Deel 2: echinacoside induceert apoptotische kankerceldood door remming van het nucleotidepool-desinfecterend enzym MTh1

echinacoside induceert apoptotische kankerceldood door remming van het ontsmettende enzym MTh1 van de nucleotidepool

11-

Cistanche echinacosideheeftanti-kankerenanti-apoptotischEffecten

Resultaten

Identificatie van echinacoside als een MTh1-remmer

Om te zoeken naar natuurlijke verbindingen die MTH1 kunnen remmen, gebruikten we de MTH1-gekatalyseerde enzymatische reactie als een hoge doorvoer in de vitro-screeningtest. Naast geoxideerde purinenucleotiden kan MTH1 ook normaal deoxyguanosinetrifosfaat hydrolyseren om deoxyguanosinemonofosfaat en pyrofosfaat te genereren. In aanwezigheid van een overmaat aan anorganische pyrofosfatase worden alle pyrofosfaten omgezet in anorganische fosfaten, die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een op malachietgroen gebaseerde absorptietest,41 waardoor indirecte meting van de MTH1-activiteit mogelijk wordt.32 Om het testsysteem te testen, hebben we eerst de effect van (S)-crizotinib, een verbinding met bewezen potentie als MTH1-remmer.33 Het resultaat toonde aan dat (S)-crizotinib inderdaad krachtig MTH1 remde (Figuur 1A) met een IC50 van 500 nM, die zevenmaal hoger was dan die gerapporteerd door Huber et al (72 nM).33 Dit was waarschijnlijk te wijten aan de verschillen in de detectiemethoden of bronnen van chemicaliën en enzymen. We kozen voor een minder gevoelige chromogene benadering, terwijl Huber et al. een zeer gevoelige bioluminescente methode gebruikten.33 Met dit in gedachten hebben we 12 in de handel verkrijgbare natuurlijke verbindingen gescreend (Tabel S1), die elk een belangrijk ingrediënt zijn van traditionele kruiden met potentiële antitumormiddelen. werkzaamheid.Echinacoside, een verbinding gezuiverd uit de parasitaire medicinale plant Cistanche salsa (Figuur 1C), remde de reactie significant (Figuur 1B), met een IC50 van 7,01 ± 2,13 M (Figuur 1D). Het toevoegen van 50 keer meer pyrofosfatase had geen invloed op het resultaat, terwijl het toevoegen van vijf keer meer MTH1-eiwit de mate van remming significant verminderde, wat suggereert datEchinacosideremde specifiek de activiteit van MTH1 in de in vitro enzymatische test.

Echinacoside remde cellulair MTh 1 om intracellulaire 8-oxog . te verhogen

Vervolgens vroegen we ofEchinacosidekan intracellulaire MTH1-activiteit remmen. Remming van cellulair MTH1 zal resulteren in een toename van intracellulair 8-oxoG. Van Avidine is aangetoond dat het bindt aan 8-oxoG met een hoge specificiteit;42 daarom gebruikten we immunofluorescentiekleuring met Cy3-geconjugeerd avidine om intracellulaire 8-oxoG-niveaus in verschillende kankercellijnen voor en naEchinacosidebehandeling. Menselijke MG{{0}} osteosarcoom, SK-HEP-1hepatocarcinoom, MCF-7 borstkanker en SW480 colorectale kankercellen werden behandeld met 0 M, 15 μM, 30 μM, 60 μM, of 80 μM Echinacoside gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur. Kleuring met Cy3-geconjugeerd avidine onthulde dat behandeling met 60 M echinacoside gedurende 24 uur duidelijk en significant het niveau van cellulaire 8-oxoG (Cy{3-avidine-reactieve stof) in deze kankercellen verhoogde ( Figuur 2A en B). Hogere concentratie (80 M) vanEchinacosideresulteerde in sterkere cellulaire 8-oxoG-kleuring (Figuur 2B), wat een dosis-responsrelatie suggereert. Soortgelijke resultaten werden verkregen

door immunofluorescentiekleuring met een monoklonaal anti-8-oxoG-antilichaam van een muis (Figuur S1A).43 De concentratie vanEchinacoside(60 M) vereist voor een significante toename in cellulaire 8-oxoG was veel hoger dan de IC50 (7,01 M) van de in vitro-assay. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het verschil in gevoeligheid van de twee testen. Immunofluorescentiekleuring is veel minder gevoelig dan de in vitro enzymatische test; bovendien wordt het aantal remmermoleculen dat cellulair MTH1 kan bereiken en ermee kan interageren, beïnvloed door complexe biologische processen; bovendien wordt in de in vitro test de minder favoriete dGTP als substraat gebruikt, en daarom kan het gemakkelijker zijn (minder remmers nemen) om MTH1 te remmen, wat resulteert in een lagere IC50 in de in vitro test.

Deantikankerenantioxidanteffecten vanechinacosidevanCistanchedeserticola

Cellulair 8-oxoG wordt gegenereerd door ROS, dat wordt tegengewerkt door antioxidanten. Een toename in cellulaire ROS of onderdrukking van de activiteit van antioxidanten zou dus ook resulteren in een toename van het cellulaire 8-oxoG-niveau.Echinacosidezelf is een krachtige antioxidant44,45 en zou dus de activiteit van antioxidanten moeten versterken in plaats van onderdrukken. Om te onderzoeken of het cellulaire ROS-niveau is veranderd door:Echinacosidebehandeling werden dezelfde kankercellen behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 M Echinacoside gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur en vervolgens geanalyseerd met flowcytometrie na kleuring met de fluorescerende probe 2′,7′-dichloorfluoresceïne diacetaat. De resultaten toonden aan dat geen van deze behandelingen de cellulaire ROS-niveaus veranderde (Figuur 2C en D). Het verhoogde cellulaire 8-oxoG-niveau was dus hoogstwaarschijnlijk het gevolg van de remming van MTH1 door Echinacoside.

echinacosideveroorzaakte uitgebreide DNA-schade, specifiek in kankercellen. Opname van 8-oxoG in DNA stimuleert BER en MMR, die enkelstrengige DNA-breuken (SSB) en hiaten genereren.16,17 Normaal gesproken worden deze breuken en hiaten afgedicht door reparatiemechanismen waarbij spleetvulling en ligatie door DNA-polymerasen en ligasen betrokken zijn.46,47 Snelle toename van cellulaire SSB kan echter de cellulaire reparatiecapaciteit verzadigen, wat leidt tot de vorming van talrijke dubbelstrengs DNA-breuken (DSB)18 en DDR-signalering. Om te onderzoeken of deEchinacoside-geïnduceerde toename in cellulaire 8-oxoG DNA-schade veroorzaakte, onderzochten we een van de vroege markers van DNA-schade, 53BP1, die bindt aan plaatsen van DSB als de vroegste cellulaire respons op DSB.48 De MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 en SW480 kankercellijnen en de niet-kankercellijnen menselijke normale lever L-O2,49 menselijke embryonale nier HEK 293 en muisfibroblast NIH/ 3T3 werden gedurende 5 uur, 12 uur of 24 uur behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M of 80 M Echinacoside. Fluorescerende immunokleuring toonde aan dat behandeling met 60 M Echinacoside gedurende 24 uur specifiek het aantal cellen verhoogde met vijf of meer sterk gekleurde nucleaire 53BP1-foci in alle kankers, maar niet in een van de niet-kankercellijnen (Figuur 2E en F). Een significante toename van het aantal 53BP1 plus-cellen werd al 5 uur na het begin van de behandeling met Echinacoside waargenomen (Figuur 2F). Hogere concentratie (80 M) Echinacoside of langere behandelingstijd (12 uur en 24 uur) resulteerde in grotere toenames in zowel het aantal 53BP1 plus-cellen (Figuur 2F) als het aantal cellulaire 53BP1-foci. Samen suggereren deze resultaten dat de remming van MTH1 door Echinacoside 8-oxoG-accumulatie en uitgebreide DNA-schade veroorzaakte in kanker, maar niet in niet-kankercellen.

echinacoside onderdrukte proliferatie van kankercellen

In cyclische cellen zullen niet-herstelde DNA-strengbreuken een ineenstorting van de DNA-replicatievorken veroorzaken, wat vervolgens zal leiden tot blokkering van celproliferatie door inductie van stopzetting van de celcyclus en apoptose.50 Om de effecten vanEchinacosideop celgroei en proliferatie analyseerden we eerst de groei van met Echinacoside behandelde MG-63-, SK-HEP-1-, MCF-7- en SW480-kankercellen door middel van een kolonievormingstest. De resultaten toonden aan dat de kankercellen die werden behandeld met 60 M of 80 μMEchinacosidevormden veel minder kolonies, en de kolonies die zich vormden waren veel kleiner (Figuur 3A en B), wat wijst op een sterk onderdrukt groeipotentieel. Vervolgens analyseerden we de proliferatie van deze kankercellen, samen met de L-O2, HEK 293 en NIH/3T3 niet-kankercellen door een MTT-assay. De resultaten toonden aan dat de Echinacoside dosisafhankelijk de proliferatie van kanker remde, maar niet de niet-kankercellen (Figuur 3C). Tijdsverlooponderzoek van kankercellen behandeld met 60 M Echinacoside toonde aan dat er na 5 uur geen significant verschil was tussen niet-behandelde en behandelde groepen, maar na 12 uur was de proliferatie van kankercellen significant geremd met 60 μMEchinacoside(Figuur 3D).

stadia van de celcyclus door flowcytometrie onthulden dat:Echinacosidebehandeling verminderde dosisafhankelijk het percentage cellen in zowel de S- als de G2/M-fase, terwijl het percentage cellen in de G1-fase toenam (Figuur 4C en D). Na 80 μM Echinacoside-behandeling van MG-63-cellen gedurende 24 uur, namen de cellen in de G2/M-fase af van 15 procent tot bijna nul, en de cellen in de S-fase daalden van 37 procent naar 17 procent , terwijl cellen in de G0/1-fase stegen van 43 procent naar 80 procent (Figuur 4E). Deze resultaten geven aan dat behandeling metEchinacosideveroorzaakte stopzetting van de celcyclus en blokkeerde de kankercellen in de G1-fase.

Door echinacoside geïnduceerde apoptose in kankercellen

In overeenstemming met observaties over celproliferatie, toonde Western-blot-analyse aan dat behandeling met 60 M en 80 MEchinacosidegedurende 24 uur verhoogden de niveaus van actieve caspase-3 en gesplitste poly (ADP-ribose) polymerase-eiwitten in de kankercellen (Figuur 5A en B), wat duidt op inductie van caspase-afhankelijke apoptose. Vervolgens hebben we verschillende cellulaire markers van apoptose onderzocht. Ten eerste, de nucleaire morfologie vanEchinacoside-behandelde kankercellen werden onthuld door kleuring met de DNA-kleurstof DAPI, waaruit bleek dat een behandeling van 24 uur met 60 M en 80 μMEchinacosideverhoogde het aantal kenmerken van apoptose, waaronder pyknosis en gecondenseerd chromatine (helderdere kernen) (Figuur 5C). Ten tweede werd het DNA geëxtraheerd uit op dezelfde manier behandelde kankercellen geanalyseerd door elektroforese op agarosegel, wat een typisch apoptotisch ladderpatroon onthulde (Figuur S1B). Ten slotte werd cellulair actief caspase-3 gedetecteerd door middel van immunofluorescentiekleuring, wat sterke geactiveerde caspase-3-signalen inEchinacoside-behandelde kankercellen (Figuur S1C).

Vervolgens werd het percentage apoptotische cellen gemeten door Annexin V-FITC en PI dubbele kleuring en flowcytometrie. Analyse van cellen behandeld met 0 M, 15 M, 30 M, 60 M, 80 M of 160 MEchinacosidegedurende 2 uur, 5 uur, 12 uur of 24 uur toonden aan dat 60 M of hogere concentraties vanEchinacosideinduceerde significante apoptose in de MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 en SW480 kankercellen (Figuur 6A), maar niet in de niet-kanker L-O2, HEK 293 en NIH / 3T3-cellen (Figuur S2). Na behandeling van MG-63-cellen met 60 M, 80 M of 160 μMEchinacosidegedurende 24 uur nam het percentage apoptotische cellen toe van respectievelijk 8,89 procent tot 33,72 procent, 39,01 procent en 48,12 procent (Figuur 6A). Het tijdsverlooponderzoek toonde aan dat er na 5 uur geen significant verschil was tussen niet-behandelde en behandelingsgroepen, maar significante apoptose werd waargenomen na behandeling met 60 M of hogere concentraties Echinacoside gedurende 12 uur (Figuur 6B en S3).

Ten slotte toonde meting van het mitochondriale membraanpotentieel door de JC-1 fluorescerende kleurstof duidelijk een prominent verlies van mitochondriaal membraanpotentieel na behandeling met 60 μMEchinacosidegedurende 12 uur (Figuur 6C), maar niet na 5 uur, wat wijst op de activering van de intrinsieke apoptoseroute na de DNA-schade veroorzaakt door verhoogde 8-oxodG.

Phenylethanoid Glycosides in cistanche (2)

Deanti-kankeren ontstekingsremmende effecten vancistanche echinacoside

Discussie

Echinacosideis een natuurlijke verbinding die wordt geïsoleerd uit de geneeskrachtige planten Cistanche en echinacea.51,52 Het is aangetoond dat het veelzijdige gezondheidsbevorderende en ziektepreventieve eigenschappen bezit, waaronder neurale bescherming, hepatoprotectie, ontstekingsremmende, antivermoeidheids-, antisenescentie-, antidiabetes- en antitumorwerking. 53–58 De bekendste en meest geaccepteerde biologische activiteit vanEchinacosideis de antioxidatieve en ROS-afvangende werking;44,45 er is echter ook aangetoond dat het oxidatieve DNA-schade veroorzaakt in kankercellen, waarbij de onderliggende mechanismen onduidelijk blijven.58 In de huidige studie werd gebruik gemaakt van een high-throughput in een vitro screening test, vonden we datEchinacosideremde effectief de door MTH1-gekatalyseerde enzymatische reactie. Het verhogen van de hoeveelheid van het MTH1-enzym verminderde de mate van remming, terwijl het verhogen van de hoeveelheid anorganische pyrofosfatase de remming niet beïnvloedde, wat aangeeft dat Echinacoside specifiek de activiteit van MTH1 remde in de in vitro-assay. Behandeling van verschillende menselijke kankercellijnen met echinacoside veroorzaakte een significante verhoging van het cellulaire 8-oxoG-niveau zonder het cellulaire ROS-niveau te veranderen. Aangezien Echinacoside zelf een krachtige antioxidant is, suggereerden deze resultaten dat het verhoogde intracellulaire 8-oxoG-niveau waarschijnlijk het gevolg was van de remming van cellulair MTH1 door Echinacoside.

Behandeling metEchinacosideveroorzaakte uitgebreide DNA-schade en significante opregulatie van de G1/S-CDK-blokker p21, die werd gevolgd door duidelijke apoptotische celdood en onderdrukking van celproliferatie, specifiek bij kanker, maar niet in de niet-kankercellen. Bovendien is een prominent verlies van mitochondriaal membraanpotentiaal na

Echinacosidebehandeling duidde op activering van de intrinsieke apoptose-route.Echinacoside-geïnduceerde DNA-schade en opregulatie van p21 werden waargenomen binnen 5 uur na de behandeling, terwijl apoptose van kankercellen, verstoring van het mitochondriale membraanpotentieel en groeiremming 12 uur na het begin van de behandeling werden waargenomen. Deze gegevens ondersteunen dat apoptose van kankercellen en groeiremming het resultaat waren van de uitgebreide DNA-schade veroorzaakt door de remming van MTH1. Recente studies hebben aangetoond dat een vermindering van de grootte van de cellulaire dNTP-pool ook DNA-replicatiestress en DNA-schade zou kunnen veroorzaken.59,60 Een toename van 200 procent van het 8-oxoG-niveau in de met echinacoside behandelde kankercellen pleit echter tegen de mogelijkheid van een verminderde dNTP-poolgrootte, en Bcl2, een eiwit dat de dNTP-poolgrootte vermindert,60 was significant verminderd in met Echinacoside behandelde SW480-kankercellen;58 bovendien toonden onze gegevens duidelijk aan dat Echinacoside MTH1 direct remde, wat op zijn minst gedeeltelijk verantwoordelijk voor de DNA-schade en cellulaire effecten veroorzaakt door Echinacoside.

De dNTP-pool is een cruciaal doelwit van ROS, en geoxideerde dNTP's zijn belangrijke bronnen van oxidatieve DNA-schade. heterogeniteit en hoge mutatiesnelheden in kankercellen. Daarentegen is remming van MTH1 gericht op een fenotype dat de meeste kankercellen onderscheidt van normale cellen en daarom een nieuwe antikankerstrategie vertegenwoordigt die niet wordt beperkt door genetische aanpassingen. Interessant is dat kleine molecuul-antagonisten van het anti-apoptose-eiwit Bcl266,67 en agonisten van de pro-apoptose Bax68 zijn ontwikkeld en waarvan is aangetoond dat ze veelbelovende nieuwe middelen tegen kanker zijn. Gezien hun complementaire werkingsmechanismen, zou het combineren van MTH1-remmers en apoptose-bevorderende chemicaliën een opwindende nieuwe generatie geneesmiddelen tegen kanker creëren.

Voor het eerst hebben we een nieuwe functie van echinacoside als natuurlijke stof tegen kanker aangetoond. In de in vitro test remde Echinacoside MTH1 met een IC50 van 7,01 M. Deze IC50-waarde is hoger dan die van de tot nu toe gerapporteerde MTH1-remmers.32,33,69 Met (S)-crizotinib als positieve controle toonden we aan dat onze test zevenmaal minder gevoelig is dan die van Huber et al.33 , zal de werkelijke IC50 van Echinacoside waarschijnlijk lager zijn. Om het echter als een therapeutisch middel te ontwikkelen, zal de werkzaamheid van het natuurlijke echinacoside-molecuul waarschijnlijk moeten worden verbeterd. Als een natuurlijk product dat lange tijd als kruidengeneesmiddel wordt gebruikt, zou Echinacoside kunnen dienen als een goede chemische steiger voor het ontwikkelen van efficiënte en waarschijnlijk veilige MTH1-remmers.37,70 Aangezien natuurlijke producten een rijke bron van nieuwe chemische steigers zijn geweest voor rationeel, op structuren gebaseerd medicijnontwerp, 70 benaderingen vergelijkbaar met wat we hier gebruikten,

samen met de enorme interesse in natuurlijke producten voor het ontdekken van medicijnen, zal nuttig zijn bij het vinden van op doelwitten gebaseerde, effectieve en veilige nieuwe medicijnen.

echinacoside in cistanche (2)