Deel 2: Interacties van ascorbinezuur, 5-caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside in aanwezigheid en afwezigheid van ijzer tijdens thermische verwerking en de invloed op antioxidantactiviteit

Voor meer informatie. contact:tina.xiang@wecistanche.com

Klik op de link om deel 1 details te leren:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Discussie

3.1.Structuur-activiteitsrelatie van ascorbinezuur, 5-caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside

Een eerste indicator van de AOA, gemeten voor verschillende stoffen, afhankelijk van de structuur-activiteitsrelatie, kwam voort uit het aantal functionele groepen. Bij vergelijking van alle drie de geanalyseerde stoffen had ascorbinezuur de laagste AOA, gevolgd door 5-caffeoylquininezuur, terwijlquercetine-3-rutinosidebereikte de hoogste AOA. Csepregi et al. [14] vond dezelfde volgorde bij het vergelijken van de AOA van deze drie verbindingen. Deze rangschikking kan worden verklaard door het totale aantal hydroxygroepen: quercetine-3-rutinoside heeft er tien, 5-caffeoylquininezuur heeft er vijf enascorbinezuurheeft er vier. Voorflavonoïden, werd de totale hoeveelheid hydroxygroepen en hun impact op de mechanismen van AOA eerder aangetoond door Burda en Oleszek [15]. Hydroxygroepen zijn bijzonder waardevol in enediolstructuren, omdat ze gemakkelijk kunnen oxideren tot diketonen [8]. In de geanalyseerde stoffen is ook de endiolstructuur van belang voor het kunnen vormen van complexen met metaalionen [16-18]. De endiolstructuur komt voor in quercetine-3-rutinoside- en 5-caffeoylquininezuurmoleculen in de fenylring, wat ook de sterkere AOA van deze verbindingen kan beïnvloeden. Verdere studies hebben aangetoond dat de AOA ook kan worden beïnvloed door andere molecuulstructuren. Fenolzuren worden mogelijk beïnvloed door de carbonzuurgroepen, bijvoorbeeld hydroxyfenylazijnzuur (R-CH=CH-COOH) is een zwakkere elektronenzuigende groep, vergeleken met hydroxykaneelzuur (R-CH,-COOH), zoals als cafeïnezuur in 5-caffeoylquininezuur [19]. In flavonoïden hadden aglyconen een hogere AOA dan de overeenkomstige glycosiden [20,21], in het geval van quercetine-3-rutinoside, een glycoside, de AOA van het aglyconquercetineis daardoor hoger [14]. Er zijn veel verschillende functionele groepen die de AOA kunnen beïnvloeden en daarom is het belangrijk om verschillende testassays te gebruiken met verschillende mechanismen, zoals single-electron transfer (SET), waterstofatoom transfer (HAT) en sequentieel protonverlies-elektron overdracht (SPLET) voor detectie. Elk mechanisme en zelfs het gebruikte testreagens kan verschillende structuren van bioactieve verbindingen detecteren [22].

3.2.Invloed van thermische verwerking en interactie van structureel verschillende antioxidanten op de antioxidantactiviteit in afwezigheid van het minerale ijzer

Stabiele AOA gedurende een langere tijd van 40 min thermische verwerking geeft aan dat thermische degradatie van minder belang is dan aanvankelijk werd verondersteld. Bovendien toonden HPLC-gegevens aan dat puur 5-caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside stabiel waren, met een maximale afbraak van 20 procent, tijdens thermische verwerking. Eerdere studies hebben de stabiliteit van 5-caffeoylquininezuur aangetoond tot het normale kookpunt van water [23], terwijl Dawidowicz en Typek[24] negen afgeleide verbindingen vonden na 5 uur verwarmen van 5-caffeoylquinic acid onder reflux. Voor de ascorbinezuurconcentratie werd een degradatie gevonden na 40 min koken. Beïnvloedende factoren, die leiden tot afbraak van ascorbinezuur zonder ijzer in een waterige oplossing, kunnen pH-waarden, blootstelling aan licht, oxidatie, temperatuur en verschillende concentraties zijn [25,26]. In deze studie speelden de factoren temperatuur en concentratie hoogstwaarschijnlijk de hoofdrol, aangezien oxidatieve processen tot een minimum werden beperkt door de minimale gasruimte in de microbuisjes. Het is mogelijk dat de resterende gasfase nog voldoende is voor afbraak onder aerobe omstandigheden. De verschillende omstandigheden resulteren in verschillende producten [27,28], dus in deze studie konden na 40 minuten koken producten van beide omstandigheden worden gevonden. Yuan en Chen [28] rapporteerden dat furfural, 2-furoïnezuur, 3-hydroxy-2-pyrron en een onbekende stof belangrijke afbraakproducten zijn van ascorbinezuur in een waterige oplossing, afhankelijk van de pH-waarde . Shinoda et al. [29,30] gevonden in sinaasappelsap de afbraakproducten furfural, 2-furoïnezuur, 5-hydroxymaltol, 3-hydroxy-2-pyrron en 5-(hydroxymethyl )furfural. Hsu et al. [31] analyseerde ascorbinezuur in ethanolische oplossingen en ontdekte 2-furoïnezuur en 3-hydroxy-2-pyrron. Afhankelijk van aerobe of anaërobe omstandigheden kunnen de gedetecteerde ascorbinezuurderivaten (pieken 3 en 4) furfural, 2-furoïnezuur of 3-hydroxy-2-pyrron of tussenproducten zijn. Het ascorbinezuur nam af in een dosis-responsrelatie, en hogere concentraties ascorbinezuur vertoonden lagere afbraakverhoudingen tijdens het koken. Ascorbinezuur lijkt zich in hogere concentraties te stabiliseren, vermoedelijk door waterstofbruggen en van de Waals-energie [32].

In binaire en ternaire mengsels werden vooral bijkomende effecten op AOA gevonden. Als in binaire mengsels de concentratie van de stof met een hogere AOA toenam, nam ook de AOA van hun combinatie toe. Andere studies vonden ook additieve effecten tussen (plus)-catechine (200 um) met ascorbinezuur (50-200 mg/L)[33], en tussen binaire mengsels van verschillende monoterpenen[34]. Alleen in de DPPH-assay werden antagonistische effecten gevonden in 5-caffeoylquininezuur gecombineerd met quercetine-3-rutinoside en in ternaire mengsels met verdubbelde quercetine-3-rutinoside-concentraties. Dit kan worden veroorzaakt door de oriëntatie van de moleculen in de ruimte, met name quercetine-3-rutinoside, als een vrij groot molecuul, en de sterische toegankelijkheid van het DPPH-radicaalmolecuul [35]. In de TPC-assay resulteerde de combinatie van ascorbinezuur en 5-caffeoylquininezuur in sterke antagonistische effecten in een verhouding van 1:2, terwijl omgekeerde mengsels met een verhouding van 2:1 tot sterke synergetische effecten leidden, die de som van de respectievelijke AOA's. Dubbele concentratie ascorbinezuur kan, onder deze omstandigheden, een extra boost geven aan AOA, vanwege zelfstabilisatie gevolgd door de stabilisatie van andere moleculen, aangetoond door 5-caffeoylquininezuur in dit experiment. In granaatappel-nectarinesap, tussen de natuurlijke fenolen en ascorbinezuur, werd dezelfde interactie gevonden, terwijl in druivensap toenemende antagonistische effecten werden waargenomen door toenemende ascorbinezuurconcentratie [36]. Deze resultaten suggereren dat mengsels van ascorbinezuur, 5-caffeoylquinine en quercetine-3-rutinoside het hoogste AOA-potentieel bereiken wanneer de krachtigsteantioxidantenzijn volop aanwezig.

Klik voor meer informatie over de producten:

3.3. Invloed van het mineraal ijzer

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>ascorbinezuur. De toevoeging van ijzer aan de mengsels had echter een invloed op de TEAC- en DPPH-assayresultaten, terwijl de TPC-assays grotendeels onaangetast waren. Om deze reden is het belangrijk om verschillende testassays met verschillende werkingsmechanismen te gebruiken bij het werken met ijzerrijke monsters.

Alleen in de DPPH-assay had de AOA van zuiver quercetine-3-rutinoside, en in combinatie met ascorbinezuur, equimolair of niet-equimolair met verdubbelde quercetine-3-rutinosideconcentraties, lagere waarden in aanwezigheid van ijzer. Boligon et al. [351 legde uit dat de DPPH-assay kleinere antioxidanten beter detecteert, vanwege de sterische toegankelijkheid van deze radicalen. Vermoedelijk kan quercetine-3-rutinoside met de twee bindingszijden vrij grote complexen met ijzer vormen en dus ontoegankelijk zijn voor de test. Zoals vermeld door Kejic et al. [8], zou dit kunnen worden verklaard door de vorming van supramoleculaire complexen via de coördinatie van metaalionen. In combinatie met ascorbinezuur, dat in staat is om gemengde valentiecomplexen te bouwen in een verhouding van 1:2 [12], kunnen deze grotere gemengde complexen vermoedelijk geen interactie aangaan met het DPPH-radicaal. In tegenstelling tot de resultaten in deze studie, vonden andere studies [18,37,38], door gebruik te maken van de DPPH-assay, dat quercetine-3-rutinosidecomplexen effectievere antioxidanten zijn dan pure quercetine-3-rutinoside. Het is bekend dat chelaatcomplexen van flavonoïden en metaalionen de radicale activiteit van gecomplexeerde metaalionen teniet kunnen doen [39]. Het enige verschil was dat in dit onderzoek ammoniumijzer(II)sulfaat werd gebruikt, in plaats van ijzer(ⅡI)chloride of sulfaat, gebruikt in het werk van Symonowics en Kolandek [39].

Er werden synergetische effecten gevonden tussen ascorbinezuur en 5-caffeoylquininezuur in aanwezigheid van ijzer in de 2:1-verhouding en antagonistische effecten in de 1:2-verhouding. De combinatie van 5-caffeoylquininezuur met ijzer werd in vivo niet aanbevolen [6]. Deze studie toonde echter aan dat in vitro de verdubbelde hoeveelheid ascorbinezuur in vergelijking met 5-caffeoylquininezuur zelfs synergetische effecten op AOA kan hebben. Nader onderzoek naar ratio's zou kunnen uitwijzen of ook in vivo positieve effecten bereikt kunnen worden.

Volgens de HPLC-gegevens zal het toevoegen van ijzer aan het monster een minimaal effect hebben op de katalytische activiteit, aangezien alleen de ascorbinezuurconcentratie in 0 min. gekookte monsters afnam. In de gekookte ascorbinezuurmonsters, in tegenstelling tot monsters zonder ijzer, leidden hogere ascorbinezuurconcentraties tot een hogere afbraakverhouding.5-Caffeovlquininezuur en quercetine-3-rutinoside hebben de aanvullende factoren temperatuur en tijd nodig, evenals interacties in mengsels, om de katalytische activiteit van ijzer te laten werken. Quercetine-3-rutinoside, in aanwezigheid van ijzer, nam alleen af ​​in binaire mengsels met ascorbinezuur na thermische verwerking. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de flavonoïde fungeert als een primaire antioxidant en vervolgens reageert het resulterende samengestelde radicaal met ascorbinezuur, waardoor de oorspronkelijke verbinding wordt geregenereerd [18]. 5-Caffeoylquininezuur lijkt speciaal te zijn, omdat het quercetine-3-rutinoside beschermt, terwijl ascorbinezuur quercetine-3-rutinoside niet kan beschermen. Daarom kan 5-caffeoylquininezuur het sleutelmolecuul zijn voor het stabiliseren van het systeem in combinatie met ijzer- en thermische verwerking. Deze hypothese van 5-caffeoylquininezuur als stabiliserend molecuul werd verder bevestigd in de ternaire mengsels. Hier werd quercetine-3-rutinoside altijd gestabiliseerd door 5-caffeoylquininezuur, zodat zelfs in aanwezigheid van ascorbinezuur geen verlaging van de quercetine-3-rutinosideconcentratie werd waargenomen. In een andere studie vertoonde 5-caffeoylquininezuur beschermende eigenschappen tegen de afbraak van anthocyanines via een co-pigmentatiemechanisme [40]. Van alle drie de stoffen zijn in aanwezigheid van ijzer nieuwe afbraakproducten ontstaan, met mogelijk hogere AOA. Cafeïnezuur (piek 6) werd geïdentificeerd als een 5-caffeoylquininezuurafbraakproduct (gegevens niet getoond). Dit leidde tot de veronderstelling dat de andere stof mogelijk kininezuur is of een van de negen mogelijke derivaten beschreven door Dawidowicz en Typek [24]: kininezuur;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihydroxyfenyl)-2-hydroxypropanoyl]-1,4,5-trihydroxycyclohexaancarbonzuur;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihydroxyfenyl)-3-hydroxypropanoyl]-1,4,5 trihydroxycyclohex-aancarbonzuur; trans 3-O-caffeoylquininezuur; trans 5-O-caffeoylquininezuur; trans 4-O-caffeoylquininezuur; cafeïne zuur; cis-5-O-caffeoylquininezuur;4,5-dicaffeoylquininezuur. Voor quercetine-3-rutinoside verschijnt een afbraakproduct in het chromatogram, dat niet kon worden geïdentificeerd.

3.4. Mogelijkheid om chelaten te vormen met ijzer (Fe3 plus) en ijzerhoudend ijzer (Fe2 plus)

In alle monsters die ascorbinezuur bevatten, werd ferri-ijzer gereduceerd tot ferro-ijzer. In dit proces,ascorbinezuurneemt een elektron van het ferri-ijzer en reduceert het tot ferro-ijzer, en wordt zelf een radicaal. Het onstabiele radicaal zet zich snel om in dehydroascorbinezuur en verdere afbraakproducten [12]. Door het ontbreken van hydroxyperoxide is een reactie terug naar ferri-ijzer via de Fenton-cyclus niet mogelijk. In 0 min. gekookte binaire mengsels was meer dan 20 procent van het ijzer gebonden in aanwezigheid van ascorbinezuur. Het is bekend dat ascorbinezuur complexen vormt met ijzersoorten en andere metaalionen door chelatie via de 3-O- en 2-O-kernen na waterstofverdringing uit de 3-OH en 2- OH-groepen [16,17,41. Het kan ook ijzer-ascorbaatcomplexen met gemengde valentie vormen [42]. Ascorbinezuur is echter een zwak chelaatvormer en na het koken werden alleen sporen van gebonden ijzer gedetecteerd in zuivere en gemengde monsters wanneer ascorbinezuur aanwezig was. Bovendien wordt ascorbinezuur door het kookproces afgebroken tot afbraakproducten, die niet in staat lijken te cheleren met ijzer.

5-Caffeoylquininezuur is een relatief slecht reductiemiddel. IJzerijzer werd verminderd door 5-caffeoylquininezuur, en bij langdurig koken nam de reductie toe.5-Caffeoylquininezuur chelaten met ferri-ijzer in een ligand naar metaal ladingsoverdracht [17].5-Caffeoylquininezuur draagt ​​een mogelijke bindingszijde aan de 3,4-endiolstructuur van het cafeïnezuur. Dit zou een aanwijzing kunnen zijn waarom cafeïnezuur het bioactieve deel is van 5-caffeoylquininezuur, terwijl kininezuur bijna geen AOA heeft [43]. Endiolen remden de OH-vorming door de vorming van een ijzercomplex [41] in een één-op-één verhouding [44,45]. Lamy et al. [46] concluderen dat 5-caffeoylquinic acid monomere complexen vormt, terwijl Kiss et al. [47] oligomere soorten gevonden. In tegenstelling tot eerdere studies [17,48] werden alleen sporen van gebonden ijzer gevonden in de aanwezigheid van 5-caffeoylquinic acid pre- en post-thermische verwerking. Dit kan worden verklaard door de neutrale pH-omstandigheden in deze studie, terwijl andere studies werkten in een zuur medium, gebaseerd op een pH-waarde van 1-2.5 in de menselijke maag [48]. Na enkele uren werd een zwart precipitaat gevonden in opgeslagen monsters, wat een indicator is van 5-caffeoylquinic acid-ferri-ijzercomplexen. Voor de analyse zijn recent mengmonsters gebruikt, waardoor de vorming van deze complexen bij een neutrale pH een langere tijd vergt. IJzercomplexen met cafeïnezuur vertoonden weinig wegvangende activiteit [49]. Verder is er geen spectrofotometrisch bewijs voor een reactie tussen kininezuur en ferri-ijzer [48]. In tegenstelling tot 5-caffeoylquininezuur werd in het quercetine-3-rutinoside-monster zelfs na thermische verwerking gebonden ijzer gevonden.

Quercetine-3-rutinoside reduceerde ferri-ijzer tot ferro-ijzer met een minimale toename bij een langere kooktijd. Deze matige reducerende activiteit van quercetine-3-rutinoside werd eerder beschreven door Mira et al. [50]. De ijzer-reducerende activiteit van quercetine-3-rutinoside werd gedetecteerd in 3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH [50]. De matige interactie met ferri-ijzer kan worden verklaard door een lager aantal -OH-groepen, wat resulteerde in een lagere negatieve ladingsdichtheid aan de chelatiekant [50]. Flavonoïden kunnen cheleren met metaalionen aan drie potentiële coördinatiekanten: (i) tussen 5-hydroxy- en 4-carbonylgroepen, (ii) tussen 3-hydroxy- en 4-carbonylgroepen, en (ii) tussen 3', A'-hydroxygroepen in Bring [39]. Quercetine-3-rutinoside gebruikt de bindingszijden (i) en (i)[9], en aan de 3-hydroxygroep is het rutinoside bevestigd. Spectrale gegevens toonden zelfs aan dat metaalionen alleen gebonden zijn aan de 3', A'-hydroxygroep [18]. Chelaten zijn effectiever met ijzer in zijn tweewaardige vorm [50]. In binaire mengsels kan quercetine-3-rutinoside geen complexen vormen wanneer ascorbinezuur aanwezig is, in tegenstelling tot ternaire mengsels. Als 5-caffeoylquininezuur aanwezig is, worden kleine hoeveelheden gebonden ijzer gevonden. Dit geeft aan dat 5-caffeoylquinic quercetine-3-rutinoside-moleculen beschermt in aanwezigheid van ascorbinezuur, zodat quercetine-3-rutinoside complexen kan vormen met ijzer.

4. Materialen en methoden

4.1.Chemische stoffen

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 procent), ferriammoniumsulfaatdodecahydraat en ferroammoniumsulfaathexahydraat werden gekocht bij Carl Roth (Karlsruhe, Duitsland).

4.2.Samples

Waterige oplossingen en mengsels van authentieke standaarden van ascorbinezuur, {{0}}caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside werden bereid als zuivere oplossingen en mengsels in verschillende verhoudingen. Alle mogelijke binaire mengsels werden gemaakt in equimolaire verhoudingen en niet-equimolaire verhoudingen met een verdubbelde verbinding. Ternaire mengsels werden ook bereid in equimolaire verhoudingen, evenals in niet-equimolaire verhoudingen met respectievelijk een of twee verdubbeling van de verbindingen. De eindconcentraties van de antioxidanten waren 0,3 mM voor elke testoplossing. Bovendien werden alle experimenten herhaald na toevoeging van 0,3 mM ijzer({{10}},15 mM ferro-ijzer en 0,15 mM ferri-ijzer) in totaal per mengsel. De gekozen hoeveelheden antioxidanten en ijzer zijn niet gebaseerd op fysiologische of voedselniveaus, ze zijn gebaseerd op molaire massa's om het effect van moleculaire interactie te bestuderen. Dientengevolge werd een equimolaire verhouding tussen totale antioxidanten en ijzer vastgesteld. Alle mengsels werden gedurende 0, 10, 20 en 40 minuten gekookt in kokend water en daarna afgekoeld op ijs om het verwarmingsproces te stoppen. Dit werd gedaan voor drie onafhankelijke replica's.

4.3.Fotometrische metingen

Antioxidanten(puur of gemengd) in de afwezigheid en aanwezigheid van ijzer werden gemeten op hun totale reducerende activiteit en antioxiderende activiteit in drie onafhankelijke technische replica's met behulp van een high-throughput-methode in 96-well-platen (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, VS). Er werden verschillende testassays gebruikt vanwege de verschillende reactiemechanismen: single-electron transfer (SET) en waterstofatoom transfer (HAT). Terwijl de TEAC- en TPC-test gebaseerd is op SET [17,18], is de literatuur voor de DPPH-testtest niet helemaal duidelijk of deze gebaseerd is op SET, HAT of zelfs een combinatie van deze twee mechanismen [{{6} }]. Een recente studie van Foti [51] ontdekte dat fenolen kunnen reageren met DPPH via sequentiële proton-loss elektronenoverdracht (SPLET), een combinatie van de twee mechanismen. Factoren, zoals gemiddelde polariteit en ionisatiepotentieel, beïnvloeden het overheersende mechanisme.

4.3.1. Totaal fenolgehalte (TPC)

Het totale fenolgehalte (TPC) werd bepaald met behulp van de Folin-Ciocalteu-methode in een 96-well-plaat, eerder beschreven door Bobo-Garcia et al. [52] met enkele aanpassingen.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0,99). De algemene naam van deze test is misleidend omdat het Folin-Ciocalteu-reagens ook reageert op niet-fenolische stoffen, zoals vitamines en mineralen [22]. Het beschrijft beter de "totale reducerende activiteit" van bioactieve verbindingen.

4.3.2. Trolox-equivalente antioxidantcapaciteit (TEAC)

De antioxidantactiviteit werd met enkele aanpassingen bepaald met behulp van de TEAC-assay in een 96-well-plaat. Een voorraadoplossing met 9,6 mg ABTS en 1,66 mg kaliumpersulfaat gevuld met H20 tot 25 ml werd bereid en 12-16 uur in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. Uit deze voorraadoplossing werd een TEAC-werkoplossing bereid, die een voorraadoplossing van 5 ml bevat die tot 25 ml was gevuld met 100 procent MeOH.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH * Radicale opruiming

Deantioxidantactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Synergisme en antagonisme

Voor analyse van synergetische en antagonistische effecten van de antioxidantactiviteit werd een vergelijking gemaakt van de experimenteel verkregen resultaten met de theoretische waarden berekend door de som van de effecten van individuele componenten bij de overeenkomstige concentratie [53]. Synergisme beschrijft een interactie van twee of meer stoffen, zodat de gecombineerde actie groter is dan de som van elk afzonderlijk. Daarentegen is antagonisme een fenomeen waarbij de interactie van twee of meer stoffen in combinatie een algemeen effect heeft dat kleiner is dan de som van hun individuele effecten.

4.5.Bepaling van ionisch ijzer

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0,99). Het verschil tussen totaal ijzer en ionisch ijzer, de som van ferro- en ferri-ijzer, is het gebonden ijzer.

4.6.HPLC-DAD

Om de antioxidanten ascorbinezuur, 5-caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside en afbraakproducten daarvan te kwantificeren in dezelfde extracten die worden gebruikt voor de fotometrische

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） werden voorbereid. Afgeleide verbindingen werden voorlopig geïdentificeerd door analyse van de zuivere standaarden in aanwezigheid en afwezigheid van pre- en postthermische ijzerverwerking. Daarom moet de nieuwe piek afkomstig zijn van de insert-standaard. Verder werden geselecteerde mengsels gemeten via HPLC-MS om de voorgestelde structuur te verifiëren.

4.7. Statistische analyse

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, VS) en R Statistics (versie 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) werden gebruikt voor biostatistiektests en het presenteren en tekenen van gegevensresultaten. Inferentiële statistieken voor het beoordelen en koppelen van behandelingen werden uitgevoerd met behulp van een drieweganalyse van variantie (ANOVA), een post-hoc Tukey's HSD-test en Pearson-correlatie. De gebruikte R-pakketten waren ggplot2 [55], mean [56] en multcomp [57].

5. Conclusies

Op basis van de hierboven beschreven bevindingen werd de AOA van ascorbinezuur, 5-caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside beïnvloed door hun molecuulstructuur, concentratie, verhouding en interacties met andere antioxidanten en ijzer. Interactie lijkt vooral een rol te spelen bij AOA bij het combineren van ascorbinezuur en 5-caffeoylquininezuur. Hier werden synergetische en antagonistische effecten gedetecteerd. De temperatuur had een minimale invloed op AOA, terwijl de temperatuur tegelijkertijd de stabiliteit van alle antioxidanten in bepaalde mengsels beïnvloedde, vooral in aanwezigheid van ijzer. Alleen de ascorbinezuurconcentratie nam af in afwezigheid van ijzer bij een langere kooktijd en de 5-caffeoylquininezuurconcentratie nam alleen af ​​in aanwezigheid van ijzer, terwijl de quercetine-3-rutinosideconcentratie alleen afnam in combinatie met ascorbinezuur in de aanwezigheid van ijzer. In combinatie met ijzer was 5-caffeoylquininezuur in staat om andere moleculen te beschermen tegen verminderde concentratie door thermische verwerking.

In planten zijn combinaties van ascorbinezuur, 5-caffeoylquininezuur en quercetine-3-rutinoside niet alleen mogelijk, maar gebruikelijk. Deze resultaten geven dus basiskennis over de processen die plaatsvinden tijdens het koken van groenten. Voedselmatrices zijn complexer en bevatten talloze bioactieve verbindingen, waaronder enzymen, andere mineralen of zuren, die de reactieomstandigheden veranderen of zelf reactanten zijn. Die complexe interacties vallen ver buiten het bestek van deze studie en gunstige concentraties en interacties vanantioxidantenin gekookte groenten moeten in de toekomst worden aangepakt.

Referenties

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Effect van cacao bij diabetes: het potentieel van de pancreas en lever als belangrijkste doelorganen, meer dan een antioxidanteffect? Int. J. Voedselwetenschap. technologie. 2016, 51, 829-841. [Kruisref]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenolen, polyfenolen en tannines: een overzicht. In-plant secundaire metabolieten: voorkomen, structuur en rol in het menselijke dieet; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, VS, 2006; blz. 1-24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Overgangsmetalen als katalysatoren van "autoxidatie" -reacties. Vrije Radicaal. Biol. Med. 1990, 8, 95-108. [Kruisref]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Effect van thermische verwerking op de flavonolen rutine en quercetine. Snelle gemeenschap. Massa spectrum. 2006, 20, 3229-3235. [Kruisref]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Baron, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramirez, J.; Lets, ik.; Tropper, E. IJzer Biologische beschikbaarheid bij mensen uit ontbijt verrijkt met ijzer-bis-glycinechelaat, fytaten en polyfenolen. J. Nutr. 2000, 130, 2195-2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD Remming van niet-Haem-ijzerabsorptie bij de mens door polyfenolhoudende dranken. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289-295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Antiradicale en chelerende effecten bij flavonoïde bescherming tegen door silica geïnduceerde celbeschadiging. Boog. Biochem. Biofysica. 1998, 355, 43-48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejik, Z.; Kaplanek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sýkora, D.; Martásek, P.; et al. IJzercomplexen van flavonoïden-antioxidantcapaciteit en meer. Int. J. Mol. Wetenschap. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Structuur-activiteitsrelaties Analyse van monomere en polymere polyfenolen (quercetine, rutine en catechine) verkregen door verschillende polymerisatiemethoden. Chem. Biodivers. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lu-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: een overzicht van extractie-, identificatie- en zuiveringsmethoden, biologische activiteiten en benaderingen om de biologische beschikbaarheid te verbeteren. Trends Voedselwetenschap. technologie. 2017, 67, 220-235. [Kruisref]