Deel: Door dereplicatie geleide isolatie van nieuwe door fenylpropanoïde gesubstitueerde diglycosiden van cistanche salsa en hun remmende activiteit op NO-productie in macrofaag
Mar 04, 2022
Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Een 3-methylbutenylgroep, een aglycon-substructuur, werd gesuggereerd door de COSY-correlaties van H-2 met H-1a en H-1b en de HMBC-correlaties tussen H{{ 4}} en H-5 en de olefinische koolstoffen, bij kC 120,7 (C-2) en 136,4 (C-3). Twee suikergroepen werden vastgesteld door de NMR-spectra-analyse en HPLC-spectra-analyse van het zuurhydrolysaat, met MS-fragmentpatroon. De absolute configuratie ervan werd bepaald als D-glucose en L-rhamnose met behulp van HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat [17]. Deze suikergroepen werden gedefinieerd als een -glucose en een a-rhamnose door constanten van de anomere protonen te koppelen. Het 1H-1H COSY-spectrum vertoonde sequentiële correlaties van H-13 tot H-63 en van H-133 tot H-633 (Figuur 4).
Een naar beneden verschoven glucoseproton bij kH 4,70 (H-43) suggereerde een acyl-substituent op glucose. Uit het HMBC-spectrum bevestigde de correlatie tussen H-43 en C-9333 de positie van de caffeoylsubstituent. De HMBC-correlaties tussen H-13 en C-1 (kC 64,5) en tussen H-33 (kH 3,68) en C-133 (kC 101,2) suggereerden de posities van elke substituent . Dienovereenkomstig werd de structuur van 6 bepaald als 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- glucose-pyranoside en genaamd cistansalside B.
Cistansalside C (12), een bruin amorf poeder, bleek de molecuulformule C26H38O13 te hebben volgens (plus)-HR-ESI-QTOF-MS, met een piek bij m/z 581,2213 [M plus Na] plus (berekend voor C26H38O13Na, 581.2205). Een kenmerkend ion bij m/z 163 suggereerde dat er een caffeoylsubstituent in de structuur bestond. De fragmentionen bij m/z 325 en m/z 471 suggereerden het bestaan van een rhamnose-eenheid en een glucose-eenheid.
Vergelijking van de NMR-spectra van 12 met die van 6 toonde aan dat ze vergelijkbaar waren met uitzondering van de aglyconstructuur. In de NMR-spectra van 12 werden twee paraffinische koolstoffen bij kC 38.0 (C-2) en 24,4 (C-3) waargenomen in plaats van twee olefinische koolstoffen bij kC 12{{16 }},7 (C-2) en 136,4 (C-3) in het aglycon van 6. De germinale methylgroepen (kH 0.88) in het aglycon van 12 waren naar boven verschoven ten opzichte van H-4 en H-5 (kH 1,71 en 1,63) in het aglycon van 6 (Tabel 2). Er werd gesuggereerd dat het aglycon van 12 een 3-methylbutylgroep was, wat werd bevestigd door de 1H en COSY NMR-spectra. Pieken van de 3-methylbutylgroep werden waargenomen bij 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) en 0,88 (H-4, 5).
Twee suikergroepen werden opnieuw bevestigd door de HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat en de NMR-spectra-analyse, evenals het MS-fragmentpatroon. De absolute configuraties van de suikers werden geïdentificeerd als D-glucose en L-rhamnose met behulp van HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat [17]. Een A-glucosegroep en een a-rhamnosegroep werden bevestigd door koppelingsconstanten van de anomere protonen. Het 1H-1H COSY-spectrum vertoonde sequentiële correlaties van H-13 tot H-53, van H-133 tot H-333, en van H{{11} } tot H-433 (Figuur 4).
De positie van substituenten werd bevestigd door middel van de HMBC-analyse. In het HMBC-spectrum zijn de correlaties tussen H-13 en C-1 (kC 67,2), tussen H-33 (kH 3,68) en C-133 (kC 101,2) en tussen H-43 (kH 4,70) en C-9333 (kC 165,7) werden gedetecteerd. Bijgevolg werd de structuur van 12 vastgesteld als 3-methylbutyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranoside en genaamd cistansalside C.
Cistansalside D (17), een amorf bruin poeder, bleek de molecuulformule C31H38O14 te hebben door de positieve modus hoge resolutie ESI-QTOF-MS, die een adductionpiek vertoonde bij m/z 657.2147 [M plus Na] plus (berekend voor C31H38O14Na, 657.2154). Fragmentionen waaronder een [M plus H x Aglycon x Rha x Acetyl Glc] plus ion bij m/z 147, een [M plus H x Aglycone x Rha] plus ion bij m/z 351 en een [M plus H x Aglycone] plus ion bij m/z 497 werden ook gedetecteerd. Een kenmerkend ion bij m/z 147 suggereerde dat een coumaroylsubstituent in zijn structuur aanwezig was. De fragmentionen bij m/z 351 en m/z 497 suggereerden het bestaan van een rhamnose-eenheid en een acetyl-gesubstitueerde glucose-eenheid.
Cistansalside uitcistanche kruid
Het 13C-NMR-spectrum onthulde de aanwezigheid van 31 koolstofatomen. Twee anomere protonen bij kH 4,61 (1H, m, H-13) en 4,60 (1H, s, H{{10}}) werden waargenomen in de 1H- en HSQC-spectra . Het 1H-NMR-spectrum duidde op de aanwezigheid van een methylgroep bij een 1,97 (3H, s, acetyl-CH3), een trans-olefine bij kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) en 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) en twee para-gesubstitueerde benzeenringen bij kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) en 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H-2, 6) en 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (Tabel 2) . Uit het HMBC NMR-spectrum zijn de correlaties tussen een carbonylkoolstofatoom bij kc 165,5 (C-9333) en H-8333 en tussen H-2333, 6333 en C-7333 (kc 145.4) suggereerde een (E)-coumaroylgroep. De HMBC-correlatie tussen een methylprotonpiek en een carbonylkoolstof bij kc 169,0 bevestigde de aanwezigheid van een acetylgroep.
Een 4-hydroxyfenylgroep werd gesuggereerd op basis van de HMBC-correlaties tussen H-3, 5 en quaternaire aromatische koolstofatomen bij kC 155,6 (C-4) en 128,6 (C-1) . Een gehydroxyleerde ethylgroep werd bevestigd door de COSY NMR-signalen bij kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) en 3,54 (1H, m, H-8b). De HMBC-correlaties tussen H-7 en C-1 (kC 128.6) en C-2, 6 (kC 129,7) suggereerden een 4-hydroxyfenylethylgroep, als een aglycon-substructuur.
Twee suikergroepen, gesuggereerd uit het MS-fragmentpatroon, werden opnieuw bevestigd door de HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat en NMR-spectra. D-glucose en L-rhamnose werden opgehelderd met behulp van HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat [17]. Een A-glucosegroep en een a-rhamnosegroep werden vastgesteld door koppelingsconstanten van de anomere protonen. Het 1H-1H COSY-spectrum vertoonde sequentiële correlaties van H-13 tot H-53 en van H-133 tot H-633 (Figuur 4).
Uit het 1H-NMR-spectrum suggereerde de verschuiving naar beneden van H-23 (kH 4,69) en H-43 (kH 4,80) de acyl-gesubstitueerde positie op glucose. De verbindingen tussen glucose en twee acylgroepen werden bevestigd door de HMBC-correlaties tussen H-43 (kH 4,80) en C-9333 en tussen H-23 en carbonylkoolstof van een acetylgroep (kC 169,0 ). De posities van een aglycon en rhamnose werden gegeven door de HMBC-correlaties tussen H-33 (kH 3,95) en C-1333 en tussen H-8 en C-13. Dienovereenkomstig werd de structuur van 17 toegewezen als 4-hydroxyfenylethyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- coumaroyl- -D-glucopyranoside en cistansalside D.
Cistansalside E (18) werd geïsoleerd als een amorf bruin poeder. De molecuulformule ervan werd bepaald als C31H38O14 op basis van 13C-NMR-gegevens en de positieve modus hoge resolutie ESI-QTOF-MS-piek bij m/z 657.2166 [M plus Na] plus (berekend voor C31H38O14Na, 657.2154). Bovendien werden ook fragmentionen gedetecteerd, waaronder een caffeoylion op m/z 163, een [M plus H x Aglycon x Rha] plus ion op m/z 367 en een [M plus H x Aglycone]ion op m/z 513. De fragmentionen suggereerden het bestaan van een rhamnose-eenheid en een acetyl-gesubstitueerde glucose-eenheid.
Het 1H-NMR-spectrum suggereerde de aanwezigheid van twee anomere protonen bij kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) en 4,60 (1H, s, H-133 ) en twee acyl-gesubstitueerde glucoseprotonen bij kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) en 4,81 (1H, dd, J=9,7 , 9,5 Hz, H-43). De 1H- en HMBC-spectra suggereerden het bestaan van een acetylgroep bij kH 1,94 (3H, s, acetyl-CH3), een (E)-caffeoylgroep bij kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) en 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) en een mono-gesubstitueerde benzeenring bij kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) en 7,20 (1H, m, H-4) (Tabel 2). Een fenylmethylgroep, een aglycon-substructuur, werd gesuggereerd door de HMBC-correlaties tussen H-7 (2H, kH 2,80, m) en C-1 (kC 138,8) en tussen H-7 en C -2, 6 (kC 128,9) en de GEZELLIGE NMR-signalen van H-7 met H-8a (1H, kH 3,99, m) en H-8b (1H, kH 3,63, m).
Twee suikergroepen werden opnieuw bevestigd door de HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat en NMR-spectra-analyse. De absolute configuraties van de suikers werden opgehelderd met behulp van HPLC-analyse van het zuurhydrolysaat, waarvan werd bevestigd dat het D-glucose en L-rhamnose was [17]. Een A-glucosegroep en een -rhamnosegroep werden vastgesteld door koppelingsconstanten van de anomere protonen. Het 1H-1H COSY-spectrum vertoonde sequentiële correlaties van H-13 tot H-53, van H-133 tot H-233, en van H{{11} } tot H-333 (Figuur 4).
Uit het HMBC-spectrum zijn de correlaties tussen H{{0}} en C-8 (kC 69.4), tussen H-23 en carbonylkoolstof van een acetylgroep (kC 169.1), tussen H-33 (kH 3,95) en C-133 (kC 102.0) en tussen H-43 (kH 4,81) en C-9333 (kC 165,6) bevestigden de positie van substituenten in de structuur. Daarom werd de structuur van 18 bepaald als fenylethyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside en genaamd cistansalside E.
De meeste trans-cinnamoyl-substituenten werden in vitro geïsomeriseerd tot de cis-isovorm. Van licht is gemeld dat het trans-kaneelzuurderivaten omzet in cis-isovormen [18,19]. Het evenwicht van de trans-cis-omzetting van de cinnamoyl-substituenten bleek ongeveer 70 procent van de isolaten in de trans-isovorm te houden. Voor de olefineprotonen van de cis-vorm, pieken bij ongeveer 6,90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) en 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) waren toewijsbaar in de 1H-NMR-spectra, terwijl pieken bij ongeveer 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) en 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) werden waargenomen voor transformatie [20]. In het 1H-NMR-spectrum van trans-cis-mengsels werden pieken voor twee olefinische protonen (H-7333 en H-8333) waargenomen in de verhouding van 7:3 (trans:cis). 13C-NMR-pieken van de cis-vorm waren vergelijkbaar met die van de transformatie.
Effectieve ingrediënten uit cistanche: acteosides
Alle isolaten werden getest op hun remmende effecten op door LPS geïnduceerde NO-productie in RAW
Alle isolaten werden getest op hun remmende effecten op door LPS geïnduceerde NO-productie in RAW 264.7-cellen. Dexamethason werd gebruikt als een positieve controle en de IC50 was 7.0 uM. Van de geteste verbindingen waren verbindingen 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{{ 24}}}} o 4.0 uM) en 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) vertoonden matige remmende activiteiten op induceerbaar NO-synthase, terwijl de andere verbindingen in deze test inactief waren (IC50 waarden > 100 uM). Om te verifiëren of deze verbindingen cytotoxiciteit hadden, werd de levensvatbaarheid van de cellen gemeten met behulp van MTT-assay. Als resultaat vertoonde geen van hen significante cytotoxiciteit (aanvullende figuur S 6-1). Deze vier verbindingen werden geselecteerd om te evalueren op hun remmende activiteit tegen de NF-KB-route in LPS-gestimuleerde RAW 264.7-cellen. Stimulatie van RAW 264,7-cellen met LPS induceerde de fosforylering van IKB en NF-KB (p65) na 0,5 uur incubatie. De fosforylering van NF-KB (p65) werd aanzienlijk verminderd door voorbehandeling met verbindingen 11, 13 en 18, zoals aangetoond door Western-blot-analyse (Figuur 5). Daarom kunnen verbindingen 11, 13 en 18 ontstekingsremmende effecten uitoefenen via de remming van NF-KB in macrofagen.
Figuur 5.Effect van vier verbindingen op fosforylering van IKB en NF-KB (p65) in LPS-gestimuleerde RAW 264.7-cellen. (A) De western-blots werden uitgevoerd in LPS en met monster behandelde RAW 264,7-cellen; (B, C) De immunoblot-signalen werden gekwantificeerd met behulp van Molecular Analyst / PC-densitometriesoftware (Bio-Rad, Richmond, CA, VS). Densitometrische analyse van gefosforyleerde isovormen wordt gerapporteerd. NF-KB in RAW 264.7-cel werd genormaliseerd naar het gehalte aan -actine.
3. Materialen en Methoden:
3.1. Algemeen experiment Procedure
Optische rotaties werden gemeten met een Jasco P-2000 digitale polarimeter (Jasco, Tokyo, Japan). UV-spectra werden opgenomen op een Chirascan plus circulaire dichroïsme-spectrometer (Chirascan, APL, VK). IR-spectra werden opgenomen met behulp van Jasco FT/IR-4200 spectrofotometer. Hoge resolutie elektrospray-ionisatie quadrupool-time-of-fight massaspectrometrie (HR-ESI-qTOF-MS) werd uitgevoerd op een Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS uitgerust met Agilent 1260 Infinity-serie (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, VS), en de gebruikte kolom was een Jasco SFCpak Crest C18T-5 kolom (id 150 4.6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software werd gebruikt voor data-acquisitie.
1D (1H en 13C) en 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-spectra werden verkregen met een Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 en Bruker AVANCE 800 HD-spectrometers in combinatie met een cryoprobe (Bruker, Ettlingen, Duitsland). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, VS) werd gebruikt als NMR-oplosmiddel en referentiepieken (kH 2,50 en kC 39,5). Kolomchromatografie (CC) werd uitgevoerd met Sephadex LH-20 (25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Zweden) of Kieselgel 60 silicagel (40-63 um, 230-400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Duitsland). Dunnelaagchromatografie (TLC) werd uitgevoerd op vooraf beklede Kieselgel 60 silicagel F254-platen (Art. 5715; Merck). Vlekken op TLC werden gedetecteerd met behulp van een UV-lamp bij 254 nm en 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Frankrijk). Vloeistofchromatografie met gemiddelde druk (MPLC) werd uitgevoerd op een RediSep 120 g silica-flitskolom (Isco, Lincoln, NE, VS) en Kiesegel 60 silicagel (40-63 um, 230-400 mesh, Art. 9385; Merck) met behulp van een Combiflash metgezel (Isco). Het systeem voor hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) was een Gilson HPLC uitgerust met een Gilson 321-pomp en UV.VIS 151-detector (Gilson, Middleton, WI, VS), met behulp van semi-preparatieve ODS-kolommen (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, VS; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Duitsland; Inno C18 kolom 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Het analytische RP-HPLC-systeem was een Waters 2695-alliantiesysteem met een 996 Photodiode Array (PDA) -detector (Waters Corp, Milford, MA, VS), en de gebruikte kolom was een Hypersil™ BDS C18-kolom (130 A, id 150: 4,6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). Mierenzuur werd gekocht bij Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). Oplosmiddelen van HPLC-kwaliteit werden gekocht bij Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). H2S04, Na2C03 en eersteklas oplosmiddelen voor extractie, fractionering en isolatie werden gekocht bij Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- en D-cysteïnemethylesterhydrochloride en o-tolylisothiocyanaat werden gekocht bij Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan).
3.2. Plant Materiaal
De hele planten vanCistanche salsa, die werden verzameld bij de Shinjang Uyghur, werden geïmporteerd via Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). Ze werden geïdentificeerd door Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Seoul, Korea). Het exemplaar van de voucher (SNUPH2016-03) is gedeponeerd in het Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Seoul National University.
3.3. Extractie en Isolatie
De gedroogde hele planten vanCistanche salsa(5,7 kg) werden gehakt en driemaal geëxtraheerd met MeOH (20 L) bij kamertemperatuur met sonicatie gedurende 99 minuten. Na verwijdering van het oplosmiddel onder vacuüm, werd het ruwe extract (1,35 kg) gesuspendeerd in H20 (5 L) en vervolgens verdeeld over EtOAc (5 L). Het EtOAc-residu (55,3 g) werd gescheiden in 16 fracties (E01-16) op silicagelchromatografie waarbij werd geëlueerd met CHC13 / MeOH (50: 1-0: 1, stap-gradiëntsysteem).
E08 (611,7 mg) werd onderworpen aan silicagel medium-druk vloeistofchromatografie (25 g) en geëlueerd met CHCl3/MeOH (18:1–0:1, stap-gradiënt systeem) en gaf 11 fracties (E08a-k). Uit E08g werden verbindingen 13 (0,7 mg) en 18 (0,6 mg) gezuiverd met behulp van een Luna 5 um HPLC-kolom en isocratische elutie met 28 procent aq. MeCN. HPLC-zuivering (Hypersil GOLD, 25 procent aq. MeCN) van E08h (138,5 mg) leverde verbindingen 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) en 17 (4,9 mg) op.
E09 (1,15 g) werd verder gezuiverd op een silica-MPLC-kolom (20 g) en geëlueerd met CHCl3/MeOH (10:1–0:1, stap- gradiëntsysteem) om 11 subfracties (E09a-k) te geven. E09e (398,7 mg) werd onderworpen aan Sephadex LH-20 (MeOH) en leverde acht subfracties op (E09e1-8). E09e6 werd vervolgens gezuiverd met behulp van een Hypersil GOLD HPLC-kolom (22% aq. MeCN) om verbinding 11 (0,4 mg) op te leveren. Uit E09e7 werd verbinding 5 (0,6 mg) gezuiverd door isocratische elutie van een Luna 5 urn HPLC-kolom met 40 procent aq. MeOH.
El0 (1,20 g) werd gescheiden in negen fracties (E10ai) op een Sephadex LH-20-kolom waarbij werd geëlueerd met MeOH. Uit El0g (147,5 mg) werden verbindingen 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) en 15 (5,0 mg) geïsoleerd door HPLC-scheiding (Inno, 23% aq. MeCN). Fractie E10h (470,0 mg) werd gezuiverd op een Hypersil GOLD-kolom door isocratische elutie (40 procent waterige MeOH) om verbindingen 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) en 16 (3,0 mg) op te leveren.
E11 (2,96 g) werd onderworpen aan Sephadex LH-20 en geëlueerd met MeOH om negen fracties (El la-i) te geven. E11e werd gescheiden door een Sep-Pak C18-patroon, waarbij stapsgewijs werd geëlueerd met 10 procent, 20 procent, 30 procent, 50 procent en 100 procent aq. MeOH leverde zeven fracties op (E11e1-7), gevolgd door Luna 5 um HPLC (28 procent waterige MeCN) om verbindingen 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) en 12 (1,2 mg) op te leveren.
E12 (19.0 g) werd onderworpen aan silica MPLC (120 g) met behulp van een CHCl3/MeOH stap-gradiëntsysteem om zes fracties te geven (18:1–0:1 , E12a-f). E12f werd gechromatografeerd op een Sephadex LH-20 kolom (MeOH), wat zeven fracties opleverde (E12f1-7). HPLC-zuivering (Hypersil GOLD, 25 procent aq. MeCN) van E12f7 leverde verbinding 2 (3,3 mg) op. Alle voor HPLC gebruikte oplosmiddelen waren 0,05% mierenzuurbuffer. De gebruikelijke stroomsnelheid voor HPLC- en MPLC-chromatografie was respectievelijk 3 en 40 ml/min.
3.4.Karakterisering
Cistansalside A (5): bruin amorf poeder; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH)Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (netjes) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) en 13C-NMR (200 MHz) gegevens, zie Tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (berekend voor C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): bruin amorf poeder; [ |20 x 72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH)Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (netjes) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) en 13C-NMR (125 MHz) gegevens, zie Tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (berekend voor C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): bruin amorf poeder; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH)Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (netjes) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) en 13C-NMR (200 MHz) gegevens, zie Tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (berekend voor C26H38O13Na, 581.2205).
Cistansalside D (17): bruin amorf poeder; [ |20 x 51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (netjes) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) en 13C-NMR (75 MHz) gegevens, zie Tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657.2147 (berekend voor C31H38O14Na, 657.2154).
Cistansalside E (18): bruin amorf poeder; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH)Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (netjes) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) en 13C-NMR (200 MHz) gegevens, zie Tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657.2166 (berekend voor C31H38O14Na, 657.2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analyse
Chromatografische massaspectrometrie-analyse werd uitgevoerd op een Agilent 1260 Infinity-serie LC-systeem (Agilent Technologies, Inc., VS). De analytische kolom was een SFCpak Crest C18T-5 kolom (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 urn, Jasco, Japan). De mobiele fase bestond uit 0,1 procent (v/v) mierenzuur in MeCN (A) en water (B) met een gradiëntelutie van 0-35 min (23 procent A), 35-45 min ( 23-28 procent A), 45-75 min (28 procent A) en 75-80 min (90 procent A). De stroomsnelheid werd op 0,3 ml/min gehouden. De absorptie werd gemeten bij 320 nm. De omstandigheden van de ESI-bron waren als volgt: drooggas (N2) stroomsnelheid, 10 L/min; drooggastemperatuur, 350 graden; vernevelaar, 30 psig; mantelgasstroomsnelheid, 12,0 l/min; schede gas temperatuur, 350 graden; capillair, 4000 V; skimmer, 60 V; octapool RF, 750 V; fragmentorspanning, 180 V; positieve modus. Het systeem werd bediend onder Masshunter-werkstationsoftware. Het massabereik was ingesteld op m/z 50-1000.
3.6.Zuur Hydrolyse
Verbindingen werden gehydrolyseerd met 1 N H2S04 (100 ul) verwarmd met een waterbad op 90 graad gedurende 2 uur, daarna geneutraliseerd met verzadigde waterige Na2C03-oplossing. Nadat de oplossingen onder een stroom N2 waren gedroogd, werden de producten en standaardsuikers (D-Glc, L-Glc, L-Rha) opgelost in pyridine (100 µl) dat L-cysteïnemethylester-hydrochloride (0,5 mg) bevat. Een L-rhamnose-monster werd opgelost in pyridine (100 µl) dat D-cysteïnemethylester-hydrochloride (0,5 mg) bevatte. Daarna werden ze gedurende 1 uur op 60 graden verwarmd. De oplossingen werden behandeld met 1 ul (1,11 mg) o-tolylisothiocyanaat, die opnieuw 1 uur op 60 graden werden verwarmd. Elk eindmengsel werd direct geanalyseerd door analytische RP-HPLC (HypersilTM BDS C18-kolom, 17 procent waterig MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 graden). De tR van de piek bij 21,9 en 40,4 min viel samen met die van respectievelijk het thiocarbamoylthiazolidinederivaat van D-glucose en L-rhamnose.
3.7. Cel Cultuur
Muizenmacrofagen, RAW 264.7, werden verkregen van het Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Daejeon, Korea) en gekweekt in RPMI-medium dat 10 procent foetaal runderserum en 100 U/ml penicilline/streptomycinesulfaat bevatte. Cellen werden geïncubeerd in een bevochtigde 5 procent CO2-atmosfeer bij 37 graden.
3.8.Drugs en chemicaliën
RPMI, penicilline en streptomycine werden gekocht bij HyClone (Logan, UT, VS). Runderserumalbumine en LPS werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, VS).
3.9.Meting van GEEN productie
De nitrietconcentratie in het kweekmedium werd gemeten als een indicator van NO-productie volgens de Griess-reactie. De cellen werden uitgezaaid met 2:105 cellen/putje in kweekplaten met 96-putjes. Na voorincubatie van de RAW 264,7-cellen gedurende 18 uur, werden de cellen voorbehandeld met verbindingen (50 uM, 10 uM, 5 uM of 1 uM) en gestimuleerd met LPS (500 ng/ml) gedurende 24 uur. h. Testverbindingen opgelost in DMSO. Cellen werden ook behandeld met 0,05% DMSO als dragercontrole. RAW 264,7-cellen (2: 105 cellen/putje) werden gekweekt in 96-putjesplaten met RPMI zonder fenolrood en 0,5 uur voorbehandeld met monsters. Cellulaire NO-productie werd geïnduceerd door de toevoeging van 500 ng/ml eindconcentratie LPS en een incubatie van 24 uur. Na incubatie werd 100 ul geconditioneerd medium gemengd met hetzelfde volume Griess-reagens en gedurende 15 minuten geïncubeerd. De absorptie van het mengsel bij 540 nm werd gemeten met een ELISA-microplaatlezer (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, VS). De verkregen waarden werden vergeleken met die van standaardconcentraties van natriumnitriet opgelost in RPMI, en de concentraties van nitriet in de geconditioneerde media van met monster behandelde cellen werden berekend.
3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay voor levensvatbaarheid van cellen
Cellen werden uitgezaaid in {{0}}putjesplaten met een dichtheid van 5:104 cellen/putje en geïncubeerd met serumvrij medium in aanwezigheid van monsters. Testverbindingen opgelost in DMSO. Cellen werden ook behandeld met 0,05% DMSO als dragercontrole. Na incubatie gedurende 24 uur werd 10 µl MTT (5 mg/ml in zoutoplossing) toegevoegd en de incubatie werd nog eens 4 uur voortgezet. Mitochondriaal succinaatdehydrogenase in levende cellen zet MTT tijdens incubatie om in zichtbare formazankristallen. De formazankristallen werden vervolgens opgelost in dimethylsulfoxide en de absorptie werd gemeten bij 540 nm met behulp van een microplaatlezer met enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). De relatieve levensvatbaarheid van de cellen werd berekend in vergelijking met de absorptie van de onbehandelde controlegroep. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
3.11.Immunoblot-analyse
Eiwitexpressie werd bepaald door western blotting volgens standaardprocedures. Kortstondig werden RAW264.7-cellen gekweekt in kweekschalen van 6{{20}} mm (2:106/ml), gevolgd door voorbehandeling van 50 uM verbindingen . Cellen werden tweemaal gewassen in ijskoude PBS (pH 7,4), de celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer op ijs gedurende 15 minuten en het celafval werd vervolgens verwijderd door centrifugeren. De eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van Bio-Rad-eiwitassayreagens volgens de instructies van de fabrikant. Eiwit (20-30 ug) werd 1:1 gemengd met 2: monsterbuffer (20 procent glycerol, 4 procent SDS, 10 procent 2- ME, 0,05 procent broomfenolblauw en 1,25 M Tris [pH 6,8]), geladen op 8 of 15 procent SDS-PAGE-gels en 90 minuten bij 150 V gelopen. Cellulaire eiwitten werden overgebracht op Immunoblot polyvinylideendifluoridemembranen (Bio-Rad) met behulp van een Bio-Rad semi-droog overdrachtsysteem volgens de instructies van de fabrikant. De membranen werden vervolgens overnacht geïncubeerd met de respectievelijke p-NF-KB, NF-KB, pI入B en -actine primaire antilichamen (Abcam, Cambridge, VK) in Tris-gebufferde zoutoplossing die 5 procent magere melk en 0,1 procent Tween bevat. 20. De volgende dag werden de blots driemaal gewassen met Tris-gebufferde zoutoplossing (0,1 procent Tween 20) en 1 uur geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair anti-IgG-antilichaam (verdund 1:2000–1 : 20.000). De blots werden opnieuw driemaal gewassen met Tris-gebufferde zoutoplossing (0,1 procent Tween 20) en immunoreactieve banden werden ontwikkeld met behulp van het chemiluminescente substraat ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, VS).
3.12.Statistische analyse
Experimentele gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde van SEM. Het niveau van statistische significantie werd bepaald door variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Dunnett's t-test voor meerdere vergelijkingen.p Waarden kleiner dan 0.05 werden als significant beschouwd.
Cistanche salsa-extract
4. conclusies
In deze studie hebben we de structuren geïsoleerd en opgehelderd van vijf nieuwe fenylpropanoïde-gesubstitueerde glycosiden, cistansalside AE genaamd (5, 6, 12, 17 en 18), naast het isoleren en identificeren van 13 bekende verbindingen, met behulp van een dereplicatiestrategie. De bekende verbindingen zijn lipedoside AI (1) [21], 23-acetylacteoside (2) [22], isocistanoside C (3) [15], osmanthuside B (4) [21], epimeridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] en salsaside F (16) [6]. Hun structuren werden vastgesteld door de analyse van uitgebreide spectroscopische gegevens en door vergelijking met gerapporteerde gegevens in de literatuur. Er werd bevestigd dat voorlopig voorspelde structuren van fenylpropanoïde-gesubstitueerde glycosiden correct overeenkwamen met hun werkelijke structuren.
Voordeel van Cistanche salsa-extract
Referenties
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Onderdrukking van SOS-inducerende activiteit van Trp-P -1 door vetzuren van Cistanche salsa in de Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu-test. nat. Prod. Let. 1997, 10, 261-265. [Kruisref]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; Een, H.-J. Anti-proliferatie-effecten van Cistanches-salsa op de progressie van goedaardige prostaathyperplasie. Kan. J. Fysiol. Pharmacol. 2016, 94, 104-111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Snelle discriminatie van Herba-cistanches door meerstaps infrarood macrovingerafdrukken gecombineerd met zachte onafhankelijke modellering van klassenanalogie (SIMCA). Spectrochim. Acta Deel A Mol. Biomol. Spectros Cistanche2013, 114, 421-431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Differentiatie van Herba-cistanches door vingerafdruk met hoogwaardige vloeistofchromatografie-diode-array-detectie-massaspectrometrie. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156-2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Studies over de bestanddelen van Cistanchis Herba. V. Isolatie en structuren van twee nieuwe fenylpropanoïde glycosiden, Cistanosides E en F. Chem. apotheek Stier. 1985, 33, 1452-1457. [Kruisref]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nieuwe Glycosiden van Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79-85. [Kruisref]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Samenstellingsstudie van fenolische verbindingen van Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, groeiend in de Republiek Kazachstan. J. Chem. apotheek Onderzoek 2015, 7, 120-122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Verbeterde accumulatie van fenylethanoïde glycosiden door voorlopervoeding aan suspensiecultuur van Cistanche-salsa. Biochem. Ing. J. 2007, 33, 88-93. [Kruisref]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsa-extract werkt op dezelfde manier als eiwitgebonden
polysacharide-K (PSK) op verschillende soorten cellijnen. J. Traditie. Med. 2008, 25, 166-169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Fenylethaanglycosiden van Cistanches-salsa remmen apoptose die wordt veroorzaakt door 1-methyl-4-fenylpyridinium-ionen in neuronen. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59-63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nieuwe concepten, experimentele benaderingen en dereplicatiestrategieën voor de ontdekking van nieuwe fyto-oestrogenen uit natuurlijke bronnen. Planta Med. 2013, 79, 514-532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Door dereplicatie geleide isolatie van depsides theaflavines ST en lecanora DF van de endofytische schimmel Setophoma sp. Fytochemie 2015, 111, 154-162. [CrossRef] [PubMed]
13. Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferatieve en antiplasmodiale verbindingen van geselecteerde Streptomyces-soorten. Bioorg. Med. Chem. Let. 2015, 25, 5646-5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Door dereplicatie geleide isolatie van nieuwe hepatoprotectieve triterpenoïde saponinen uit Celosiae-semen door middel van hoogwaardige vloeistofchromatografie in combinatie met elektrospray-ionisatie tandem quadrupool-vluchttijd-massaspectrometrie. J. Farm. biomed. Anaal. 2017, 132, 148-155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. LTQ-Orbitrap-gebaseerde strategie voor traditionele Chinese geneeskunde gericht op het ontdekken van klassen, identificatie en haar omics-onderzoek: een casestudy over fenylethanoïde glycosiden in drie verschillende soorten Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [Kruisref]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. De bestanddelen van Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolatie en structuren van een nieuwe fenylethanoïde glycoside en een nieuwe neolignan-glycoside. Chem. apotheek Stier. 1990, 38, 1927-1930. [Kruisref]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Gemakkelijke discriminatie van aldose-enantiomeren door HPLCistancheChem met omgekeerde fase. apotheek Stier. 2007, 55, 899-901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, VS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Studie van cis-kaneelzuur in Arabidopsis thaliana. Planten Fysiol. Biochem. 2005, 43, 929-937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-evenwicht van hydroxykaneelzuren tijdens bestraling van waterige oplossingen bij verschillende pH. Fytochemie 1967, 6, 755-758. [Kruisref]
