Deel 2: Echinacoside beschermt tegen MPP plus-geïnduceerde neuronale apoptose via ROS/ATF3/CHOP Pathway-regulering

EchinacosideBeschermt tegen MPP plus-geïnduceerde neuronale apoptose via ROS/ATF3/CHOP Pathway Regulation

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Leng Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Contact:joanna.jia@wecistanche.com

Pls klik hier om deel 1

Pls klik hier om deel 3

Cistanche echinacosideheeft antioxiderende eigenschappen

Immunofluorescentie kleuring

1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, of een combinatie van MPP? en ECH. De cellen werden vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) in een blokkerende buffer (3 procent BSA in PBS) geïncubeerd. Vervolgens werden anti-ATF3-, anti-CHOP- of anti-gesplitste caspase 3-antilichamen verdund tot 1:100 in blokkeerbuffer (1 procent BSA in PBS met 0,3 procent Triton X-100) en overnacht bij 4C geïncubeerd. Na drie keer wassen met PBS werden de cellen bij kamertemperatuur geïncubeerd met Alexa 488-geiten-anti-konijn-IgG (Life Technologies, Carlsbad, CA)

1 uur. Kernen werden gekleurd met Hoechst 33342. Beelden werden vastgelegd met een confocale microscoop (Leica SP8, Wetzlar, Duitsland).

Terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)-assay

We kleurden elke 10e coronale sectie (totaal 14-15) door de SNc van bregma -2,92 nm tot -3,64 mm.

Vier typische secties door de SNc op hetzelfde niveau in elke groep werden gebruikt voor TH- en TUNEL-tellingen [10]. TUNEL-assays werden uitgevoerd om apoptose in weefselcoupes te analyseren met een in situ celdooddetectiekit (Roche, Rotkreuz, Zwitserland), volgens de instructies van de fabrikant. Na DNA-labeling werden secties gebruikt voor immunofluorescentiekleuring met anti-TH-antilichaam en werden beelden vastgelegd met een confocale microscoop (Leica SP8, Wetzlar, Duitsland). Na afbakening van de SNc bij lage vergroting (10 9 objectieven) volgens de muizenhersenatlas [20], werden de TH-positieve cellen en TH/TUNEL dubbel-positieve cellen geteld bij een hogere vergroting ({{7} } doelstellingen) door twee waarnemers die blind zijn voor de behandeling. De verhouding van TH/TUNEL dubbel-positieve cellen tot TH-positieve cellen werd berekend.

Cistancheechinacoside heeftontstekingsremmendeigendommen

Statistische analyse

Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Eenrichtings-ANOVA gevolgd door post-hocanalyse met Tukey's HSD en de Student-Newman-Keuls meervoudige vergelijkingstest werden uitgevoerd voor statistische doeleinden. Een waarde van P \ 0.05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

ECH verlaagt ROS-producten en verzwakt

MPP1-Geïnduceerde apoptose

Van ECH is aangetoond dat het neuronen beschermt tegen apoptose in diermodellen, evenals de niveaus van pro-inflammatoire cytokines in neuroblastoomcellen [12]. Het blijft echter onduidelijk of ECH de neuronale apoptose geïnduceerd door MPP direct moduleert. Onze gegevens toonden aan dat ECH de proliferatie of dood van SH-SY5Y-cellen niet beïnvloedde (Fig. 1B), en hun morfologie bleef onveranderd (Fig. 1C). Interessant is dat, na blootstelling van SH-SY5Y-cellen aan MPP?, de overleving op een dosisafhankelijke manier toenam na ECH-behandeling (10-40 lg / ml) (Fig. 1B, C).

Eerdere studies hebben aangetoond dat MPP? remt specifiek de elektronentransportketen in mitochondriën en wordt ook geassocieerd met ROS-generatie [6, 21]. Met behulp van DCFH-DA als een fluorescerende sonde om veranderingen in ROS-niveaus te beoordelen, ontdekten we dat ECH de MPP?-geïnduceerde ROS-generatie duidelijk onderdrukte (Fig. 2A). Confocale microscopie onthulde dat de verminderde ROS-producten geassocieerd waren met ECH-niveaus (Fig. 2C). ECH bleek ook het celmembraan te beschermen tegen ROS en de MDA-niveaus, het eindproduct van lipideperoxidatie, te verlagen (Fig. 2B). Bij elkaar genomen,

ECH bevordert celoverleving door MPP?-geïnduceerde ROS-producten in neuronen te verminderen.

ECH onderdrukt ROS-stressgerelateerd/MPP1-geïnduceerde genexpressie en verhoogt GDNF

Expressie in MPP1-Behandelde cellen

Van ROS-producten is aangetoond dat ze de ongevouwen eiwitrespons stimuleren en de expressie van stressgerelateerde genen induceren, waaronder ATF3, ATF4 en CHOP [22]. ATF3 en CHOP spelen een bijzonder belangrijke rol bij door stress geïnduceerde neuronale apoptose [9, 23]. Abnormale a-synucleïne-expressie is ook een van de kritische markers in PD-pathologie [2]. Met behulp van qRT-PCR analyseerden we de expressie van ATF3, CHOP, SNCA en gliale cellijn afgeleide neurotrofe factor (GDNF) in de MPP? celmodel en vond dat MPP? de expressie van ATF3, CHOP en SNCA aanzienlijk verbeterd in vergelijking met de PBS-controlegroep. ECH had geen invloed op de expressie van deze genen in SH-SY5Y-cellen die niet waren behandeld met MPP?. ECH schafte echter hun MPP?-geïnduceerde expressie af (Fig. 3). Daarnaast MPP? onderdrukte aanzienlijk de expressie van GDNF in SH-SY5Y-cellen, maar ECH keerde dit fenomeen gedeeltelijk om (figuur 3B).

ECH remt de activering van MPP1-geïnduceerde caspase-3 in SH-SY5Y-cellen

Hoge niveaus van ATF3 en CHOP bevorderen direct neuronale apoptose [9, 23]. Onze gegevens toonden aan dat ECH de expressie van ATF3 en CHOP op een dosisafhankelijke manier remde (Fig. 4A). ECH blokkeerde ook MPP?-geïnduceerde caspase-3

activiteit (Fig. 4A, B). Immunofluorescentie-analyse van de gesplitste vorm van caspase-3 toonde verder aan dat ECH de expressie van het gesplitste caspase-3-eiwit in met MPP? behandelde cellen aanzienlijk verminderde (Fig. 4C).

ECH keert MPP1-geïnduceerde ATF3- en CHOP-accumulatie in SH-SY5Y-cellen om

Na blootstelling aan milieutoxines lokaliseren ATF3- en CHOP-eiwitten in het cytoplasma en de kern [24, 25], en dit leidt tot apoptose. Onze resultaten suggereerden dat MPP? behandeling verhoogde ATF3- en CHOP-expressie in de kern, en ECH verzwakte dit proces effectief (Fig. 5A, B). Western blotting analyse toonde aan dat MPP? duidelijk verhoogde niveaus van beide eiwitten in het cytoplasma en de kern. Interessant genoeg heeft ECH de MPP afgeschaft? effecten en onderdrukte ATF3- en CHOP-accumulatie in de kern (Fig. 5C-E).

ATF3 speelt een cruciale rol bij MPP1-geïnduceerde apoptose in SH-SY5Y-cellen

Van ATF3 is aangetoond dat het apoptose induceert in SH-SY5Y-cellen [23], en de resultaten van de huidige studie geven aan dat ECH ATF3-mRNA en eiwitexpressie geïnduceerd door MPP? aanzienlijk onderdrukt. in deze cellen. De rol van ATF3 bij apoptose en ECH-bescherming van celoverleving bleef echter onduidelijk. We gebruikten dus klein haarspeld-RNA (shRNA) specifiek voor ATF3 om dit te onderzoeken en vonden geen verschil in levensvatbaarheid tussen de ATF3-knockdown-groep en de controlegroep onder normale omstandigheden (Fig. 6A). Echter, ATF3-onderdrukking of ECH-behandeling heeft de morfologische veranderingen veroorzaakt door MPP aanzienlijk gered? (Fig. 6B). De ATF3-knockdown-cellen hadden een hogere levensvatbaarheid dan de controlegroep na blootstelling aan MPP? (Fig. 6C). De eiwitniveaus van CHOP en geactiveerd caspase-3 waren lager in ATF3-knockdown-cellen dan

in controlecellen met niet-specifiek shRNA (Fig. 6C, D). Deze gegevens gaven aan dat ATF3 een cruciale rol speelt in de door MPP? geïnduceerde apoptose van neuroblastoomcellen. Deze resultaten ondersteunen dus de hypothese dat ECH SH-SY5Y-cellen beschermt tegen MPP?-geïnduceerde effecten via downregulatie van de ROS/ATF3/CHOP-route. Interessant genoeg toonden onze gegevens aan dat ECH ook de MPP?-geïnduceerde toename van p53 en PUMA (p53-opgereguleerde modulator van apoptose) in SH-SY5Y-cellen remde (Fig. 7).

Cistancheechinacosideheeft een versterkend effectimmuniteit

ECH beschermt DA-neuronen tegen apoptose

Geïnduceerd door MPP1 in Vitro of door MPTP in Vivo

Om de werking van ECH bij PD te bevestigen, werden primaire DA-neuronen behandeld met MPP? of MPP? en ECH. Uit de in vitro experimenten bleek dat MPP? verminderde de levensvatbaarheid van DA-neuronen aanzienlijk en dit werd voorkomen door ECH

(Afb. 8). We hebben apoptose verder beoordeeld in DA-neuronen in de SNc na verschillende behandelingen bij muizen met MPTP-geïnduceerde PD en controles. In de controlegroep werden in dit gebied meer TH-positieve neuronen gevonden dan in de MPTP-groep (Fig. 9A). TUNEL-assays toonden aan dat NS en ECH geen apoptose induceerden in DA-neuronen in de SNc, maar MPTP wel en ECH beschermde de neuronen ertegen (Fig. 9B, S2). Interessant is dat western-blotting van lysaten van de SNc uit het muismodel van PD aantoonde dat de ATF3- en CHOP-eiwitniveaus ook werden verlaagd door ECH (Fig. 10).

Cistancheechinacosideheeft eenanti-apoptotisch effect