Deel 3: Een uniek muismodel van vroege levensoefeningen maakt hippocampusgeheugen en synaptische plasticiteit mogelijk

voor meer information:ali.ma@wecistanche.com

Materialen en methoden

Dieren. Wild-type muizen waren de nakomelingen van C57Bl6J-dammen, oorspronkelijk verkregen van Jackson Laboratories en verder gefokt in onze dierenfaciliteiten. Muizen hadden vrije toegang tot voedsel en water en lichten werden gehandhaafd op een licht / donker cyclus van 12 uur. Bij het spenen op een postnatale dag (P) 21 werden muizen gehuisvest in standaard beddingkooien of kooien uitgerust met een loopwiel. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt voor alle oefen- en gedragsexperimenten. Alleen mannelijke muizen werden gebruikt voor elektrofysiologische studies. Alle gedragstesten werden uitgevoerd tijdens de lichtcyclus. Experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Amerikaanse National Institutes of Health voor dierverzorging en -gebruik en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Californië, Irvine.

Cistanche-improve memory6

Klik omCistanche-effecten om het geheugen te verbeteren

Loopwiel paradigma. Bij het spenen op P21 werden muizen in standaardkooien zonder wiel ondergebracht of uitgerust met een mobiel of stationair roestvrijstalen loopwiel (diameter 4,5 cm, 112 gram, Starr Life Sciences). Dieren gehuisvest met loopwielen hadden vrije toegang voor vooraf bepaalde duur: ofwel een week tijdens de juveniele periode (P21-27; juv ELE), een week tijdens de adolescentie (P35-41; Adol ELE), of drie opeenvolgende weken toegang (P21-41; juv-adol ELE). Een extra groep muizen werd gehuisvest met een stationair wiel tijdens P21-41 (sta) om te controleren op omgevingsverrijking door de aanwezigheid van een wiel in de kooi. Elk wiel was uitgerust met een lichtgewicht polyurethaangaas om te voorkomen dat de kleine ledematen van gespeende muizen door de sporten van de wielen zouden glippen. Hardloopactiviteit werd gevolgd via digitaal bewaakte sensoren die waren aangesloten op een datapoort en computer voor real-time data-acquisitie (Vital View Sofware) via magnetische detectie van de wielomwentelingen. Elk digitaal bewaakt wiel hield de loopafstand voor de kooi bij (twee muizen gehuisvest per kooi, dus de afgelegde afstand per kooi vertegenwoordigt de totale afstand tussen twee muizen). Omwentelingen werden gekwantificeerd door de minuut per dag voor de duur van het hardlopen en omgezet in de afgelegde afstand per kooi (km).

the best herb for memory

Object locatiegeheugen(OLM) protocol. De locatie van het objectgeheugenprotocol dat in deze studie wordt gebruikt, is aangepast en aangepast ten opzichte van eerdere protocollen44. Op een postnatale dag 36 werden muizen naar een testruimte gebracht met verminderde helderheid van de kamer. Muizen werden behandeld gedurende ongeveer 2 minuten elk, gedurende een totaal van 5 opeenvolgende dagen vóór de OLM-trainingssessie (tweemaal daags gedurende de eerste 2 dagen gevolgd door eenmaal daags gedurende de volgende 3 dagen). Gewenningssessies waren 5 minuten, twee keer per dag gedurende 3 dagen (P38-P40) en vonden plaats in kamers met vier unieke ruimtelijke aanwijzingen op elke wand van de kamer (horizontale lijnen, zwarte X, verticale strook en blinde muur). Gewenning overlapte met de laatste 2 dagen van de behandeling. Tijdens de trainingsfase (P41) werden muizen in dezelfde kamers geplaatst met twee identieke objecten en blootgesteld aan een subthreshold (3 min) of threshold (10 min) trainingsperiode; een onderzoeksopzet op basis van eerder werk waaruit blijkt dat 3 minuten training doorgaans onvoldoende is voor de lange termijngeheugenformatie45. Voor muizen in oefenkooien werden loopwielen onmiddellijk na OLM-training vergrendeld om eventuele acute effecten van lichaamsbeweging opgeheugenconsolidatie. Op de testdag (P42; 24 uur nalooptraining) werd een van de objecten verplaatst naar een nieuwe locatie in de kamer en muizen mochten de objecten vervolgens gedurende 5 minuten verkennen. De tijd die met elk object werd doorgebracht, werd bepaald door blinde analyse door met de hand te scoren, en waarden verkregen op zowel trainings- als testdagen werden omgezet in een discriminatie-index (DI), gebaseerd op de nieuwe locatie van het object tijdens het testen: [(tijd besteed aan het verkennen van een nieuw object - tijd besteed aan het verkennen van bekend object) / (totale tijd om beide objecten te verkennen) × 100%]. Er waren geen significante verschillen ingeheugenprestaties tussen sedentaire dieren en dieren gehuisvest met een stationair wiel, dus deze groepen werden gecombineerd en weergegeven als "geen ELE" in alle OLM-analyses. Gewenningsproeven werden geanalyseerd op afgelegde afstand gedurende sessies met behulp van ANY-maze gedragsanalysesoftware (Stoelting Co). Muizen met ongelijke verkenningstijden tussen de twee objecten tijdens de trainingsfase (DI > 20) of die geen afname van de totale afgelegde afstand vertoonden tijdens gewenningssessies werden uitgesloten van de analyse.

Cistanche-improve memory1

Cistanche kan helpen het geheugen te verbeteren

elektrofysiologische studies. Elektrofysiologische experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven, en de bron van deze methoden is elders gepubliceerd66. Alleen mannelijke muizen werden gebruikt voor elektrofysiologische experimenten. Kortom, mannelijke muizen uit alle ELE-groepen werden geofferd tussen P42-51 en plakjes werden verzameld uit de rostrale hippocampus. Coronale plakjes werden gesneden (Leica VT1000 S) met een dikte van 320um en geplaatst in een interface-opnamekamer met voorverwarmde (31 ± 1 °C) kunstmatige hersenvocht (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 en 10 mM d-glucose). Plakjes werden continu geperfuseerd met een snelheid van 1,75-2 ml per minuut, terwijl het oppervlak van de plakjes werd blootgesteld aan warme, bevochtigde 95% O2 / 5% CO2. De opnames begonnen na minstens 2 uur incubatie. Field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP's) werden geregistreerd van CA1b stratum radiatum met behulp van een enkele glazen pipet (2-3 MΩ) gevlucht met 2 M NaCl. Stimulatiepulsen (0,05 Hz) werden geleverd aan Schafer collateral-commissururale projecties met behulp van een bipolaire stimulerende elektrode (gedraaide nichrome draad, 65 μm) gepositioneerd in CA1c. De stroomintensiteit werd aangepast om 50% van de maximale fEPSP-respons te verkrijgen. Nadat een stabiele uitgangswaarde was vastgesteld, werd LTP geïnduceerd met een enkele trein van fve theta-uitbarstingen, waarbij elke burst (vier pulsen bij 100 Hz) 200 ms uit elkaar werd afgeleverd (d.w.z. op theta-frequentie). De stimulatie-intensiteit werd niet verhoogd tijdens TBS. Gegevens werden verzameld en gedigitaliseerd door NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Teta Burst). Gegevens in het LTP-cijfer werden genormaliseerd tot de laatste 10 minuten van de uitgangswaarde en gepresenteerd als gemiddelde ± SE. Baseline-metingen op I / O-curven, gepaarde pulsfacilitering en LTP werden geanalyseerd met behulp van een tweerichtings ANOVA en lineaire regressieanalyse (Graphpad Prism 8-software).Cistanche kan helpen het geheugen te verbeteren.

Statistische analyses. Eenrichtings-ANOVAs werden gebruikt om het effect te analyseren van de timing van vroege oefeningen op OLM Acquisition DIs (Fig. 2d, g), OLM Testing DIs (Fig. 2e, h) en OLM Testing totale exploratietijden (Fig. 2f, i) binnen elk geslacht. Dunnett's post-hoc meervoudige vergelijkingen werden gebruikt om specifieke vergelijkingen te maken met de "geen ELE" (sedentaire) groep wanneer significante ANOVA-resultaten werden waargenomen. Tweeweg ANOVA werd gebruikt om het gewicht van muizen te analyseren dat tijdens de ELE-periode werd gewonnen (fig. 1b, factoren van ELE-groep en geslacht). Tweeweg herhaalde metingen (RM)-ANOVAs werden gebruikt om de dagelijkse hardloopafstand (Fig. 1c-e, factoren van postnatale dag en geslacht), gewenningssessies (Fig. 2b, c) te analyseren en om OLM acquisitie DI te vergelijken met het testen van DI voor elke muis voor vergelijkingen binnen de groep. Sidak's post hoc tests werden gebruikt om specifieke vergelijkingen te maken wanneer significante interacties of belangrijkste effecten van een hardloopgroep of OLM-sessie werden waargenomen. Daarnaast werd een drieweg ANOVA uitgevoerd voor OLM Testing DIs om significante interacties tussen drie nominale variabelen (OLM-trainingsduur, ELE-groep en geslacht) te bepalen. Voor zeldzame gevallen waarin 24-uurs hardloopgegevens voor een bepaalde dag niet werden geregistreerd, werden waarden toegerekend op basis van het nemen van de gemiddelde afstandsloop van de voorgaande drie dagen, om statistische analyses uit te voeren. Unpaired Student's t-tests werden gebruikt om de totale hardloopafstanden voor elke ELE-groep te analyseren (Fig. 1f-h), evenals het vergelijken van OLM-test-DA's tussen 3-min en 10-min getrainde sedentaire muizen. Cumulatieve hardloopafstanden worden uitgedrukt als middelen ± SD. De belangrijkste effecten en interacties voor alle ANOVAs worden beschreven in de tekst- en figuurlegendes, samen met het specifieke aantal dieren van elk geslacht dat in elk experiment wordt gebruikt. Alle analyses waren tweezijdig en vereisten een α waarde van 0,05 voor significantie. Foutbalken in alle cijfers vertegenwoordigen SEM. Voor alle experimenten werden waarden ±2 standaarddeviaties van het groepsgemiddelde als uitschieters beschouwd en uit analyses verwijderd. Alle statistieken werden uitgevoerd met GraphPad Prism 8 software. Totaal aantal muizen gebruikt in gedragsexperimenten = 152.

Cistanche-improve memory20

Cistanche kan helpen het geheugen te verbeteren

Ontvangen: 16 januari 2020; Geaccepteerd: 13 mei 2020;

Gepubliceerd: xx xx xxxx

Bevestigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke van de National Institutes of Health, onder toekenningsnummer K12NS098482 (toegekend aan AS) en de UC Irvine School of Medicine, Department of Pediatrics. We willen ook Dr. Marcelo Wood bedanken voor hun wetenschappelijke discussies en kritische input op het project.

Bijdragen van de auteur

A.S.I., T.Y., S.P., F.S. en T.V. voerden oefen- en gedragsexperimenten uit en analyseerden gegevens; E.K. voerde alle elektrofysiologische experimenten uit, analyseerde de gegevens en redigeerde het manuscript; A.S.I. ontwierp studie, analyseerde gegevens, interpreteerde resultaten en schreef het manuscript.

tegenstrijdige belangen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.