Deel Ⅰ De ijzerchelator, PBT434, moduleert transcellulaire ijzerhandel in microvasculaire endotheelcellen in de hersenen

Abstract

IJzer en andere overgangsmetalen, zoals koper en mangaan, zijn essentieel voor het ondersteunen van de hersenfunctie, maar overaccumulatie is cytotoxisch. Deze overmatige ophoping van metalen, met name ijzer, komt vaak voor bij verschillende neurologische aandoeningen; deze omvatten de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ataxie van Friedrich en andere aandoeningen die zich presenteren met neurodegeneratie en daarmee samenhangende ijzerstapeling in de hersenen. Het beheer van de ijzerstroom door de bloed-hersenbarrière vormt de eerste verdedigingslinie tegen de overaccumulatie van ijzer bij normale fysiologie en deze pathologische aandoeningen. In deze studie hebben we vastgesteld dat de ijzerchelator PBT434, die momenteel wordt ontwikkeld voor de behandeling van de ziekte van Parkinson en meervoudige systeematrofie, de opname van ijzer door microvasculaire endotheelcellen van de menselijke hersenen (hBMVEC) moduleert door chelatie van extracellulair Fe^{2 plus}. Behandeling van hBMVEC met PBT434 resulteert in een toename van de hoeveelheid transcripten voor transferrinereceptor (TfR) en ceruloplasmine (Cp). Western-blot- en ELISA-analyses onthullen ook een overeenkomstige toename van de eiwitten. Binnen de cel verhoogt PBT434 het detecteerbare niveau van liefdadig, labiel Fe^{2 plus}; gegevens geven aan dat deze Fe^{2 plus}komt vrij uit ferritine. Bovendien versterkt PBT434 de ijzeruitstroom, waarschijnlijk als gevolg van de toename van ferro-ijzer in het cytosol, het substraat voor de ijzerexporteur, ferroportine. PBT434 komt snel en bidirectioneel in evenwicht over een hBMVEC-bloed-hersenbarrière. Deze resultaten geven aan dat het PBT{4}}ijzercomplex geen substraat is voor hBMVEC-opname en ondersteunen dus een model waarin PBT434 interstitieel ijzer zou cheleren en de heropname van ijzer door endotheelcellen van de bloed-hersenbarrière zou remmen, zoals en remmen de opname ervan door de andere cellen van de neurovasculaire eenheid. Over het algemeen presenteert dit een nieuw en veelbelovend mechanisme voor therapeutische ijzerchelatie.

Klik hier om te krijgenwat zijn de voordelen van Cistanche

Invoering

Metaalchelatietherapie (MCT) wordt al lang gebruikt als behandeling voor overgangsmetaalvergiftiging en voor genetische stoornissen in het metabolisme van een essentieel metaalion dat leidt tot overaccumulatie van het metaal [1–3]. Twee voorbeelden van het laatste zijn de hyperaccumulatie van koper bij de ziekte van Wilson [4] en van ijzer bij erfelijke hemochromatose [5]. Zowel koper als ijzer zijn katalysatoren van oxidatieve stress en zijn dus cytotoxisch bij concentraties die het vermogen van de cel en het organisme om deze redox-actieve overgangsmetalen te 'begeleiden' te boven gaan [6, 7]. Met name ijzeraccumulatie is grotendeels idiopathisch; inderdaad, een toename van ijzer is een kenmerk van een verouderend brein [8-10]. Pathologisch gezien is deze ijzeraccumulatie in de hersenen een kenmerk van mutaties in genen die geen verband houden met het ijzermetabolisme [11-15], evenals een verscheidenheid aan andere neurodegeneratieve ziekten, waarvan sommige een specifieke genetische link missen, zoals veroudering [16], de ziekte van Alzheimer [ 17], ataxie van Friedreich [18] en de ziekte van Parkinson [19]. Als een groep kunnen dergelijke aandoeningen worden beschouwd als neurodegeneratie met hersenijzeraccumulatie (NBIA), hoewel dit acroniem gewoonlijk beperkt is tot die waarvoor een genetische link is geïdentificeerd [11, 13, 14].

In het geval van ijzerstapeling is het doel om het lichaam te 'reinigen' van overtollig ijzer als gevolg van een defect in de opname of uitstroom van ijzer in de cel. Hier is het doel om fysiologische ijzerchelatoren te verslaan met het medicijn; een verbinding met een goede farmacokinetiek en een hoge affiniteit voor ferro-ijzer is het doelgeneesmiddel. Aangezien het lichaam te vol zit met het essentiële metaal, is er weinig reden tot bezorgdheid over het ontstaan ​​van een tekort tijdens de behandeling. Het behandelen van hersenziekte met ijzerchelatietherapie vereist een andere strategie. Dit is geen probleem van systemische ijzerstapeling, maar van ijzerophoping in pathologische gebieden met schadelijke gevolgen stroomafwaarts. Leeftijdsgebonden ijzeraccumulatie bij de ziekte van Parkinson (PD) draagt ​​bijvoorbeeld mogelijk bij aan oxidatieve stress-gerelateerde cellulaire schade [20]. Overmatig labiel ijzer bevordert de verkeerde vouwing van -synucleïne in substantia nigrale neuronen. Het gebruik van een chelator met hoge affiniteit kan leiden tot enige vermindering van de ijzerbelasting in de hersenen, maar zal zeer zeker een ijzertekort veroorzaken dat in ieder geval bij de oudere bevolking gecontra-indiceerd is gezien het systemische ijzertekort dat veel voorkomt in die leeftijdsgroep [21]. . Een chelator met een optimale affiniteit heeft het potentieel om ijzerophoping te verminderen, evenals de daarmee gepaard gaande oxidatieve stress als gevolg van overtollig labiel ijzer en onderliggende ziekteprocessen.

Cistanche tubulosaEnCistanche's effecten

Een chelator die is goedgekeurd voor gebruik bij de behandeling van door transfusie veroorzaakte ijzerstapeling bij thalassemiepatiënten is deferipron (DFP, merknaam Ferriprox) [5, 22]. DFP is ook gebruikt bij de behandeling van ataxie van Friedreich [23] en de ziekte van Parkinson [24, 25]. In een meta-analyse is aangetoond dat DFP zorgt voor significante verlagingen van het myocardiaal ijzergehalte en voor een betere bescherming van het hart bij thalassemiepatiënten dan deferoxamine, de klassieke ijzerchelaatvormer [5]. Aan de andere kant wordt DFP snel gemetaboliseerd door de lever [26] en recenter werk heeft aangetoond dat het Fe2 plus cheleert op de actieve plaats van ijzerafhankelijke histon-lysine-demethylasen, een activiteit die correleert met een voorheen niet-herkende cytotoxiciteit [27]. Deze bevinding onderstreept een belangrijke beperking in het gebruik van ijzerchelatietherapie, namelijk competitie door het medicijn voor fysiologisch essentieel ijzer, of het nu in een ijzeropslag is of een eiwit dat een prothetische ijzersoort herbergt. Desalniettemin heeft DFP bijvoorbeeld werkzaamheid aangetoond in een fase 2-onderzoek naar de behandeling van de ziekte van Parkinson, zoals blijkt uit zowel analytische (verminderde ijzerbelasting in de hersenen door T2- gewogen MRI) als gedragsindices (cognitieve en motorneuronfunctie) [ 24, 25].

De affiniteit van DFP voor Fe3 plus blijft echter een punt van zorg. De stabiele DFP-ijzersoort is het tris-complex, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Hoewel de neutraliteit van dit complex ideaal is om ijzer uit de cel te mobiliseren, maakt de stabiliteitsconstante ervoor, ~1037, DFP tot een echte ijzervanger; in deze context is de remming van een ijzerenzym zoals lysine demethylase voorspelbaar [27]. Deze bezorgdheid weerspiegelt de noodzaak om ijzerchelatoren te ontwikkelen die de membraanpermeabiliteit van DFP hebben, maar een aanzienlijk zwakkere affiniteit voor zowel Fe2 plus als Fe3 plus. Dit laatste kenmerk beperkt het wegvangen van medicijnen door prothetisch metaal en het thermodynamische potentieel van de chelaatvormer om de ferro-ijzer auto-oxidatie te katalyseren die resulteert in de productie van reactieve zuurstofspecies. In wezen katalyseren sterke ferri-ijzerchelatoren de pro-oxidanteigenschap van Fe2 plus [29]. In deze studie rapporteren we hoe zo'n ijzerchelator met matige ferri- en ferro-ijzeraffiniteiten de ijzerstroom in de microvasculaire endotheelcellen van de hersenen moduleert die de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​vormen.

Cistanche-pillen

Dit medicijn, PBT434 [5,7-dichloor-2-((methylamino)methyl)-8-hydroxy-3-methylchinazoline-4 (3H)-on, Fig 1A] , vormt een bis-ijzercomplex met logstabiliteitsconstanten van ~11 en ~15 voor Fe^{2 plus}en Fe^{3 plus}, respectievelijk [30]. PBT434 voorkwam het verlies van substantia nigra pars compacta (SNpc)-neuronen, verlaagde de accumulatie van nigral-synucleïne, verlaagde het PD-ziektemodelgerelateerde ijzergehalte in de middenhersenen en herstelde de motorische prestaties in twee muismodellen van de ziekte van Parkinson zonder enige duidelijke uitputting van systemische ijzervoorraden [30]. PBT434 is ook werkzaam in muizenmodellen van Multiple System Atrophy (MSA) [30, 31], een motorische stoornis vergelijkbaar met de ziekte van Parkinson, maar die wordt gekenmerkt door verkeerd gevouwen synucleïne en daaropvolgende accumulatie die de vorming van gliale cytoplasmatische insluitsels veroorzaakt die het kenmerk zijn pathologie van de ziekte [32]. Het is veelbetekenend dat PBT434 markers van oxidatieve stress verminderde in PD-modellen van muizen [30], wat aangeeft dat 1) PBT434 gericht was op ijzervoorraden die anders waren voorbereid om als pro-oxidanten te functioneren en 2) PBT434 deze ontluikende op oxidatie gebaseerde cytotoxiciteit niet versterkte. PBT434 heeft een fase 1-studie naar tevredenheid afgerond [33].

Het hier gepresenteerde werk was bedoeld om de impact van PBT434 op de ijzerhandel in de barrièrecellen van de hersenen te onderzoeken, de microvasculaire endotheelcellen die samen met de onderliggende gliacellen de bloed-hersenbarrière vormen. Deze onderzoeken hebben een goed gevalideerde onsterfelijk gemaakte endotheliale cellijn gebruikt in zowel monolaag- als transwell-kweekformaten [34-37]. Het primaire doel van deze studies was om de kinetiek van ijzeropname en -efflux van deze cellen en hun modulatie door PBT434 te bepalen. Het transwell BBB-model werd ook gebruikt om de bidirectionele PBT434 transcellulaire flux over de endotheelcelbarrière aan te tonen. Het model demonstreerde in moleculaire termen dat PBT434 de ijzeropname door chelatie remt en tegelijkertijd de ijzeruitstroom stimuleert. Cell imaging-onderzoeken geven aan dat PBT434 toegang heeft tot dezelfde labiele ijzerpool die wordt gesondeerd door een klassiek Fe^{2 plus}chelaatvormer, 2,2'-bipyridine of bipyridyl, en een fluorescerende sonde voor ferro-ijzer. De resultaten suggereren een mogelijk werkingsmechanisme voor PBT434, waaronder remming van de opname van systemisch ijzer bij de BBB en daaropvolgende opslag van hersenijzer in de interstitiële ruimte.

Resultaten

1. PBT434 heeft geen cytotoxische effecten op microvasculaire endotheelcellen in de hersenen

Om een ​​geschikt bereik van werkconcentraties voor PBT434 in onze in vitro celkweek te bepalen, hebben we de MTT-assay gebruikt om de mitochondriale functie van hBMVEC te volgen in reactie op PBT434. Op basis van eerdere rapporten [30] zijn ze gedurende 24 uur behandeld met een reeks PBT434-concentraties tot 100 μM. We hebben geen significante veranderingen waargenomen in de levensvatbaarheid van hBMVEC bij elke geteste concentratie (figuur 2).

2. PBT434 wordt snel opgenomen en verhandeld over de hBMVEC-barrière

PBT434 is een oraal biologisch beschikbaar geneesmiddel dat gemakkelijk de bloed-hersenbarrière kan binnendringen, zoals blijkt uit studies uitgevoerd bij muizen en mensen [30, 38, 39]. We volgden de accumulatie van PBT434 in hBMVEC gekweekt in monolagen met behulp van 14C-gelabeld PBT434 als een radiotracer. De gegevens gaven aan dat in de eerste fase 14C-PBT434 snel in evenwicht kwam tussen het opnamemedium en de cel. Deze initiële opname werd gevolgd door een extra langzame accumulatie gedurende 3 uur die een snelheid vertoonde van 30,1 ± 9,8 pmol/mg/u (figuur 3A). In het opnameprotocol wordt de opname gedoofd en worden de cellen gewassen bij 4 °C voordat ze worden verwerkt voor accumulatie van 14C-PBT434 (methoden). In een afzonderlijk experiment onderzochten we de uitstroom van 14C-PBT434 uit hBMVEC na een laadperiode van 30 minuten. In het effluxprotocol worden cellen gewassen bij 25˚C. De gegevens in Fig. 3B geven aan dat in de 25˚C-wassing ongeveer 92 procent van het celgeaccumuleerde 14C-PBT434 verloren ging (vgl. 550 pmol 14C-PBT434/mg eiwit in 3A in 30 min tot 43 pmol 14C-PBT434/mg eiwit op t=0 in 3B). Er was nog een langzaam verlies van de resterende 14C-PBT434 (figuur 3B). De gegevens suggereren twee aspecten van de accumulatie en uitstroom van PBT434 door hBMVEC. Flux door het plasmamembraan bereikt snel wat een evenwicht lijkt te zijn, of het nu tijdens opname of efflux is. In beide processen verschijnt er echter nog een langzamer proces. Dit suggereert dat binnen de cel een fractie van cel-PBT434 zich in een locale/toestand bevindt die in een kinetische stabiele relatie staat met de fractie die in evenwicht is met het extracellulaire milieu. De kinetische analyse vermeld in figuur 3B schatte dat deze pool van PBT434 werd vertegenwoordigd door 27 ± 4 pmol / mg eiwit in het cellysaat wanneer cellen werden behandeld met 20 μM reagens.

Om de transcellulaire flux van PBT434 te onderzoeken, hebben we een goed gevalideerd in vitro BBB-model gebruikt dat is gegroeid aan de apicale zijde van een transwell-membraan [35, 36, 40, 41]. De barrière-eigenschappen van deze transwell-culturen werden geverifieerd door kwantificering van hun transendotheliale elektrische weerstand (TEER) en ondoordringbaarheid voor FITC-gelabeld dextran (S1 Fig). We vergeleken de opname van 14C-PBT434 aan de luminale (of apicale, bloedzijde) (figuur 4A) met de opname aan de abluminale (of basolaterale, hersenzijde) (figuur 4C) membraan. In hetzelfde experiment werd de overeenkomstige efflux (transcellulaire flux) gekwantificeerd door het verschijnen van 14C-PBT434 in de effluxkamer (Fig. 4 panelen B en D). De snelheden van deze processen worden gegeven in Tabel 1. De massagegevens geïllustreerd in Fig. 4 (panelen B en D) laten zien dat de netto flux van PBT434 door dit model bloed-hersenbarrière hetzelfde was in de twee richtingen. Er was 976 ± 185 pmol 14C-PBT434 opgehoopt in de basale kamer (figuur 4B) en 1033 ± 210 pmol gekwantificeerd in de basale kamer (figuur 4D). Deze bijna gelijkwaardigheid kwam ook tot uiting in de sterk vergelijkbare snelheden van PBT434-efflux bij de twee barrièremembranen (Tabel 1). Er was echter een significant grotere opname van PBT434 bij het basolaterale membraan in dit barrièremodel, zoals geïllustreerd door het ~50 procent grotere verlies van verbinding uit de basale kamer (figuur 4C) dat overeenkwam met een ~40 procent hogere snelheid van schijnbare celopname (Tafel 1). Een robuustere opname zou naar verwachting resulteren in een grotere accumulatie. Analyse van de cellen na 3 uur toonde aan dat ze ~ 6 μM PBT434 vasthielden, ongeacht de fluxrichting. De waarden waren 8,1 ± 1,3 μM (apicaal tot basaal) en 4,7 ± 1,2 μM (basaal tot apicaal). Zoals hierboven opgemerkt, volgt deze analyse het wassen van de cellen vóór lysis en kwantificering van totaal celeiwit en 14C-PBT434. Bovendien bevatte het medium in de apicale kamer RPMI plus 10 procent FBS en 10 procent NuSerum, terwijl de basale 'hersenkamer' alleen RPMI (Methods) bevatte. Een redelijke conclusie was dat de grotere 'opname' bij het basale membraan een weerspiegeling was van een celoppervlakadsorptie van PBT434 die in de apicale kamer beperkt was door de aanwezigheid van eiwitcomponenten in het serum. Na het wassen van de cellen voor accumulatie van PBT434, werd dit geadsorbeerde materiaal (dat zich registreerde als 'opname') verwijderd. Herhaling van dit flux-experiment maar met serum in de basale kamer toonde aan dat serum inderdaad deze waarschijnlijke PBT434-adsorptie op het celoppervlak onderdrukte (S2 Fig).

3. PBT434 beperkt, in tegenstelling tot bipyridyl, de intracellulaire beschikbaarheid van labiel ijzer niet

Omdat PBT434 een meer gematigde affiniteit heeft voor ijzer in vergelijking met klassieke ijzerchelatoren zoals deferipron of bipyridyl, hebben we onderzocht hoe dat verschil werd weerspiegeld in het PBT434-effect op de cellulaire labiele ijzerpool (LIP) van hBMVEC. Om dit te doen, hebben we gebruik gemaakt van de doorlatende Fe^{2 plus}-specifieke fluorescerende kleurstof FerroOrange, die reageert met liefdadig cytoplasmatisch ijzer. We zagen een significante ablatie van fluorescentie in cellen bij behandeling met bipyridyl, consistent met de chelatie van de LIP door deze ferro-ijzerchelator met hoge affiniteit en blokkeerde zo de werking van de fluorescerende ijzerindicator (figuur 5A). Daarentegen concurreerde PBT434 niet met FerroOrange voor Fe^{2 plus}, een gedrag dat consistent is met zijn meer gematigde affiniteit [30]. De resultaten toonden aan dat PBT434, maar niet de PBT{2}}met inactieve afgeleide, een toename van 34 ± 9 procent veroorzaakte in FerroOrange-toegankelijk Fe^{2 plus}wat suggereert dat dit chelaatvormer ijzer in de cel mobiliseerde zonder gelijktijdige toxiciteit. De hieronder gepresenteerde gegevens suggereren dat dit ijzer afkomstig was van ferritine.

Van PBT434 is eerder aangetoond dat het de uitgeputte ferroportine-eiwitexpressie in met MPTP behandelde muizen herstelt tot een niveau dat vergelijkbaar is met dat van niet-beschadigde muizen [30]. Dit resultaat, samen met de toename van intracellulaire ferro-ijzerkleuring als reactie op PBT434, suggereerde een mogelijk effect op het cellulaire ijzerresponssysteem en de functie van stroomafwaartse ijzergerelateerde eiwitten. Om dit te beoordelen, hebben we eerst kwantitatieve PCR (qPCR) -analyse uitgevoerd van het PBT434-effect op de overvloed aan transcripten voor verschillende ijzerbehandelende eiwitten (figuur 6). Hoewel de transcripten voor het ijzerefflux-eiwit, ferroportine (Fpn), en de twee cytoplasmatische ijzerchaperonnes, PCBP1 en 2 onaangetast waren, deed de overvloed aan mRNA's voor de transferrinereceptor (TfR) en de ferroxidase, ceruloplasmine (Cp) dat wel. wijziging. TfR- en Cp-transcripties zijn respectievelijk 2,8 en 3,6-voudig toegenomen. De expressie van de transferrinereceptor (TfR) is gekoppeld aan het op ijzer reagerende element (IRE)/ijzerregulerende proteïne (IRP)-systeem [42-44]. De toename in TfR-mRNA suggereert dat PBT434 concurreert met de PCBP{18}}afhankelijke levering van ijzer voor de assemblage van het Fe, S-cluster dat het regulerende IREBP omzet van een RNA-bindend eiwit in cytosolische aconitase [45]. PBT434 verschuift dus deze regulerende modulatie naar RNA-binding en de overeenkomstige remming van TfR-mRNA-afbraak. Bij ijzertekort in de cel wordt de Cp-expressie gedeeltelijk gereguleerd door HIF-1 [46]. Een toename van de HIF-1-functie volgt uit de knock-down van de hydroxylering ervan door prolylhydroxylase-activiteit in een ijzerafhankelijke reactie [47]. Net als in het geval van de IREBP lijkt PBT434 de hoeveelheid ijzer te verminderen die dient als een co-factor bij HIF-1-hydroxylering en -afbraak. In dit model verhoogt de toename van het steady-state niveau van deze transcriptionele activator de Cp-transcriptie.

Met behulp van een combinatie van ELISA-analyse en Western-blotting onderzochten we de expressie van ijzerbehandelende eiwitten in met PBT434 of PBT{2}met behandeld hBMVEC; voorbeelden van de WB-analyses worden gegeven in figuur 7A. De gegevens toonden aan dat de overvloed aan TfR-monomeer en -dimeer significant was toegenomen met 24 uur, evenals Cp (Fig. 7B en 7C). Beide verhogingen liepen parallel met de PBT{7}}afhankelijke toename in de respectieve transcripten (Fig. 6). Daarentegen was de expressie van het ijzerefflux-eiwit, Fpn, ongevoelig voor behandeling met PBT434 (Fig. 7D).

We gebruikten ELISA als een aanvullende methode om de vouwveranderingen te kwantificeren die worden aangegeven door de Western-blot-gegevens. Aldus werden hBMVEC gedurende 24 uur behandeld met PBT434 en werden cellysaten getest met ELISA op TfR (Fig. 8A). De voudige toename van TfR als reactie op PBT434-behandeling, gekwantificeerd door ELISA, was equivalent aan die verkregen door analyse van de Western-blots (figuur 7B). ELISA werd ook gebruikt om de overvloed aan uitgescheiden en GPI-gekoppelde Cp-eiwitten te beoordelen, met behulp van HepG2-cellen als een positieve controle. Wat betreft Cp uitgescheiden in groeimedia, was deze benadering beperkt doordat de sCp-abundantie in zowel HepG2- als hBMVEC-geconditioneerde media op of onder de onderste gevoeligheidslimiet van deze assay lag (S3 Fig). Het maakte echter wel de beoordeling van de GPI-Cp-abundantie mogelijk. Bij deze methode werden cellen behandeld met fosfatidylinositol-specifiek fosfolipase C (PI-PLC), dat het GPI-anker splitst; het aldus geconditioneerde medium werd geconcentreerd en geanalyseerd met de Cp-ELISA. Hoewel deze benadering aantoonde dat PBT434 de hoeveelheid GPI-Cp in HepG2-cellen verhoogde, kon het opnieuw geen enkele Cp detecteren die door de PI-PLC was vrijgegeven (figuur 8B). ELISA bood ook een directe methode voor de kwantificering van ferritine. Om dit te doen, werd hBMVEC geladen met 1 uM Fe-citraat gedurende 24 uur, gevolgd door behandeling in de afwezigheid of aanwezigheid van PBT434 gedurende nog eens 1 uur. De resulterende cellysaten werden onderworpen aan ELISA-analyse voor ferritine (Fig. 8C). In tegenstelling tot de toename van TfR, deed de behandeling met PBT434 het ferritine (Ft) eiwit met ~18 procent afnemen. Dit verlies aan Ft-eiwit was inderdaad duidelijk na slechts 1 uur behandeling met het reagens. De tijdelijke aard van dit resultaat kan worden gecorreleerd met de hierboven vermelde toename van liefdadigheid Fe2 plus na een behandeling van 30 minuten met PBT434. Zoals later besproken, is de knockdown van ferritine aangetoond na behandeling met andere celdoorlatende Fe2 plus chelaatvormende middelen [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 plus}opname wordt geremd door complexvorming met PBT434

Gezien de snelle equilibratie van PBT434 in hBMVEC binnen 30 minuten, in vergelijking met de langzame, bifasische opname en equilibratie van Fe2 plus gedurende 24 uur [49], veronderstelden we dat PBT434 en Fe2 plus niet hetzelfde opnamemechanisme deelden. Om dit te testen, werden monolagen geïncubeerd met radioactief gemerkt 55Fe2 plus in de afwezigheid of aanwezigheid van PBT434 of PBT{10}}met, en de opname van 55Fe2 plus gedurende 3 uur werd gevolgd (figuur 9A). PBT434 verlaagde significant de snelheid van 55Fe2 plus opname, evenals verminderde de algehele accumulatie van 55Fe2 plus in cellysaten (Fig 9C). Dit effect werd niet gezien met PBT{21}}voldaan. Vergelijking van de opnamesnelheden van PBT434 en 55Fe geeft aan dat PBT434 en Fe2 plus worden opgenomen door afzonderlijke transportroutes. Bovendien suggereert de remming van 55Fe-opname in aanwezigheid van PBT434 maar niet{30}}met PBT dat een extracellulair PBT434-ijzercomplex geen ligand is voor de ferro-ijzertransporters in hBMVEC, namelijk ZIP8, en ZIP14.

Cistanche-supplementen

Om de rol van PBT434 bij de ijzeraccumulatie verder te onderzoeken, hebben we het effect getest dat de blootstelling vooraf had op de opname van 55Fe2 plus. Cellen voorbehandeld met PBT434 die na wassen werden blootgesteld aan 55Fe2 plus vertoonden een toename in de snelheid van opname en accumulatie van 55Fe2 plus na 3 uur (Fig. 9, panelen B en D). Deze verhoogde accumulatie hield gedurende ten minste 24 uur aan. Deze gegevens suggereren dat pre-blootstelling van cellen aan PBT434 tijdelijk de opname van ijzer versterkt. Onverwacht vertoonde PBT{14}}met-voorbehandeling ook een toename in zowel opname als accumulatie (figuur 9B), maar dit effect was niet zo significant of persistent als dat van PBT434.

We hebben aangetoond dat de opname van ijzer uit 59Fe-transferrine wordt ondersteund door ferri-reductie en ferro-permeatie bij het plasmamembraan van have [50, 51]. Een experimenteel resultaat ter ondersteuning van dit TBI-ijzeropnamemodel was de knockdown van deze opname door remming van extra-cytoplasmatische ferrireductase-activiteit; een ander resultaat was een remming van 60 procent van de TBI-ijzeropname door ferrozine, een sterke ferro-ijzerchelaatvormer [50]. Deze laatste strategie werd gebruikt om aan te tonen dat PBT434, maar niet PBT{10}}met, ook de TBI-ijzeropname remde (Fig 10).

5. PBT434 stimuleert Fpn-afhankelijk 55Fe2 plus efflux

PBT434 heeft ongeveer 20 procent van het vermogen van deferipron om een ​​schijnbare stimulatie van Fe2 plus efflux uit neuronale cellen te produceren [30]. We beoordeelden de uitstroom van 55Fe2 plus uit hBMVEC in de afwezigheid of aanwezigheid van PBT434 in controlecellen of cellen behandeld met een mini-hepcidine, PR73. Hepcidine is een peptidehormoon dat zowel systemisch als in het interstitium van de hersenen wordt aangetroffen, dat zich bindt aan Fpn en zich richt op de transporter voor afbraak. De effecten van hepcidine op de ijzerexportfunctie van Fpn zijn uitgebreid bestudeerd [52-54]. We hebben eerder aangetoond dat de efflux van Fe2 plus uit hBMVEC Fpn-afhankelijk is [35, 49]. PR73 heeft een EC50 van ~4 nM voor Fpn-afbraak in een GFP-reporterassay [55]. hBMVEC in monolagen werden geladen met 55Fe2 plus gedurende 24 uur in afwezigheid of aanwezigheid van PR73. 55Fe-efflux werd vervolgens gekwantificeerd over een periode van 5 uur in de aanhoudende afwezigheid of aanwezigheid van PR73 in combinatie met de afwezigheid en aanwezigheid van PBT434 (Fig. 11). Terwijl PR73 de 55Fe-efflux van zowel de controlekweek als de met PBT behandelde434-kweken onderdrukte, onderdrukte PBT434 gedeeltelijk de remming als gevolg van de mini-hepcidine. Bij afwezigheid van PBT434 werd de ijzeruitstroom uit de met PR73-behandelde culturen met ongeveer 75 procent onderdrukt, terwijl de knockdown in de434-met PBT behandelde culturen slechts met ongeveer 50 procent was (Afb. 11 en Tabel 2). Uit deze resultaten kunnen twee conclusies worden getrokken. Ten eerste reguleert de knockdown van Fpn door PR73 de 55Fe-efflux zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van PBT434. Ten tweede ondersteunt PBT434 onder beide omstandigheden een significante, zij het kleine stimulatie van de ijzeruitstroom.

Referenties

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Synthetische en natuurlijke ijzerchelatoren: therapeutisch potentieel en klinisch gebruik. Toekomstige Med Chem. 2009; 1(9):1643-70.

2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Nieuwe perspectieven in ijzerchelatietherapie voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten. Farmaceutica (Bazel). 2018; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Metaalchelatietherapie en de ziekte van Parkinson: een kritisch overzicht van de thermodynamica van complexe vorming tussen relevante metaalionen en veelbelovende of gevestigde medicijnen. Biomoleculen. 2019; 9(7).

4. Hedera P. Update over de klinische behandeling van de ziekte van Wilson. App Clin Genet. 2017; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Vergelijkende werkzaamheid en veiligheid van deferoxamine, deferipron en deferasirox bij ernstige thalassemie: een meta-analyse van 16 gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken. PLoS Een. 2013; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalytische metalen, ascorbaat en vrije radicalen: te vermijden combinaties. Straling Res. 1996; 145(5):532-41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oxidatieve stress: een sleutelmodulator bij neurodegeneratieve ziekten. Moleculen. 2019; 24(8).

8. Ashraf A, Clark M, dus PW. Het ouder worden van Iron Man. Front Aging Neurosci. 2018; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. R2 * mapping voor hersenijzer: associaties met cognitie bij normale veroudering. Neurobiol-veroudering. 2015; 36(2):925-32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. IJzer, hersenveroudering en neurodegeneratieve aandoeningen. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. Classificatie en moleculaire pathogenese van NBIA-syndromen. Eur J Pediatr Neurol. 2018; 22(2):272-84.

12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneratie met ijzeraccumulatie in de hersenen: update over pathogene mechanismen. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneratie met hersenijzeraccumulatiestoornissen: waardevolle modellen gericht op het begrijpen van de pathogenese van ijzerafzetting. Farmaceutica (Bazel). 2019; 12(1).

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegeneratie met hersenijzeraccumulatie: genetische diversiteit en pathofysiologische mechanismen. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegeneratie met ijzeraccumulatie in de hersenen: een overzicht. Iran J Kind Neurol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Stamcelmodellering van neuroferritinopathie onthult ijzer als een bepalende factor voor senescentie en ferroptose tijdens neuronale veroudering. Stamcelrapporten. 2019; 13(5):832-46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. IJzer en de ziekte van Alzheimer: van pathogenese tot therapeutische implicaties. Front Neurosci. 2018; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. De rol van ijzer in de ataxie van Friedreich: inzichten uit studies in menselijke weefsels en cellulaire en diermodellen. Front Neurosci. 2019; 13:75.

19. Puschmann A. Nieuwe genen die de erfelijke ziekte van Parkinson of parkinsonisme veroorzaken. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Gericht op het ijzermetabolisme bij het ontdekken en afleveren van geneesmiddelen. Nat Rev Drug Ontdekking. 2017; 16(6):400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Prevalentie van bloedarmoede bij personen van 65 jaar en ouder in de Verenigde Staten: bewijs voor een hoog percentage onverklaarde bloedarmoede. Bloed. 2004; 104 (8):2263-8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Behandeling met deferasirox, deferipron en desferrioxamine bij patiënten met thalassemie major: cardiale ijzer- en functievergelijking bepaald door kwantitatieve magnetische resonantiebeeldvorming. Hematologie. 2011; 96(1):41–7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferipron bij ataxie van Friedreich: een gerandomiseerde, gecontroleerde studie van 6-maanden. Ann Neurol. 2014; 76(4):509-21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Hersen-ijzerchelatie door deferipron in fase 2 gerandomiseerde dubbelblinde, placebogecontroleerde klinische studie bij de ziekte van Parkinson. Wetenschappelijk Rep. 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Gericht op chelaatijzer als therapeutische modaliteit bij de ziekte van Parkinson. Antioxide Redox-signaal. 2014; 21(2):195-210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Urinemetabolische profielen bij mensen en ratten van 1,2-dimethyl- en 1,2-diëthyl-gesubstitueerde 3-hydroxypyridine-4-onen. Geneesmiddelenmetabolisme en dispositie. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferipron: Pan-selectieve Histon Lysine Demethylase Remming Activiteit en Structuur Activiteit Relatie Studie. Wetenschappelijk Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Recente ontwikkelingen concentreerden zich op oraal actieve ijzerchelatoren. Thalassemie rapporten. 2014; 4 (2).

29. Kosman DJ. IJzermetabolisme in aeroben: beheer van ferri-ijzerhydrolyse en ferro-ijzerautoxidatie. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210-7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. De nieuwe verbinding PBT434 voorkomt door ijzer gemedieerde neurodegeneratie en alfa-synucleïne-toxiciteit in meerdere modellen van de ziekte van Parkinson. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, redacteuren. PBT434 behoudt dopaminerge neuronen, vermindert alfa-synucleïne-oligomerisatie en verbetert de motorische functie in een transgeen murine meervoudig systeematrofiemodel. Annalen van neurologie; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ, VS.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: van basismechanismen tot experimentele therapieën. Parkinsonisme gerelateerde stoornis. 2020; 73:94-104.

33. Dawson VL, Dawson TM. Veelbelovende ziektemodificerende therapieën voor de ziekte van Parkinson. Wetenschap Translationele Geneeskunde. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Vergelijkende studie van vier onsterfelijk gemaakte capillaire endotheliale cellijnen van menselijke hersenen, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 en BB19, en optimalisatie van kweekomstandigheden, voor een in vitro bloed-hersenbarrièremodel voor onderzoeken naar de permeabiliteit van geneesmiddelen. Vloeistoffen en barrières van het CZS. 2013; 10(1):33.

35. McCarthy RC, DJ Kosman. Gliacel ceruloplasmine en hepcidine reguleren differentieel de ijzeruitstroom van microvasculaire endotheelcellen in de hersenen. PLoS Een. 2014; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. De opgeloste dragers ZIP8 en ZIP14 reguleren de ophoping van mangaan in de microvasculaire endotheelcellen van de hersenen en regelen de mangaanniveaus in de hersenen. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197-208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Bacteriële invasie en transcytose in getransfecteerde microvasculaire endotheelcellen van de menselijke hersenen. Microbe Pathhog. 2001; 30(1):19–28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Een primeur in humane studie van PBT434, een nieuwe kleine molecuulremmer van -synucleïne-aggregatie (S4.001). Neurologie. 2019; 92(15 supplement):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Een fase 1-studie van PBT434, een nieuwe kleinmoleculaire remmer van -synucleïne-aggregatie, bij volwassen en oudere volwassen vrijwilligers (4871). Neurologie. 2020; 94(15 supplement):4871.

40. McCarthy RC, DJ Kosman. Activering van C6 glioblastomacel ceruloplasmine-expressie door naburige menselijke hersenendothelia-afgeleide interleukinen in een in vitro bloed-hersenbarrière modelsysteem. Celcommunicatie en signalering: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP moduleert de ijzeruitstroom van microvasculaire endotheelcellen in de hersenen door de ferro-ijzerexporteur ferroportine te stabiliseren. EMBO-rapporten. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: regulering van het ijzermetabolisme van zoogdieren. Cel. 2010; 142(1):24-38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD, Tan EK. IJzer regulerend eiwit (IRP)-ijzer-responsief element (IRE) signaalroute bij neurodegeneratieve ziekten bij de mens. Moleculaire neurodegeneratie. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Hersenijzermetabolisme en de verstoring ervan bij neurologische aandoeningen. J Neurale Transm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Een PCBP1-BolA2-chaperonnecomplex levert ijzer voor cytosolische [2Fe-2S]-clusterassemblage. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872-81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Rol van hypoxie-induceerbare factor-1 bij transcriptionele activering van ceruloplasmine door ijzertekort. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048-54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Eiwithydroxylering door hypoxie-induceerbare factor (HIF) hydroxylasen: uniek of alomtegenwoordig? Cellen. 2019; 8(5).

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Ferroportine-gemedieerde mobilisatie van ferritine-ijzer gaat vooraf aan de afbraak van ferritine door het proteasoom. Embo j. 2006; 25(22):5396-404.

49. McCarthy RC, DJ Kosman. Ferroportine en exocytoplasmatische ferroxidase-activiteit zijn vereist voor ijzerefflux van microvasculaire endotheelcellen in de hersenen. Het tijdschrift voor biologische chemie. 2013; 288(24):17932-40.

50. McCarthy RC, DJ Kosman. Mechanistische analyse van ijzeraccumulatie door endotheelcellen van de BBB. Biometalen. 2012; 25(4):665-75.

51. DJ Kosman. De telos van metallo-reductie en metallo-oxidatie in eukaryotische handel in ijzer en koper. Metallomica. 2018; 10(3):370-7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Structuur-functieanalyse van ferroportine definieert de bindingsplaats en een alternatief werkingsmechanisme van hepcidine. Bloed. 2018; 131(8):899-910.

53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidine en ijzerhomeostase. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823 (9): 1434-1443.

54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Hepcidine-geïnduceerde endocytose van ferroportine is afhankelijk van ferroportine-ubiquitinatie. Cel Metab. 2012; 15(6):918-24.

55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Thiol-gederivatiseerde minihepcidines behouden biologische activiteit. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763-6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Afdeling Biochemie, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York in Buffalo, Buffalo, NY, Verenigde Staten van Amerika