e-6e (Figuur 1A, GLN). Daarentegen leerde een groep muizen (38 procent) de taak niet, zelfs niet bij de 6e sessie (PLN). Met name hebben we de muizen ook onderworpen aan twee andere herkenningstests. De eerste was de nieuwe test voor objectherkenning (NOR), een enkele proef die is gebaseerd op aangeboren verkenning zonder bekrachtiging of stress om gedrag te motiveren (Leger et al., 2013). De correlatie tussen de NOR- en MWM-taken in termen van muisprestaties is slecht (R {{1{{2{0}}}}.13), wat vergelijkbaar is met de correlatie tussen NOR-prestaties en de hippocampale expressieniveaus van miR-466f-3p (R=0.01; gegevens niet getoond). De NOR-test onthulde ook geen verschillen in de discriminatie-index tussen de MWM GLN- en PLN-groepen (0,36 ± 0,25 versus 0,29 ± 0,18; figuur S1B). De andere ruimtelijk leren engeheugen-afhankelijke taak die we hebben toegepast is het Barnes-doolhof (BM), dat vergelijkbaar is met de MWM. Het is gebaseerd op de veronderstelling dat knaagdieren die in een aversieve omgeving worden geplaatst, de locatie van een ontsnappingsbox onder het oppervlak van het platform moeten leren en onthouden. Zoals weergegeven in figuur S1C, hebben we geconstateerd dat muisprestaties in de BM-sondeproeven ook positief gecorreleerd zijn met de hippocampale expressieniveaus van miR-466f-3p. Dus, inductie van de CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A-as in de hippocampus tijdens het leren engeheugenformatie is ruimtelijk contextafhankelijk.