Deel Ⅰ Verbetering van de bloedureumstikstof en serumcreatinine met behulp van nieuwe cultivatie van Cordyceps Militaris

Abstract

Chronische nierziekte (CKD) is een kritiek probleem voor de volksgezondheid met een enorme financiële last voor zowel patiënten als de samenleving wereldwijd. Helaas zijn er momenteel geen effectieve therapieën om de progressie van nierziekte in het eindstadium (ESRD) te voorkomen of te vertragen. Traditionele Chinese geneeskundepraktijken hebben aangetoond dat Cordyceps militaries (C. militaries) mycelia een verscheidenheid aan farmacologisch bruikbare eigenschappen heeft, waaronder antitumor, immunomodulatie en hepatoprotectie. Het effect van myceliale C.-militairen op CKD blijft echter onduidelijk. methoden. Hier onderzochten we de effecten van C. militaris mycelia op muizen met CKD met behulp van vier soorten media: HKS, HKS met vitamine A (HKS plus A), CM en CM met vitamine A (CM plus A). Resultaten. Uit de resultaten op dag 10 bleek dat de niveaus van bloedureumstikstof (BUN) significant lager waren in de groepen HKS (41 procent), HKS plus A (41 procent) en CM plus A (34 procent) in vergelijking met die in de overeenkomstige controlegroepen (nefrectomiemuizen). Het serumcreatininegehalte in de HKS plus A-groep daalde met 35 procent op dag 10, terwijl de niveaus in de HKS- en CM plus A-groepen op dag 30 slechts met respectievelijk 14 procent en 13 procent afnamen. is het eerste rapport dat vier nieuwe media gebruikt (HKS, HKS plus A, CM en CM plus A medium) voor C. militaris mycelia. Elk medium van myceliale C.-milities op CKD vertoont een specifiek effect op BUN, serumcreatinine, lichaamsgewicht, totaal eiwit en urinezuur. Conclusies. Alles bij elkaar genomen, is dit het eerste rapport dat gebruik maakt van vier nieuwe media (HKS, HKS plus A, CM en CM plus A medium) voor C. militaris mycelia. Elk medium van myceliale C.-milities op CKD vertoont specifieke effecten op BUN, serumcreatinine, lichaamsgewicht, totaal eiwit en urinezuur. We concludeerden dat behandeling met C. militaris mycelia gekweekt in HKS- of CM plus A-medium mogelijk de verslechtering van de nierfunctie bij muizen met CKD zou kunnen voorkomen.

Trefwoorden

Chronische nierziekte (CKD), Cordyceps Sinensis, Mycelium, Bloedureumstikstof (BUN), Serumcreatinine,Cistanche-voordelen.

Klik hier om te krijgende effecten van Cistanche

Invoering

Chronische nierziekte (CKD) is een veel voorkomend wereldwijd gezondheidsprobleem [1]. CKD is een algemene term voor heterogene aandoeningen die de nierstructuur en -functie aantasten [2]. Patiënten met CKD hebben een verhoogd risico op eindstadium nierziekte (ESRD) [3, 4]. Bestaande farmacologische middelen richten zich op de complicaties die verband houden met CKD-behandelingen, zoals hyperlipidemie, diabetes en hypertensie, in plaats van specifiek CKD zelf te behandelen [5-8], waardoor de studie van nierbescherming een opkomende medische wetenschap wordt. Eerdere studies hebben zich gericht op homeodomein-interacterende proteïnekinase 2 (HIPK2) omdat het een transcriptionele regulator is van genexpressie die betrokken is bij tubulair letsel en fibrose [9, 10]; specifieke HIPK2-remmers zijn echter niet in de handel verkrijgbaar. Bovendien is aangetoond dat het blokkeren van het renine-angiotensine-aldosteronsysteem zowel het risico op progressie van hyperkaliëmie als het recidiefpercentage vermindert [11, 12]. Hoewel het renine-remmende geneesmiddel aliskiren voorheen regelmatig naast angiotensine-converterende enzymremmers of angiotensine-receptorblokkers werd toegediend, wordt het nu conservatiever gebruikt vanwege de ernstige bijwerkingen [13].

Er is gemeld dat de risicofactoren voor chronische nierziekte leeftijd, ras, zwaarlijvigheid, diabetes, laag geboortegewicht, hoge bloeddruk en familiegeschiedenis waren [14]. Het risico op morbiditeit en mortaliteit door CKD blijft aanzienlijk hoog, waarbij CKD-patiënten gewoonlijk nierfunctievervangende therapie krijgen, zoals dialyse en niertransplantatie. .us moeten nieuwe behandelingen worden ontwikkeld. In de afgelopen jaren hebben kruidentherapieën een alternatieve behandelingsoptie voor CKD geboden [15, 16]. Bovendien hebben veel soorten onderzoek aangetoond dat de juiste voorschriften voor Chinese kruidengeneesmiddelen een positief effect hebben op CKD, wat het risico op ESRD bij patiënten met CKD aanzienlijk kan verminderen en de overlevingskans op lange termijn van patiënten met CKD kan verbeteren [17]. Zo is de werkzaamheid van verschillende kruiden, waaronder Radix Astragali, Rheum officinale, Panax ginseng en Lycopus lucidus, op nierziekten onderzocht [18-21]. Sommige kruiden hebben veelbelovende resultaten laten zien bij het verminderen van proteïnurie of het verhogen van serumalbumine. Andere bevatten echter toxische ingrediënten, zoals aristolochiazuur of zware metalen, die de nierfunctie nadelig kunnen beïnvloeden en nefropathie kunnen veroorzaken [22]. Hoewel ze in sommige ontwikkelingslanden vaak worden gebruikt, blijven rapporten over hun werkzaamheid controversieel. Daarom is de ontwikkeling van een doeltreffende verbinding afgeleid van een natuurlijk product voor de behandeling van CKD een dringende zorg.

Cordyceps behoort tot de schimmelfamilie en is een vorm van traditionele Chinese geneeskunde waarin parasitaire insectenlarven groeien en geleidelijk veranderen in een volwassen vruchtlichaam. Cordyceps sinensis (C. sinensis) en Cordyceps militaries (C. militaries) zijn twee bekende Cordyceps-soorten. Gedurende vele jaren werd C. sinensis gebruikt om vermoeidheid, nier- en longdisfunctie, hyperglykemie, hyperlipidemie en aritmie te behandelen [23], en de effecten ervan bij CKD-patiënten en ontvangers van een niertransplantatie zijn bestudeerd [24-26]. Over het algemeen is C. militaris relatief vatbaar voor massaproductie [27] en vertoont zowel diverse als specifieke farmacologische eigenschappen [28-30]. Bovendien onderzocht een eerdere studie uitgevoerd door onze groep de antikankerfuncties van C. militaris en toonde aan dat de myceliale fermentatie de mitogeen-geactiveerde eiwitkinasen (MAPK) signaalroute zou kunnen reguleren om de celcyclus te stoppen, chromosomale DNA-afbraak te stimuleren en uiteindelijk veroorzaken zowel apoptotische als autofagische dood van gekweekte glioblastoomcellen [31]. Daarom zou C. militaris in dit onderzoek worden gebruikt vanwege zijn renoprotectieve effecten.

Mycelial C. militaris is recent ontwikkeld als een populair functioneel voedingsmiddel in Azië. Extracten van het vruchtlichaam van C. militaris zouden de progressie van nierfunctiestoornis veroorzaakt door subtotale nefrectomie aanzienlijk kunnen vertragen [32]. Studies naar het effect van C. militaris mycelia op CKD zijn echter zeldzaam. Deze studie zal onze hypothese testen dat mycelium C. militaris mogelijk de verslechtering van de nierfunctie bij muizen met CKD kan voorkomen. Er zullen vier soorten media worden ontworpen en gebruikt om myceliale C.-militaries te incuberen: (i) HKS, (ii) HKS plus A, (iii) CM en (iv) CM plus A. Gedurende 30 dagen muizen in de behandelingsgroepen zullen dagelijkse toediening krijgen door orale sondevoeding van C. militaris mycelia gekweekt in een van de vier verschillende media, terwijl de muizen in de schijncontrole (C) en nefrectomiecontrole (Nx) groepen gedestilleerd water zullen krijgen. Verwacht wordt dat deze tests de veiligheid van mycelium C. militaris als functioneel voedingsmiddel zullen verduidelijken.

Cistanche tubulosa

Materialen en methodes

1. Materialen.

C. militaris mycelia (BCRC 32219) werden gekocht bij het Bioresource Collection and Research Center van het Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Glucose werd gekocht bij JT Baker (EU). Moutextract, pepton en gistextract werden gekocht bij Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, VS). Vitamine A werd gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS) en agar werd gekocht bij respectievelijk High Standard Enterprise Co., Ltd. (Taiwan). Biochemische testkits voor detectie van de nierfunctie werden verkregen van Arkray (Kyoto, Japan).

2. Fungus Media Voorbereiding.

Mycelial C. militaris werd geïncubeerd in vier soorten media, namelijk CM, CM plus A, HKS en HKS plus A. Het CM-medium bevatte 2 procent moutextract, 2 procent agar, 0.1 procent pepton, en 2 procent glucose [33]. .e HKS-medium was een modificatie van een medium bedacht door prof. Huang Keng-Shiang en bevatte 2 procent moutextract, 2 procent agar, 0.2 procent pepton en 0.2 procent gistextract . .e CM- en HKS-media verschilden in de concentraties van het pepton en het gistextract. .e HKS plus A- en CM plus A-media bevatten elk 1 procent extra vitamine A in het basismedium. Een vierkant van 00,5 × 00,5 cm C. militaris-mycelium werd uitgesneden en op elke plaat getransplanteerd en bij 25 graden geïncubeerd. Nadat de C. militaris gedurende 30 dagen in de verschillende media was gekweekt, werden de schimmelmycelia voorzichtig met een mes van het oppervlak van het vaste medium geschraapt. De verzamelde schimmelmyceliapoeders werden gevriesdroogd (EYELA FDU-1100) in een vacuüm bij -54 graden gedurende 48 uur. De gevriesdroogde C. militaris mycelia-poeders werden tot gebruik bij -20 graden bewaard.

3. Constructie van CKD-muizenmodel.

De vijfzesde nefrectomie was de meest gevestigde chronische procedure die progressief nierfalen nabootst na het verlies van niermassa. .e CKD-muizen werden gevestigd na een tweestaps, vijfzesde nefrectomie zoals eerder beschreven [34, 35]. In het kort werd de linker nier blootgelegd en aan de bovenste en onderste eenderde pool doorgesneden. .e 2/3 van de extrarenale takken van de nierslagader van de linker nier werden afgebonden en daarna volgde een volledige rechter nefrectomie na een week. De dieren werden na de operatie gedurende ten minste twee weken teruggezet in hun kooien voordat uremie werd geïnduceerd. .e procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van I-Shou University (goedkeuringsnummer: IACUC-ISU- 101025).

4. Experimentele procedure.

Gevriesdroogde poeders van C. militaris mycelia werden gedrenkt in gedestilleerd water (10 mg/ml) bij kamertemperatuur. Twee weken na de tweede nefrectomie werden de muizen willekeurig verdeeld in behandelingsgroepen (n=4 tot 6 per groep) en behandeld met een van de vier typen van de C. militaris mycelia-oplossingen, geïncubeerd in HKS, HKS plus A , CM of CM plus A-medium, door orale sondevoeding gedurende 30 opeenvolgende dagen. De sham-groep en de Nx-muizen kregen het equivalente volume gedestilleerd water toegediend zonder C. militaris mycelia. Het lichaamsgewicht werd gemeten en er werden bloedmonsters afgenomen op respectievelijk dag 1, 10 en 30. Aan het einde van de behandelingsperiode werden de muizen opgeofferd met behulp van CO2. De nieren werden ontleed en gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing en in 10 procent neutraal gebufferde formaline geplaatst voor daaropvolgende histologische verwerking. Bloedmonsters werden verzameld uit de periorbitale veneuze sinus. Bloedureumstikstof (BUN), serumcreatinine, totaal eiwit en urinezuur werden gemeten met in de handel verkrijgbare kits met behulp van een geautomatiseerde biochemische analysator (SPOTCHEM EZ SP-4430) volgens de instructies van de fabrikant (Arkary, Inc., Kyoto, Japan).

Gestandaardiseerde Cistanche

5. Dierenvoeding.

Mannetjesmuizen van het Institute of Cancer Research (ongeveer 30 g) werden geleverd door BioLASCO Taiwan Co., Ltd. en werden in standaardkooien gehouden bij een constante temperatuur van 22 ± 1 graad met een licht-donkercyclus van 12- uur. De dieren werden ad libitum gevoerd met normaal muizenvoer en leidingwater. De dieren die in deze studie werden gebruikt, werden gehuisvest en verzorgd door de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

6. Biochemische analyse van bloedmonsters.

Bloedmonsters werden verzameld uit de periorbitale veneuze sinus. Plasmamonsters werden gecentrifugeerd bij 12,000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 graden en opgeslagen bij -20 graden vóór analyse. Bloedureumstikstof (BUN), serumcreatinine, totaal eiwit en urinezuur werden gemeten met in de handel verkrijgbare kits met behulp van een geautomatiseerde biochemische analysator (SPOTCHEM EZ SP-4430) volgens de instructies van de fabrikant (Arkary, Inc., Kyoto, Japan).

7. Nier histologische analyse.

De nieren van de muizen werden ingebed in paraffineblokken, ontleed in secties van 3-μm dik en behandeld met Harry's hematoxyline-eosine (HE)-kleuring volgens de standaardprocedure. De glomeruli en tubuli van de nier werden onderzocht en gefotografeerd voor toekomstige analyse. Beelden werden vastgelegd met behulp van een kleurenvideocamera (VKC150, Hitachi, Tokyo, Japan) aangesloten op een microscoop (DP72, Olympus, Center Valley, PA, VS) en blindelings geanalyseerd door een ervaren patholoog. Het gemiddelde van de glomerulaire dwarsdoorsnede werd verkregen door het gemiddelde oppervlak van ongeveer 8 tot 15 individuele glomeruli te berekenen met behulp van het programma Image J.

8. Statistische analyse.

Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (n=4 tot 6 per groep). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van een tweewegs variantieanalyse gevolgd door Bonferroni post hoc tests (SigmaPlot versie 10.0, San Jose, CA, VS). p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Cistanche-extract

Referenties

[1] K. Kalantar-Zadeh en D. Fouque, "Nutritionele behandeling van chronische nierziekte", New England Journal of Medicine, vol. 377, nee. 18, blz. 1765-1776, 2017.

[2] TK Chen, DH Knicely en ME Grams, "Diagnose en beheer van chronische nierziekte", JAMA, vol. 322, nee. 13, blz. 1294–1304, 2019.

[3] P. Cockwell en L.-A. Fisher, ".e wereldwijde last van chronische nierziekte,": e Lancet, vol. 395, nee. 10225, blz. 662-664, 2020.

[4] P. Rossignol, ZA Massy, ​​M. Azizi, et al., ".e dubbele uitdaging van resistente hypertensie en chronische nierziekte,": e Lancet, vol. 386, nee. 10003, blz. 1588-1598, 2015.

[5] AS Levey en J. Coresh, "Chronische nierziekte,": e Lancet, vol. 379, nee. 9811, blz. 165-180, 2012.

[6] RJ Johnson, C. Wesseling en LS Newman, "Chronische nierziekte met onbekende oorzaak in landbouwgemeenschappen", New England Journal of Medicine, vol. 380, nee. 19, blz. 1843-1852, 2019.

[7] T. Yang, EM Richards, CJ Pepine en MK Raizada, ".e darmmicrobiota en de hersen-darm-nier-as bij hypertensie en chronische nierziekte," Nature Reviews Nephrology, vol. 14, nee. 7, blz. 442-456, 2018.

[8] S. Joshi, M. McMacken en K. Kalantar-Zadeh, "Plantaardige diëten voor nierziekte: een gids voor clinici", American Journal of Kidney Diseases, vol. 77, nee. 2, blz. 287-296, 2021.

[9] A. Pisciottani, L. Biancolillo, M. Ferrara et al., "HIPK2 fosforyleert het microtubule-afbrekende enzym spastin bij S268 voor abscissie", Cells, vol. 8, nee. 7, p. 684, 2019.

[10] MM Nugent, K. Lee en JC He, "HIPK2 is een nieuw medicijndoelwit voor antifibrosetherapie bij nierziekte," Frontiers in Physiology, vol. 6, p. 132, 2015.

[11] PE Drawz en ME Rosenberg, "De progressie van chronische nierziekte vertragen", Kidney International Supplements, vol. 3, nee. 4, blz. 372-376, 2013.

[12] MR Weir, GL Bakris, DA Bushinsky, et al., "Patiromeer bij patiënten met een nierziekte en hyperkaliëmie die raasremmers krijgen", New England Journal of Medicine, vol. 372, nee. 3, blz. 211-221, 2015.

[13] M. Azizi en J. M'enard, "Renineremmers en cardiovasculaire en nierbescherming: een eindeloze zoektocht?" Cardiovasculaire geneesmiddelen en: therapie, vol. 27, nee. 2, blz. 145-153, 2013.

[14] K. Al-Jewari, R. Baban en J. Manuti, "Serum en urinaire oplosbare Klotho-spiegels bij patiënten met chronische nierziekte", Baghdad Journal of Biochemistry and Applied Biological Sciences, vol. 2, nee. 01, blz. 29-38, 2021.

[15] S. Prakash, GT Hernandez, I. Dujaili en V. Bhalla, "Loodvergiftiging door een ayurvedisch kruidengeneesmiddel bij een patiënt met chronische nierziekte", Nature Reviews Nephrology, vol. 5, nee. 5, blz. 297-300, 2009.

[16] AA Razmaria, "Chronische nierziekte", JAMA, vol. 315, nee. 20, blz. 2248, 2016.

[17] M.-Y. Lin, Y.-W. Chiu, J.-S. Chang et al., "Associatie van voorgeschreven gebruik van Chinese kruidengeneesmiddelen met het risico op eindstadium nierziekte bij patiënten met chronische nierziekte," Kidney International, vol. 88, nee. 6, blz. 1365-1373, 2015.

[18] A. Zuk en JV Bonventre, "Acute nierbeschadiging", Annual Review of Medicine, vol. 67, nee. 1, blz. 293-307, 2016.

[19] Y. Zhong, MC Menon, Y. Deng, Y. Chen en JC He, "Recente vorderingen in de traditionele Chinese geneeskunde voor nierziekte", American Journal of Kidney Diseases, vol. 66, nee. 3, blz. 513-522, 2015.

[20] SW Lim, KC Doh, L. Jin, et al., "Ginseng-behandeling verzwakt autofagische celdood bij chronische cyclosporine-nefropathie," Nefrology, vol. 19, nee. 8, blz. 490-499, 2014.

[21] Y. Yao, J. Yang, D. Wang, et al., ".e waterig extract van Lycopus lucidus Turcz verbetert door streptozotocine geïnduceerde diabetische nierbeschadiging via remmende TGF- 1-signaalroute", Phytomedicine, vol . 20, nee. 13, blz. 1160-1167, 2013.

[22] L. Wu, W. Sun, B. Wang, et al., "Een geïntegreerd systeem voor het identificeren van de verborgen huurmoordenaars in traditionele medicijnen die aristolochiazuren bevatten", Scientific Reports, vol. 5, nee. 1, artikel-ID 11318, 2015.

[23] GM Shashidhar, P. Giridhar en B. Manohar, "Functionele polysacchariden van medicinale paddenstoel Cordyceps sinensis als een krachtig voedingssupplement: extractie, karakterisering en therapeutische mogelijkheden - een systematische review", RSC Advances, vol. 5, nee. 21, blz. 16050-16066, 2015.

[24] T. Hong, M. Zhang en J. Fan, "Cordyceps sinensis (een traditioneel Chinees medicijn) voor ontvangers van een niertransplantatie," Cochrane Database of Systematic Reviews, vol. 10, artikel-ID CD009698, 2015.

[25] HW Zhang, ZX Lin, YS Tung, et al., "Cordyceps sinensis (een traditioneel Chinees medicijn) voor de behandeling van chronische nierziekte", Cochrane Database of Systematic Reviews, vol. 18, artikel-ID CD008353, 2014.

[26] G. Shao, S. Zhu en B. Yang, "Toepassingen van kruidengeneeskunde voor de behandeling van autosomaal dominante polycystische nierziekte", Frontiers in Pharmacology, vol. 12, artikel-ID 629848, 2021.

[27] C.-T. Lee, K.-S. Huang, J.-F. Shaw, et al., "Trends in de immunomodulerende effecten van Cordyceps militaris: totale extracten, polysacchariden en cordycepin," Frontiers in Pharmacology, vol. 11, artikel-ID 575704, 2020.

[28] B.-L. Hij, Q.-W. Zheng, L.-Q. Guo et al., "Structurele karakterisering en immuunversterkende activiteit van een nieuw polysaccharide met een hoog molecuulgewicht van Cordyceps militaris", International Journal of Biological Macromolecules, vol. 145, blz. 11-20, 2020.

[29] X.-C. Liu, Z.-Y. Zhu, Y.-L. Tang et al., "Structurele eigenschappen van polysacchariden van gecultiveerde vruchtlichamen en mycelium van Cordyceps militaris," Carbohydrate Polymers, vol. 142, blz. 63-72, 2016.

[30] H.-J. Park, "Ethanolextract van Cordyceps-militairen gekweekt op gekiemde sojabonen remt 2, 4-dinitrofenol-fluorbenzeen-geïnduceerde allergische contactdermatitis," Journal of Functional Foods, vol. 17, blz. 938-947, 2015.

[31] C.-H. Yang, Y.-H. Kao, K.-S. Huang, C.-Y. Wang, en L.-W. Lin, "Cordyceps militaris en myceliumfermentatie geïnduceerde apoptose en autofagie van menselijke glioblastoomcellen", Cell Death & Disease, vol. 3, nee. 11, blz. e431, 2012.

[32] SK Das, M. Masuda, A. Sakurai en M. Sakakibara, "Geneeskrachtige toepassingen van de paddenstoel Cordyceps-militairen: huidige staat en vooruitzichten", Fitoterapia, vol. 81, nee. 8, blz. 961-968, 2010.

[33] LS Wang, CY Wang, CH Yang, et al., "Synthese en antischimmeleffect van zilveren nanodeeltjes-chitosan composietdeeltjes", International Journal of Nanomedicine, vol. 10, blz. 2685-2696, 2015.

[34] R. Poesen, K. Windey, E. Neven, et al., "De invloed van CKD op het microbiële metabolisme in de dikke darm", Journal of the American Society of Nephrology, vol. 27, nee. 5, blz. 1389-1399, 2016.

[35] S.-C. Wang, C.-H. Yang, AM Grumezescu, et al., "Renoprotective effects of shout kamfer Medicinal Mushroom (Taiwanofungus camphorates, Basidiomycetes) Mycelia op verschillende media bij muizen met chronische nierziekte," International Journal of Medicinal Mushrooms, vol. 18, nee. 12, blz. 1105-1114, 2016.

Chih-Hui Yang, 1,2,3Wen-Shuo Kuo,4 Jun-ShengWang,2Yi-Ping Hsiang,3,5Yu-Mei Lin,1,6 Yi-Ting Wang, 1,6 Fan-Hsuan Tsai,6 Chun- Ting Lee,6,7 Jiun-Hua Chou,1 Huei-Ya Chang,1 Lung-Shuo Wang, 6,8 Shu-Chi Wang, 6,9 en Keng-Shiang Huang 6

1 Afdeling Biologische Wetenschap en Technologie, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan

2 Taiwan Instrument Onderzoek Instituut, Nationaal Toegepast Onderzoek Laboratoria, Hsinchu, Taiwan

3 Apotheekafdeling van E-Da Hospital, Kaohsiung, Taiwan

4 School of Chemistry and Materials Science, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing, China

5 Afdeling Biotechnologie en Chemische Technologie, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan

6 School of Chinese Medicine voor post-baccalaureaat, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan

7 Amulette Chinees Geneeskunde Kliniek % 2c Taipei% 2c Taiwan

8 Afdeling Chinese Geneeskunde, Sin-Lau Hospital, Tainan, Taiwan

9 School of Medicine voor internationale studenten, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan